SILAC-basierte LC-MS/MS-Analyse von Oxa1-Komplexen

Zur Untersuchung der Oxa1-enthaltenden Komplexe auf mögliche weitere Komponenten wurden zwei voneinander unabhängige SILAC-basierte LC-MS/MS-Analysen, die Vorwärts- und die Rückwärts-analyse, in Zusammenarbeit mit Dr. Nikolov und Frau Raabe (Arbeitsgruppe „Bioanalytische Massen-spektrometrie“, Prof. Dr. Urlaub, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen, Deutschland) durchgeführt. Sowohl für die Vorwärts- als auch die Rückwärtsanalyse wurden Mito-chondrien aus in Galaktosemedium bei 30 °C gewachsenen Hefestämmen isoliert. Im Zuge der Vorwärtsanalyse wurde der ∆oxa1-Stamm (für SILAC) mit OXA1-FLAG-Plasmid in Medium mit leichten Aminosäuren und der ∆oxa1-Stamm (für SILAC) mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid in Medium mit schweren Aminosäuren angezogen. Für die Rückwärtsanalyse erfolgte die Kultivierung dann umgekehrt. Die isolierten Mitochondrien wurden mit 1 % (w/v) Digitonin solubilisiert und für eine Koimmunopräzipitation eingesetzt, die auf der Verwendung von FLAG-Antikörper gekoppelter Agarose beruhte. Die eluierten Proteine wurden für die Vorwärts- bzw die Rückwärtsanalyse so gemischt, dass die Zielproteine Oxa1-FLAG und Oxa1-W128F-FLAG in gleicher Menge zueinander vorlagen. Die Auftrennung der Gemische erfolgte mittels SDS-PAGE. Nachdem das SDS-Polyacryl-amidgel mit Coomassie angefärbt wurde, wurde jede Gelspur in 23 Stücke gleicher Größe geschnitten.

Die separierten Proteine wurden im Gel mittels Trypsin verdaut und die tryptischen Peptide mit LC-MS/MS untersucht. Die Rohdaten der zwei LC-MS/MS-Analysen wurden mit dem Programm

82

MaxQuant unter Zuhilfenahme der UniProt-Proteindatenbank für S. cerevisiae prozessiert und nach Nikolov et al. in die Software R importiert (Abb. 4.4, A) (Nikolov et al., 2011). Abschließend wurden die normalisierten Werte der Intensitätsverhältnisse von schwer markiertem Peptid (S) zu leicht markiertem Peptid (L) der Vorwärts- und der Rückwärtsanalyse in einem Streudiagramm gegen-einander aufgetragen. Alle Proteine mit einem Intensitätsverhältniswert (S/L) der Vorwärts- bzw. der Rückwärtsanalyse, der kleiner als der festgelegte Schwellenwert +/- 1 ist, werden dem Hintergrund zugeordnet. Diese Proteine sind weder in der Oxa1-FLAG- noch in der Oxa1-W128F-FLAG-Probe angereichert (Abb. 4.4, B).

Abb. 4.4: Einfluss der Substitutionsmutation oxa1-W128F auf Oxa1-Komplexe und Oxa1-Interaktionen.

(A) Darstellung der SILAC-basierten LC-MS/MS-Analysen von Oxa1-Komplexen und Oxa1-Interaktionen, für welche die ∆oxa1-Stämme (für SILAC) mit OXA1-FLAG- bzw. oxa1-W128F-FLAG-Plasmid verwendet wurden.

(B) Das Streudiagramm zeigt die Korrelation der normalisierten Werte der Intensitätsverhältnisse (S/L) von schwer markiertem (S) zu leicht markiertem Peptid (L) der Vorwärts- (VA) und Rückwärtsanalyse (RA). Roter Punkt: mit Oxa1-FLAG angereichertes Oxa1-Protein (wahrer Treffer). Blaue Punkte: mit Oxa1-W128F-FLAG angereicherte Proteine (unspezifische Treffer). Graue Punkte: falsch-positive Treffer oder Hintergrundproteine.

Vorwärtsanalyse, VA: FLAG (L), W128F-FLAG (S); Rückwärtsanalyse, RA: FLAG (S), Oxa1-W128F-FLAG (L). Die normalisierten Werte der Intensitätsverhältnisse (S/L) der VA wurden für die grafische Darstellung invertiert, so dass sie den numerischen Werten der RA entsprechen.

Das Streudiagramm ist in vier Quadranten aufgeteilt, wobei der Quadrant oben links sowie der unten rechts neben Hintergrundproteinen auch falsch-positive Proteintreffer zeigt (Abb. 4.4, B). Diese Proteine weisen zwar einen Intensitätsverhältniswert (S/L) größer +/- 1 auf, jedoch keine spezifische Anreicherung mit einem der beiden Oxa1-Zielproteine. Sie liegen sowohl in der Vorwärts- als auch

83

der Rückwärtsanalyse stets in der leichten oder der schweren Probe vor (siehe Streudiagramme der Vorwärts- bzw. Rückwärtsanalyse in Abb. 8.16 und Abb. 8.17).

Im unteren linken Quadranten sind die Proteintreffer dargestellt, für die sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtsanalyse eine Anreicherung in der Oxa1-W128F-FLAG-Probe zu verzeichnen ist (Abb. 4.4, B; blaue Punkte). Da jedoch ausschließlich nicht-mitochondriale Proteine, wie zum Beispiel das Kernporenprotein Nup145, identifiziert wurden, wird angenommen, dass es sich bei diesen Proteinen um Verunreinigungen und demzufolge nicht um echte Interaktionspartner von Oxa1-W128F-FLAG handelt.

Im oberen rechten Quadranten ist der einzige echte Proteintreffer dieser Untersuchung abgebildet (Abb. 4.4, B; roter Punkt). Es handelt sich dabei um Oxa1 selbst, welches sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtsanalyse in der Oxa1-FLAG-Probe angereichert ist. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass FLAG-Proteine effizienter aneinander binden, d. h. oligomerisieren, als Oxa1-W128F-FLAG-Proteine. Dieses Resultat konnte in drei voneinander unabhängigen Versuchen, die jeweils aus einer Vorwärts- sowie einer Rückwärtsanalyse bestanden, reproduziert werden.

Mit Hilfe der SILAC-basierten LC-MS/MS-Analysen konnten neben Oxa1 selbst keine weiteren Interaktionspartner identifiziert werden, was zum Beispiel auf die Tatsache zurückgeführt werden kann, dass Oxa1 nur sehr transiente und nicht-stabile Proteinbindungen eingeht und womöglich haupt-sächlich als Homooligomer fungiert. Des Weiteren unterstützen diese Daten das Ergebnis der BN-PAGE (Abb. 4.2). Die kleineren Oxa1-W128F-Komplexe stehen möglicherweise mit einer Beein-trächtigung der Oligomerisierung von Oxa1-W128F-Proteinen in Zusammenhang.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass Oxa1 eine heterogene submitochondriale Verteilung auf-weist, die nicht nur von den Wachstumsbedingungen abhängig ist, sondern auch gezielt durch Einfüh-rung der Mutation oxa1-W128F verschoben werden kann (Stoldt, 2010; Stoldt et al., 2012).

Die Annahme, dass die dynamische, von der Kohlenstoffquelle abhängige, Verlagerung der Oxa1-Verteilung mit einer Veränderung der Oxa1-Komplexgrößen in Verbindung steht, konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Sowohl die Größen der Oxa1-Komplexe, die durch Wachstum mit Galaktose präferiert in der inneren Grenzflächenmembran lokalisieren, als auch die Größen der Oxa1-Komplexe, die durch Wachstum mit Laktat in der Cristaemembran angereichert sind, liegen zwischen 150 kDa und 600 kDa, während sich die Größen der Oxa1-W128F-enthaltenden Komplexe in einem Bereich von 80 kDa bis 450 kDa erstrecken. Zusammen mit den aus der Literatur bekannten Daten bezüglich der Oxa1-Komplexgrößen (Nargang et al., 2002; Reif et al., 2005; Kohler et al., 2009;

Krüger et al., 2012) deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass es sich bei den beobachteten Komplexen mit einer Größe von etwa 80 kDa um Oxa1-Dimere und bei denen mit einer Größe von ca. 160 kDa um Oxa1-Tetramere handeln könnte. Demzufolge bildet Oxa1-W128F wahrscheinlich vorwiegend Dimere oder Tetramere aus, während Oxa1 sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen mindestens als Tetramer vorzuliegen scheint.

84

Des Weiteren sollte im Rahmen dieser Arbeit geklärt werden, ob Oxa1 neben anderen Oxa1-Proteinen auch mit weiteren Proteinen interagiert. Mit Hilfe der SILAC-basierten Interaktionsstudie konnten jedoch, neben Oxa1 selbst, keine weiteren Bindungspartner von Oxa1 identifiziert werden. Daraus lässt sich schließen, dass Oxa1 keine stabilen Komplexe mit weiteren Proteinen bildet. Möglicher-weise agiert Oxa1 hauptsächlich in Form von größeren Homooligomeren. Diese Annahme wird sowohl durch die Daten der BN-PAGE als auch durch das Ergebnis der SILAC-basierten Interaktions-studie unterstützt. Es wurde beobachtet, dass Oxa1-W128F-Proteine im Vergleich zu Oxa1 Proteinen nur mit einer verminderten Effizienz aneinander binden. Es wäre denkbar, dass es infolge der Mutation oxa1-W128F zu einer Strukturveränderung des Oxa1-Proteins kommt, welche die Bildung von größeren Oxa1-W128F-Oligomeren stört und so zu den beobachteten verringerten Größen von W128F-enthaltenden Komplexen führt, die mit den Größen von Dimeren und Oxa1-Tetrameren übereinstimmen.

Aus der Literatur ist bekannt, dass es neben Oxa1 noch weitere Innenmembranproteine gibt, die eine ähnliche Rolle bei der Biogenese der Mitochondrien einnehmen (He & Fox, 1999; Souza et al., 2000;

Broadley et al., 2001; Preuss et al., 2001; Frazier et al., 2006). Da für Oxa1 ein dynamisches Lokali-sationsverhalten nachgewiesen wurde, welches komplexen Regulationsmechanismen zu unterliegen scheint (Stoldt, 2010; Stoldt et al., 2012; diese Arbeit), stellt sich die Frage, ob auch andere an der Proteininsertion beteiligte Komponenten eine dynamisch regulierte Verteilung in der inneren mito-chondrialen Membran, wie Oxa1, aufweisen.

4.2 Submitochondriale Verteilung von an der