Sämtliche massenspektrometrische Untersuchungen der vorgelegten Arbeit wurden von Dr. Miroslav Nikolov und Monika Raabe aus der Arbeitsgruppe „Bioanalytische Massen-spektrometrie“ unter der Leitung von Prof. Dr. Henning Urlaub am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie (Göttingen, Deutschland) durchgeführt.
3.8.1 Proteolytische Spaltung von Proteinen im SDS-Gel
Für die Analyse der einzelnen Peptide eines komplexen Proteingemisches mit Hilfe der Massen-spektrometrie war es zunächst notwendig, den Grad der Komplexität der zu untersuchenden Probe hinsichtlich der enthaltenen Proteine zu reduzieren. Dazu wurden die Proteine zuerst über eine SDS-PAGE und weiterhin durch das Ausschneiden von kleinen Stücken aus dem Gel separiert.
Die Eluate der Koimmunopräzipitationen mit SILAC-markiertem Oxa1-FLAG und Oxa1-W128F-FLAG (siehe Kapitel 3.5.7.1) wurden so miteinander gemischt, dass die beiden Zielproteine in gleicher Menge zueinander vorlagen. Dieses Gemisch wurde mit Hilfe eines SDS-Polyacrylamid-gradientengels (4 → 12 % (w/v)) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aufgetrennt.
Im Gegensatz dazu wurden die Eluate der Koimmunopräzipitationen mit den Mba1-FLAG-Varianten (siehe Kapitel 3.5.7.2) für die massenspektrometrischen Analysen einzeln, d. h. ohne mischen, auf das SDS-Polyacrylamidgradientengel (4 → 12 % (w/v)) aufgetragen und aufgetrennt.
Zur Fixierung der Proteine im Gel wurde eine Coomassie-Färbung (siehe Kapitel 3.5.8.5) durch-geführt und jede Gelspur in 23 gleich große Gelstücke geschnitten. Jedes dieser Gelstücke wiederum wurde in kleine Würfel mit einer Größe von 1 mm x 1 mm geschnitten. Der im-Gel-Verdau der Proteine mit Trypsin efolgte nach Shevchenko et al. (Shevchenko et al., 2006). Dafür wurden alle
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aufgeführten Inkubationsschritte in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt, alle verwendeten Lösungen in LiChrosolv-Wasser mit LC-MS-Qualität (Merck, Darmstadt, Deutschland) angesetzt und nach jedem Inkubationsschritt die Lösungen entfernt. Zuerst wurden die Gelwürfel mit 150 µl Wasser für 5 min bei RT gewaschen, in 150 µl Acetonitril für 15 min bei RT dehydriert, getrocknet, in 100 µl Reduzierungspuffer (100 mM NH4HCO3; 10 mM DTT;
pH 8,0) rehydriert und für mindestens 30 min bei 56 °C inkubiert. Danach wurden die Gelwürfel erneut in 150 µl Acetonitril dehydriert und, um reduzierte Cysteinreste zu alkylieren, in 100 µl Iodacetamidpuffer (55 mM C2H4INO; 100 mM NH4HCO3; pH 8,0) für 20 min bei RT im Dunkeln eingelegt. Die Gelwürfel wurden mit 150 µl Ammoniumhydrogencarbonatpuffer (100 mM; pH 8,0) für 15 min bei RT gewaschen, mit 150 µl Acetonitril versetzt, für 20 min bei RT inkubiert, nochmals in 150 µl Acetonitril für 15 min bei RT dehydriert, getrocknet und in 15 - 20 µl Verdaupuffer (50 mM NH4HCO3; 5 mM CaCl2; 12,5 ng/µl Trypsin; pH 8,0) für 30 - 45 min auf Eis rehydriert. Damit die Gelwürfel während des Verdaus über Nacht bei 37 °C nicht austrockneten, wurden sie mit Verdaupuffer ohne Trypsin überschichtet.
3.8.2 Extraktion von Peptiden aus dem SDS-Gel
Die durch den im-Gel-Verdau erzeugten Peptide (siehe Kapitel 3.8.1) wurden nach Shevchenko et al.
(Shevchenko et al., 2006) aus den Gelstücken extrahiert. Auch hierfür wurden alle Inkubationsschritte in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt und die Lösungen wurden typischerweise nach jedem Inkubationsschritt wieder entfernt. Zunächst wurde der Verdau-ansatz mit 10 - 15 µl Wasser versetzt und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Gelwürfel mit 100 µl Acetonitril für 15 min bei 37 °C behandelt und nach einer kurzen Zentrifugation der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß transferiert. Die dehydrierten Gelwürfel wurden mit 65 µl 5 % (v/v) Ameisensäure versetzt, gevortext und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Es folgte eine weitere Inkubation für 15 min bei 37 °C mit 65 µl Acetonitril und nach einer kurzen Zentrifugation wurde auch dieser Überstand abgenommenen und aufbewahrt. Um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten, konnte ein dritter Extraktionsschritt mit Acetonitril angewandt werden. Zum Schluss wurden die Überstände aller durchgeführten Extraktionsschritte vereinigt, in einer SpeedVac (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) aufkonzentriert und in 20 µl einer Acetonitril-Ameisen-säurelösung (5 % (v/v) Acetonitril; 1 % (v/v) Ameisensäure) mit Hilfe von extensivem Vortexen und einer dreiminütigen Ultraschallbehandlung resuspendiert.
3.8.3 LC-MS/MS-Analyse von Peptiden
Sämtliche LC-MS/MS-Analysen (Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massen-spektrometrie) wurden mit dem Massenspektrometer des Typs LTQ-Orbitrap XL der Firma Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) durchgeführt, das über eine
Nanoelektronenspray-72
Ionenquelle mit einem Nanoflow-RP-HPLC-System (Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromato-graphie) (Agilent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) verbunden war.
Um die aus dem komplexen Ausgangsproteingemisch gewonnen Peptide weiterführend vor der eigentlichen massenspektrometrischen Analyse über Nanoflow-RP-HPLC aufzutrennen, wurden je 5 µl-Aliquots der Peptid-angereicherten Proben (siehe Kapitel 3.8.2) auf eine analytische C18-Säule geladen und bei einer Flussrate von 250 nl/min eluiert. Nach der flüssigchromatographischen Trennung wurden die eluierten Peptide über eine Nanoelektronenspray-Ionisation mit einer Spannung von 1,5 kV zur Detektion in das Massenspektrometer eingebracht.
3.8.4 Prozessierung der massenspektrometrischen Daten
3.8.4.1 Analyse der massenspektrometrischen Daten der Koimmunopräzipita-tionen mit den SILAC-markierten Oxa1-FLAG-Varianten
Die umfangreiche Bearbeitung und Darstellung der massenspektrometrischen Analyse der SILAC-basierten Koimmunopräzipitationen mit Oxa1-FLAG-Varianten (siehe Kapitel 3.5.7.1) wurde stets von Dr. Nikolov (Arbeitsgruppe „Bioanalytische Massenspektrometrie“, Prof. Dr. Henning Urlaub, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen, Deutschland) nach Nikolov et al.
(Nikolov et al., 2011) durchgeführt. Zur Prozessierung der massenspektrometrischen Rohdaten wurde das Programm MaxQuant unter Zuhilfenahme der UniProt-Proteindatenbank für S. cerevisiae eingesetzt. Die verwendeten schweren Kohlenstoff- und Stickstoffisotope, mit denen Lysin und Arginin markiert waren, wurden bei der Datenbanksuche berücksichtigt. Die von MaxQuant ausgewerteten Daten wurden, wie in Nikolov et al. (Nikolov et al., 2011) beschrieben, in die Software R importiert. Zum Abschluss wurden die normalisierten Werte der Intensitätsverhältnisse (S/L) von schwer markiertem (S) zu leicht markiertem Peptid (L) der Vorwärtsanalyse (VA) und der Rückwärts-analyse (RA) in einem Streudiagramm mit logarithmischen Skalen gegeneinander aufgetragen.
3.8.4.2 Analyse der massenspektrometrischen Daten der Koimmunopräzipita-tionen mit den verschiedenen Mba1-FLAG-Varianten
Um die Peptide der massenspektrometrischen Analyse der Koimmunopräzipitationen mit den verschiedenen Mba1-FLAG-Varianten (siehe Kapitel 3.5.7.2) zu identifizieren, wurden die generierten massenspektrometrischen Rohdaten unter Verwendung der Suchmaschine Mascot Daemon gegen die theoretischen Daten der UniProt-Proteindatenbank für S. cerevisiae abgeglichen. Diese Ergebnisse wurden in das Programm Scaffold Viewer integriert und analysiert. Ausgewählte Daten wurden in Excel exportiert, quantifiziert und in Form von Datentabellen dargestellt.
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