3.4.1 Standardmäßige Kultivierung von S. cerevisiae-Zellen
Die Kultivierung von S. cerevisiae-Zellen fand typischerweise bei 30 °C statt, aber die Wachstums-temperatur wurde stets den Analysen entsprechend angepasst. Die Anzucht erfolgte entweder auf den für Hefe spezifischen Agarplatten im Brutschrank (Modell Function Line; Heraeus, Hanau, Deutsch-land) oder in flüssigen Hefemedien bei 150 Upm im Schüttelinkubator (Modell Innova 44;
New Brunswick Scientific, Nürtingen, Deutschland). Für die Herstellung von Dauerkulturen der erzeugten Hefestämme wurden 500 µl einer Flüssigkultur mit 600 µl sterilem Glyzerin (80 % (v/v)) versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C aufbewahrt.
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3.4.2 Kultivierung von S. cerevisiae-Zellen für SILAC
SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture) ist eine Methode der Zellkulti-vierung, die in Verbindung mit einer massenspektrometrischen Analyse (siehe Kapitel 3.8) einen quantitativen Vergleich der Proteome zweier Proben ermöglicht (de Godoy et al., 2006; Ong & Mann, 2006). Dazu werden zwei zu vergleichende Zellkulturen parallel kultiviert, wobei die erste Kultur in einem Medium mit normalen „leichten“ Aminosäuren und die zweite Kultur in einem Medium mit
„schweren“ Aminosäuren inkubiert wird. Bei diesen handelt es sich typischerweise um schwere, aber nicht-radioaktive Varianten der beiden Aminosäuren Arginin und Lysin, die sich sehr gut für die Massenspektrometrie eignen, da die in der Probenvorbereitung eingesetzte Protease Trypsin stets hinter diesen Aminosäuren schneidet (siehe Kapitel 3.8.1). Somit wird sichergestellt, dass nur Peptide entstehen, die mindestens einmal mit „leichten“ bzw. „schweren“ Isotopen markiert sind. Durch den Einbau der schweren Aminosäuren in die Proteine kommt es im Vergleich zu den normalen Amino-säuren zu einer bekannten Gewichtsveränderung der Peptide, die nach Mischen der beiden zu ver-gleichenden Proteinproben mit Hilfe eines Massenspektrometers detektiert (siehe Kapitel 3.8.3) und mit entsprechender Software quantifiziert werden kann (siehe Kapitel 3.8.4.1).
In dieser Arbeit wurden für die SILAC-basierten Analysen ausschließlich Hefestämme verwendet, die in ihrem Genom eine Deletion von ARG4 sowie LYS2 trugen, so dass die Aminosäuren Arginin und Lysin stets aus dem Medium aufgenommen werden mussten. Im Fall der schweren Aminosäure-varianten wurde so bereits nach 5 - 6 Zellteilungszyklen eine fast vollständige Markierung aller neu synthetisierten Proteine mit schweren Isotopen gewährleistet.
Die im Rahmen dieser Arbeit zu vergleichenden Hefestämme trugen neben einer genomischen Deletion von OXA1, ARG4 und LYS2 ein Plasmid, das entweder für OXA1-FLAG oder oxa1-W128F-FLAG kodierte, und wurden parallel in den für SILAC spezifischen Flüssigmedien (siehe Kapitel 3.1.7.2) bei 30 °C in einem Schüttelinkubator kultiviert. Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, wurden jeweils zwei voneinander unabhängige Analysen durchgeführt. So wurde für die Vorwärtsanalyse (VA) der ∆oxa1-Stamm (für SILAC) mit OXA1-FLAG-Plasmid in Medium inkubiert, das leicht markiertes Arginin sowie Lysin beinhaltete, und der ∆oxa1-Stamm (für SILAC) mit oxa1-W128F-FLAG-Plasmid in Medium, das Arginin und Lysin enthielt, die mit schweren Kohlenstoff- und Stickstoffisotopen markiert waren. In der Rückwärtsanalyse (RA) erfolgte die Kultivierung dann umgekehrt. Nachdem die Hefestämme eine OD600 von ~ 2 erreicht hatten, wurden ihre Mitochondrien präpariert (siehe Kapitel 3.5.2) und für Koimmunopräzipitationen (siehe Kapitel 3.5.7.1) eingesetzt. In der nachfolgenden massenspektrometrischen Analyse (siehe Kapitel 3.8) konnten die Peptide der OXA1-FLAG exprimierenden Hefezellen schließlich quantitativ mit denen der oxa1-W128F-FLAG exprimierenden Hefen verglichen werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl jede basierte Vorwärtsanalyse als auch jede SILAC-basierte Rückwärtsanalyse dreimal durchgeführt.
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3.4.3 Elektrotransformation von S. cerevisiae-Zellen
Für die Transformation mittels Elektroporation wurden die S. cerevisiae-Zellen in 50 ml flüssigem Glukosemedium bei 30 °C geschüttelt bis sie die logarithmische Wachstumsphase (OD600 0,8 - 1,2) erreicht hatten. Dieser Zeitpunkt wurde mit der Messung der optischen Dichte mit Hilfe eines Photometers (Modell BioPhotometer; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) ermittelt.
Für die stabile Integration von DNS-Fragmenten in das Hefe-Genom (siehe Kapitel 3.4.4) mussten die Zellen mit Lithiumacetatlösung (100 mM Lithiumacetat; 10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 7,5) vorbehandelt werden (Becker & Guarente, 1991), was bei der Transformation mit Plasmiden (Tab. 3.7) entfällt. Für die Lithiumacetat-Behandlung wurden die Hefezellen für 3 min bei 1600 x g und RT sedimentiert (Modell Heraeus Megafuge 16; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und in 8,5 ml Lithiumacetatlösung aufgenommen, woraufhin eine 45-minütige Inkubation bei 30 °C unter Schütteln folgte. Anschließend wurden sie mit 210 µl 1 M DTT versetzt und für weitere 15 min bei 30 °C schüttelnd inkubiert. Nachdem die Zellen dreimal mit eiskaltem sterilem Wasser und einmal mit einer eiskalten sterilen 1 M Sorbitollösung gewaschen wurden, wurden sie in 200 µl 1 M Sorbitol resuspendiert. Pro Transformation wurden 40 µl der elektrokompetenten S. cerevisiae-Zellen vorsichtig mit 2 µl Plasmid-DNS oder 5 µl PCR-Produkt vermischt, in eine vorgekühlte Elektro-porationsküvette überführt und für 5 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgte unter Verwendung des Elektroporators Gene Pulser II (BioRad, München, Deutschland) mit folgenden Einstellungen: 1,5 kV, 25 µF, 200 Ω. Unmittelbar nach der Elektroporation wurde der Transfor-mationsansatz mit 1 ml 1 M Sorbitol versetzt.
Zur spezifischen Selektion auf erfolgreich mit Plasmid-DNS transformierte Hefezellen wurde der gesamte Transformationsansatz sofort nach der Elektroporation auf den dem Markergen (zum Beispiel URA3) entsprechenden Selektionsagarplatten (siehe Kapitel 3.1.7.1) ausplattiert.
Für die Ausbildung einer Antibiotika-Resistenz, die bei einer stabilen DNS-Integration in das Hefe-Genom (siehe Kapitel 3.4.4) notwendig war, wurden dem Transformationsansatz noch 3 ml YP-Glukosemedium hinzugefügt und die transformierten Zellen für 4 h bei 30 °C im Inkubator geschüttelt. Danach wurde der gesamte Ansatz auf Agarplatten mit dem der Resistenzkassette entsprechenden Antibiotikum (z. B. G418 bei der kanMX4-Kassette) ausplattiert und bei 30 °C im Brutschrank für 4 Tage inkubiert, bis sich Einzelkolonien für weitere Analysen ausgebildet hatten.
3.4.4 Gerichtete Integration von DNS in das Hefe-Genom
Um Gene im Genom von S. cerevisiae spezifisch zu deletieren (Hegemann et al., 2006) wurde eine zu integrierende DNS-Sequenz mittels PCR (siehe Kapitel 3.2.1) entweder auf isolierter genomischer Hefe-DNS (siehe Kapitel 3.4.5) oder auf einem Plasmid (Tab. 3.7) amplifiziert. Dabei wurde darauf geachtet, dass das PCR-Produkt an seinem 5„- und 3„-Ende jeweils eine Sequenz enthielt, die 200 - 400 Basenpaare lang war und zu je einer der beiden das Zielgen flankierenden Regionen
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homolog war, da für die stabile Integration von DNS-Sequenzen in das Hefe-Genom die natürlich vorkommende homologe Rekombination (Szostak et al., 1983; Rothstein, 1984) genutzt wurde. Um den Erfolg der Integration in das Zielgenom zu überprüfen, wurde eine Resistenzkassette (kanMX4 oder natMX) zur Transformantenselektion in das PCR-Produkt eingefügt.
Das Plasmid pCR2.1-TOPO-MDM10-Knockout (Tab. 3.7) diente als PCR-Matrize für die Deletion von MDM10. Das dafür amplifizierte PCR-Produkt enthielt die natMX-Resistenzkassette und zu den beiden Bereichen, die das MDM10-Gen flankieren, homologe Sequenzen, wodurch eine vollständige Entfernung von MDM10 aus dem Zielgenom sichergestellt wurde.
Zur Deletion von MBA1 im Wildtypstamm BY4741 WT wurde als PCR-Matrize die isolierte genomische DNS des Δmba1-Stammes der YKODC verwendet, welcher an Stelle des MBA1-Gens die kanMX4-Resistenzkassette trägt. Da das hergestellte PCR-Produkt zu den MBA1-Gen-flankierenden Regionen homologe Bereiche enthielt, wurde das MBA1-Gen vollständig mit der kanMX4-Resistenz-kassette im BY4741 WT-Stamm ersetzt.
Für SILAC-basierte Analysen wurde auf den ∆oxa1-Stämmen (für SILAC), die sowohl ein Plasmid mit OXA1-FLAG oder oxa1-W128F-FLAG als auch eine genomische Deletion für OXA1 und LYS2 trugen, zusätzlich die Deletion von ARG4 eingeführt. Da für den vorhandenen OXA1-Knockout bereits die kanMX4-Kassette verwendet wurde, wurde für die ARG4-Deletion die natMX-Kassette eingesetzt.
Dafür wurde zunächst im Δarg4-Stamm der YKODC die kanMX4- durch die natMX-Kassette ersetzt.
Auf der genomischen DNS des neuen Stammes Δarg4 (YKODC NatR) wurde ein PCR-Produkt amplifiziert, das die natMX-Kassette sowie homologe ARG4-flankierende Bereiche für die voll-ständige ARG4-Deletion auf den Ausgangsstämmen enthielt.
Die jeweils erzeugten PCR-Produkte wurden mittels Elektrotransformation (siehe Kapitel 3.4.3) in die Ausgangsstämme (Tab. 3.8) eingebracht und die Selektion positiver Transformanten erfolgte entweder mit Geneticin (G418) oder mit Nourseothricin (clonNAT).
3.4.5 Isolation chromosomaler DNS aus S. cerevisiae-Zellen
Die genomische DNS aus S. cerevisiae-Zellen wurde benötigt, um zum Beispiel bei der stabilen Integration von DNS-Fragmenten in das Hefe-Genom (siehe Kapitel 3.4.4) als PCR-Matrize zu fungieren oder um die genomischen Deletionen bestimmter Gene mittels PCR (siehe Kapitel 3.2.1) zu überprüfen. Dazu wurden die Hefezellen in 50 ml flüssigem Glukosemedium kultiviert, durch Zentrifugation sedimentiert (3 min, 1600 x g, RT) und mit 1,8 ml Wasser gewaschen. Danach wurden sie in 200 µl gDNS-Präparationspuffer (100 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA;
1 % (w/v) SDS; 2 % (v/v) Triton X-100; pH 8,0) resupendiert, eine Spatelspitze in Salzsäure gewaschener Glasperlen sowie 200 µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) zugegeben. Der Zellaufschluss erfolgte durch 15-minütiges Vortexen. Nach der Zugabe von 200 µl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0) folgte eine Zentrifugation (5 min, 16000 x g, RT), durch welche die Phasentrennung beschleunigt wurde. Die obere wässrige Phase
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enthielt die Nukleinsäuren und wurde deshalb in ein neues Reaktionsgefäß überführt, in welchem sie mit 1 ml absolutem Ethanol zur Fällung versetzt wurde. Nach mehrmaligem Invertieren wurde 2 min bei 16000 x g und RT zenrifugiert und der Überstand verworfen. Um das DNS-Sediment von noch vorhandener RNS zu befreien, wurde es in 400 µl TE-Puffer aufgenommen, 3 µl RNase A-Lösung (10 mg/ml) zugegeben und für 5 min bei 37 °C inkubiert. Die Fällung der genomischen DNS erfolgte mit 10 µl 4 M Ammoniumacetat und 1 ml absolutem Ethanol. Die DNS wurde für 5 min bei 16000 x g und RT pelletiert, getrocknet, in 30 µl Wasser gelöst und bei -20 °C gelagert.
3.4.6 Sporulation und Tetradenanalyse
In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der Sporulation und Tetradenanalyse eingesetzt, um einen ∆oxa1-Stamm zu erzeugen, der sowohl ein für oxa1-W128F-FLAG kodierendes Plasmid als auch eine genomische LYS2-Deletion trägt. Als Ausgangsstamm diente ein heterozygoter Hefeklon mit BY4743-Genotyp-Hintergrund (LYS2/lys2Δ0), der das oxa1-W128F-FLAG-Plasmid enthielt.
Der diploide Hefeklon wurde in flüssigem Galaktosemedium bei 30 °C kultiviert und durch Zentri-fugation (3 min, 1600 x g, RT) sedimentiert. Die Zellen wurden in 100 μl YP-Galaktosemedium resuspendiert, auf eine Sporulationsplatte getropft und für 2 - 6 Tage bei 30 °C inkubiert. Mit Hilfe eines Lichtmikroskops wurde analysiert, ob sich bereits Asci mit jeweils vier Sporen gebildet hatten.
Um die Sporen zu vereinzeln, musste zunächst die Ascus-Wand entfernt werden. Dazu wurde etwas vom Zellrasen abgenommen und in 20 μl Zymolyaselösung (0,5 mg/ml in 1 M Sorbitol) aufgenommen.
Nach einer fünfminütigen Inkubation bei 30 °C wurden 500 µl Wasser zugegeben und die Ansätze auf Eis versetzt. Am Rand einer YP-Glukose-Platte wurden 20 μl einer solchen Suspension strichförmig verteilt und unter Verwendung eines Mikromanipulators (Singer Instruments, Somerset, UK) wurden die Tetraden getrennt und die Sporen vereinzelt. Nach einer zwei- bis viertägigen Inkubation bei 30 °C folgte die Phänotypenanalyse der gewachsenen Kolonien. Dazu wurden sie auf Selektivmedium-agarplatten (siehe Kapitel 3.1.7.1) umgestempelt und für weitere 2 - 4 Tage bei 30 °C inkubiert.
Mögliche positive Klone wurden mittels PCR (siehe Kapitel 3.2.1) überprüft und ihr Paarungstyp mit dem Halo-Assay (siehe Kapitel 3.4.7) bestimmt.
3.4.7 Halo-Assay
Zur Bestimmung des Paarungstyps wurden 200 ml YP-Glukosemedium mit 2 g Agar aufgekocht und auf ca. 35 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 1 ml einer RC 898-Kultur (Mat a; leu2Δ0; can1Δ0; trp5Δ0;
ade2Δ0) wurde das Gemisch in Petrischalen gegossen. Je 10 μl einer zu untersuchenden Hefekultur wurden auf diese Platten getropft und bei 30 °C inkubiert. Da die RC 898-Zellen mit dem Paarungstyp a mit dem Wachstum aufhören, wenn der zu analysierende Stamm den Paarungstyp α besitzt, konnte anhand eines auftretenden Hemmhofs („Halo“) um die aufgetropfte Kolonie bestimmt werden, um welchen Paarungstyp es sich handelt.
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3.4.8 Wachstumstropftest mit S. cerevisiae-Zellen
Um das Wachstumsverhalten von S. cerevisiae-Zellen zu analysieren, wurde ein Tropftest durch-geführt. Dazu wurden die zu untersuchenden Hefezellen zunächst in Glukosemedium kultiviert bis sie eine optische Zelldichte von ~ 1,2 erreicht hatten. Daraufhin wurden sie in Laktatmedium so überimpft, dass ihre OD600 ungefähr 0,7 entsprach. Sie wurden für weitere 4 - 6 h bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde ihre optische Dichte erneut ermittelt und für alle Stämme auf ca. 0,7 eingestellt. Von diesen Zellsuspensionen ausgehend wurde nun sukzessiv 1:10 in Laktatmedium verdünnt und aus jeder dieser Verdünnungsstufen wurden 3 - 5 µl auf Agarplatten gestempelt oder aufgetropft. Da im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss der verschiedenen Mba1-Varianten auf das Wachstumsverhalten der Hefen in Abhängigkeit der Kohlenstoffquelle und der Temperatur analysiert werden sollte, wurden Selektivmediumagarplatten mit Glukose und Laktat (siehe Kapitel 3.1.7.1) verwendet und die Hefen bei 25 °C, 30 °C und 37 °C für 4 Tage inkubiert.