Auswirkungen von Deletionsmutationen im MBA1-Gen auf die submitochondriale Verteilung von

Der C-terminale Bereich des Mba1-Proteins ist im Vergleich zum N-Terminus deutlich länger (Abb. 4.13), weshalb weitere funktionale Mba1-Domänen höchstwahrscheinlich im C-Terminus zu finden sind. Deshalb wurden zunächst Mba1-Varianten erstellt, bei denen am Ende des C-Terminus Aminosäureabschnitte mit einer Länge von 55, 42, 26, 13 sowie 7 Aminosäuren deletiert wurden. Der

∆mba1-Stamm der YKODC wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert. Nach Erzeugung genetisch vergrößerter Mitochondrien wurden die Stämme auf Glukose bei 30 °C angezüchtet und konfokalmikroskopisch in vivo untersucht. Im Vergleich zu Mba1 weist jede der Mba1-Mutanten mit mehr als fünf deletierten C-terminalen Aminosäuren eine veränderte submitochondriale Lokalisation im Inneren der vergrößerten Mitochondrien auf (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurden im nächsten Schritt sechs Mba1-Varianten erzeugt, bei denen in Richtung des N-Terminus, vom C-terminalen Ende ausgehend, jeweils eine weitere Aminosäure entfernt wurde (Abb. 4.13). Für eine Voranalyse der submitochondrialen Verteilung dieser Mba1-Mutanten wurde der ∆mba1-Stamm (YKODC) mit den für diese Varianten kodierenden Plasmiden transformiert und unter Einsatz genetisch vergrößerter Mitochondrien mittels Konfokalmikroskopie in vivo untersucht.

Dabei wurde festgestellt, dass die drei aufeinanderfolgenden Mutanten Mba1 ^1-275, Mba1 ^1-274 und Mba1 ^1-273 unterschiedliche submitochondriale Lokalisationen aufweisen (Abb. 8.25 und Abb. 4.13).

Mba1 ^1-275-GFP zeigt eine klare Lokalisation am Rand der vergrößerten Mitochondrien, während Mba1 ^1-273-GFP deutlich in ihrem Inneren angereichert ist. Für Mba1 ^1-274-GFP konnte keine eindeutige Präferenz festgestellt werden. Überwiegend war eine intermediäre Lokalisation zu verzeichnen, aber in seltenen Fällen konnte auch eine randständige Lokalisation oder eine Anreicherung im Inneren der vergrößerten Mitochondrien beobachtet werden.

Abb. 4.13: Schematische Darstellung der erzeugten Mba1-Varianten mit C-terminalen Deletionen.

Abgebildet sind die verschiedenen Mba1-Varianten mit C-terminalen Deletionen, ihre Aminosäureanzahl sowie ihre bevorzugten Lokalisationen in genetisch vergrößerten Mitochondrien im ∆mba1-Stamm der YKODC (Vor-analyse). Mba1, Mba1 ^1-277, Mba1 ^1-276 und Mba1 ^1-275 lokalisieren am Rand, Mba1 ^1-274 intermediär und Mba1 ^1-273 sowie Mba1 ^1-272 im Inneren der vergrößerten Mitochondrien. Grüne Bereiche: aminoterminale Präsequenz.

Violette Bereiche: hydrophobe Aminosäureregionen.

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Da Mba1 ^1-275 und Mba1 ^1-273 während der Voranalyse eine eindeutige submitochondriale Lokalisation zugeordnet werden konnte, wurden diese Varianten für weitere Untersuchungen ausgewählt. Zuvor wurde jedoch mit Hilfe der Epifluoreszenzmikroskopie in vivo untersucht, ob die Expression der Genvarianten mba1 ^1-275 und mba1 ^1-273 einen Einfluss auf die mitochondriale Morphologie oder das Membranpotential ausübt. Hierfür wurden die GFP- bzw. FLAG-Fusionskonstrukt exprimierenden

∆mba1-Stämme (BY4741) in Galaktosemedium bei 30 °C angezogen.

Mit Hilfe des MitoTracker Red CM-H2XRos konnte nachgewiesen werden, dass auch unter dem Einfluss der Expression von mba1 ^1-275-GFP bzw. mba1 ^1-273-GFP (Abb. 8.23) sowie mba1 ^1-275-FLAG bzw. mba1 ^1-273-FLAG (Abb. 8.24) ein Membranpotential vorhanden ist und es sich demzufolge um respiratorisch aktive Mitochondrien handelt. Außerdem kann ein ausgeprägtes mitochondriales Netz-werk beobachtet werden. Bei der Expression von mba1 ^1-273-GFP fällt nur auf, dass neben dem Netz-werk auch punktförmige Stellen mit einem stärkeren GFP-Fluoreszenzsignal sichtbar sind (Abb. 8.23, mitte), deren Ursprung und Bedeutung ungeklärt sind.

Im Anschluss wurde die Verteilung von Mba1 ^1-275-GFP und die von Mba1 ^1-273-GFP sowohl im

∆mba1-Stamm (BY4741) als auch im QCR2-mRFP-Stamm (BY4741) in vergrößerten Mitochondrien unter fermentativen Bedingungen mittels in vivo-Konfokalmikroskopie analysiert.

Bei Wachstum mit Glukose lokalisiert Mba1 ^1-275-GFP bevorzugt am Rand der vergrößerten Mito-chondrien (Abb. 4.14, A und B, oben), während Mba1 ^1-273-GFP (Abb. 4.14, A und B, unten) und Qcr2-mRFP (Abb. 4.14, B) im Inneren angereichert sind. Die im ∆mba1-Stamm der YKODC gewonnenen Erkenntnisse bezüglich der submitochondrialen Lokalisationen von Mba1 ^1-275-GFP und Mba1 ^1-273-GFP wurden in vollem Umfang bestätigt. Auch für die anderen Mba1-Varianten mit C-terminalen Deletionen konnten die in der Voranalyse beobachteten Proteinverteilungen ebenfalls mit Hilfe des QCR2-mRFP-Stamms (BY4741) gezeigt werden (Abb. 8.26).

Die konfokalmikroskopischen Daten deuten darauf hin, dass die mutierte Variante Mba1 ^1-273 im Gegensatz zu Mba1 (siehe Kapitel 4.2.2 und 4.3.3.4) präferentiell in der Cristaemembran angereichert ist. Deshalb wurden als Nächstes die submitochondrialen Lokalisationen von Mba1 ^1-273-GFP und Mba1 ^1-273-FLAG in ∆mba1-Hefen (BY4741) bei Wachstum mit Galaktose und bei 30 °C mit Hilfe der Elektronenmikroskopie untersucht. Die Fusionsproteine wurden durch eine immunologische Markierung mit Goldpartikeln nachgewiesen.

Bei der Beurteilung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen fällt auf, dass neben Mitochondrien mit Wildtypmorphologie (Abb. 4.15, A und B) auch Mitochondrien mit Strukturen mit einer ver-änderten Elektronendichte zu beobachten sind (Abb. 4.15, C und D). Dabei handelt es sich vermutlich um Proteinaggregationen, die durch die Expression von mba1 ^1-273 verursacht werden.

Für die statistische Auswertung der submitochondrialen Verteilung der Mba1 ^1-273-Fusionsproteine wurden ausschließlich elektronenmikroskopische Aufnahmen verwendet, auf denen Mitochondrien mit Wildtypmorphologie abgebildet sind (Abb. 4.15, A und B).

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Abb. 4.14: Konfokalmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1 ^1-275-GFP und Mba1 ^1-273-GFP in vergrößerten Mitochondrien unter fermentativen Wachstumsbedingungen.

∆mba1-Hefen (BY4741) (A) bzw. QCR2-mRFP-Hefen (BY4741) (B), welche jeweils eine MBA1-GFP-Variante vom Plasmid exprimierten, wurden auf Glukoseplatten bei 30 °C kultiviert. Mba1 ^1-275-GFP lokalisiert am Rand (oben in A, B) und Mba1 ^1-273-GFP (unten in A, B) sowie Qcr2-mRFP (B) im Inneren der vergrößerten Mitochon-drien. Von links nach rechts sind jeweils das Hellfeldbild (A, B), das Fluoreszenzbild für GFP (A, B) und mRFP (B), eine Überlagerung der Fluoreszenzsignale (B) und ein Intensitätsprofil der Fluoreszenzsignale (A, B) dargestellt. Weißer Kasten: für die Intensitätsprofilerstellung verwendeter Bereich. Größenstandard = 2 µm.

Nach einer Auswertung von 84 Goldpartikeln ergibt sich für Mba1 ^1-273-GFP eine Verteilung von 36 % in der inneren Grenzflächenmembran gegenüber 64 % in der Cristaemembran (Abb. 4.15, A). Für Mba1 ^1-273-FLAG wurden 59 Goldpartikel ausgewertet, von denen 22 % der inneren Grenzflächen-membran und 78 % der CristaeGrenzflächen-membran zuzuordnen sind (Abb. 4.15, B). Somit liegt sowohl für Mba1 ^1-273-GFP als auch Mba1 ^1-273-FLAG bei Wachstum mit Galaktose bei 30 °C eine deutliche Anreicherung in der Cristaemembran vor.

Des Weiteren wurde die Häufigkeit der Mitochondrien, die Proteinaggregationsstrukturen enthalten, im Vergleich zu den Mitochondrien mit Wildtypmorphologie bestimmt. Betrachtet man die Ergebnisse dieser statistischen Auswertung, so ist festzuhalten, dass der prozentuale Anteil an Mitochondrien mit Aggregaten bei der Expression von mba1 ^1-273-FLAG (Abb. 4.15, D) deutlich geringer ist als bei der von mba1 ^1-273-GFP (Abb. 4.15, C). Es wäre denkbar, dass sich die Fusionierung mit GFP oder dem

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FLAG-Peptid auf die Stabilität oder Struktur von Mba1 ^1-273 auswirkt, wobei GFP anscheinend einen stärkeren Effekt als das FLAG-Peptid hat. Um zu überprüfen, ob es sich bei der in diesem Kapitel dokumentierten Verteilung von Mba1 ^1-273 um eine, auf der C-terminalen Markierung beruhende, verfälschte Anreicherung in der Cristaemembran handelt, die zum Beispiel durch eine Reduzierung der Proteinstabilität oder der Membranständigkeit verursacht wurde, wurden die Mba1 ^1-273 -Fusions-proteine im Folgenden proteinbiochemisch untersucht.

Abb. 4.15: Elektronenmikroskopische Lokalisationsanalyse von Mba1 ^1-273-GFP und Mba1 ^1-273-FLAG in Mitochondrien mit Wildtypmorphologie unter fermentativen Wachstumsbedingungen.

Der ∆mba1-Stamm (BY4741) mit mba1 ^1-273-GFP- (A, C) bzw. mit mba1 ^1-273-FLAG-Plasmid (B, D) wurde in Galaktosemedium bei 30 °C kultiviert. In Mitochondrien mit Wildtypmorphologie sind Mba1 ^1-273-GFP (A) und Mba1 ^1-273-FLAG (B) in der CM angereichert. Es ist eine statistische Auswertung der Fusionsproteinverteilung (links in A, B) sowie eine repräsentative Aufnahme (rechts in A, B) dargestellt. Zum Nachweis wurden die Fusionsproteine immunologisch mit Goldpartikeln markiert (Pfeile). Außerdem sind Mitochondrien mit Aggregaten abgebildet (gestrichelte Rahmung in C, D) sowie eine statistische Auswertung ihrer Häufigkeit (links in C, D) und eine repräsentative Aufnahme (rechts in C, D). IGM (innere Grenzflächenmembran); CM (Cristaemembran);

IM (Innenmembran) und AM (Außenmembran). Größenstandard = 100 nm.

4.3.4.2 Stabilität, mitochondriale Lokalisation, Orientierung und