Die Spezifität der P50-Peptidantikörper

Die Zunahme des Antikörpertiters wurde in einem ELISA-Assay verfolgt. Als Antigen wurde dabei das P50-Peptid an BSA gekoppelt verwendet, um sicherzustellen, daß die im Serum vorliegenden Antikörper auch gegen das Peptid gerichtet waren, und nicht gegen den Kopplungspartner KLH. Abb. 3 zeigt die Zunahme des Antikörpertiters gegen das Peptid P50.

Abb. 3 ELISA: Immunisierung mit P50

Eine Multititerplatte wurde mit BSA-P50 beschichtet. Beginnend mit einer 1: 100 Verdünnung wurden die Seren bzw. gereinigten Antikörper in einer 1: 1 Verdünnungsreihe aufgetragen. Zur Normierung wurde die maximal erreichte OD _405nm gleich 1 gesetzt.

Aus dem ELISA-Assay ist zu erkennen, daß das Präimmunserum keine Antikörper gegen das P50-Peptid enthielt. Die im Serum enthaltenen Antikörper sind spezifisch für das P50-Peptid. Bereits nach der zweiten Immunisierung war eine Reaktion erkennbar.

Das Kaninchen wurde nach drei Immunisierungen getötet und ausgeblutet.

Nach Erhalt des Serums wurden durch eine BSA-P50-Affinitätschromatographie aus dem Serum monospezifische Antikörper präpariert (vgl. 3.4.3). Diese P50-spezifischen Antikörper wurden im Immunoblot auf Xenopus laevis Meta-, Interphase-Ei- und HeLa-Extrakten getestet. Abb. 4A oben zeigt, daß der Peptidantikörper ein ca. 60 kDa großes Protein erkennt. Dies entspricht dem apparenten Molekulargewicht von Cdc6 in Hefe oder Mensch. Da das P50-Peptid eine konservierte Region im Cdc6 Protein umfaßt, wurde zunächst angenommen, daß es sich bei dem erkannten 60 kDa Protein um Cdc6

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handelt. Datenbankanalysen hatten außerdem gezeigt, daß die ausgewählte Peptidsequenz in keinem weiteren bis dahin beschriebenen Protein vorkommt.

Im Zeitraum der Herstellung P50-spezifischer Antikörper wurde die Xenopus laevis Cdc6 Sequenz publiziert (Coleman et al., 1996). Die cDNA wurde uns von Piotr Romanowski in einem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt und ermöglichte uns, Xenopus laevis-Cdc6 im Baculovirussystem rekombinant herzustellen. Die Immunisierung von Kaninchen mit dem rekombinanten Xenopus laevis Cdc6 Protein führte zu einem polyklonalen Antiserum. Mit monospezifischen Cdc6-Antikörpern konnten nun vergleichende Studien zu dem P50-Peptidantikörper durchgeführt werden.

Im Immunblot zeigte sich, daß der P50-Peptidantikörper rekombinantes XlCdc6 Protein nicht erkennt (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis war überraschend, da aus den oben genannten Gründen davon ausgegangen wurde, daß der Peptidantikörper spezifisch für XlCdc6 ist. Abb. 4A zeigt die unterschiedliche Spezifität von P50-Peptidantikörpern und polyklonalen anti Cdc6-Antikörpern. Die P50-Peptidantikörper erkennen auf HeLa-(Spur 1) und Eiextrakt HeLa-(Spur 2 und 3) ein 60 kDa Protein, auf Hefe-Extrakt HeLa-(Spur 4) wird dagegen kein Protein detektiert. Da das P50-Peptid, gegen das der Antikörper gerichtet ist, aus der Hefesequenz stammt, sollte der Peptidantikörper das Cdc6 Protein in Hefe erkennen. Der polyklonale Cdc6-Antikörper gegen das rekombinante Xenopus laevis Protein erkennt Cdc6 auf Hefe-Extrakt und Xenopus laevis Eiextrakt. In HeLa-Extrakten erkennt der Antikörper ein ca. 80 kDa Protein über dessen Identität keine Aussage getroffen werden kann.

Abb. 4B verdeutlicht durch ein vergleichendes 7,5%iges SDS-Proteingel die Verschiedenheit des Proteins das von dem Peptidantikörper erkannt wird und dem Cdc6 Protein. Hier wurde Xenopus laevis Metaphase-Eiextrakt zweimal gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Immunfärbung erfolgte auf zwei unabhängigen Membranen. Abb.

4C zeigt das Ergebnis eines Immunoblots von Xenopus laevis Meta- und Interphase-Eiextrakt, der nacheinander mit P50- und Cdc6-Antikörpern inkubiert wurde. Es ist zu erkennen, daß Cdc6 in Interphase-Extrakt durch sein apparentes Laufverhalten in der Elektrophorese nicht von dem Protein zu unterscheiden ist, welches vom P50-Peptidantikörper detektiert wird (Spur 2). Dieses Protein migriert in der Gelelektrophorese nur wenig langsamer als Cdc6 (vgl. Spur 1). Das unterschiedliche Laufverhalten der beiden Proteine ist nur im Metaphase-Extrakt zu erkennen, da Cdc6 dort hyperphosphoryliert vorliegt.

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Abb. 4: Monospezifische P50-Peptidantikörper erkennen ein 60 kDa Protein, das sich von Cdc6 unterscheidet

A: Jeweils 20 µg Proteinextrakt von Xenopus laevis Metaphase- und Interphase Eiextrakt (M, I), HeLa-Zellen und Hefe (EY48) wurden in einer 10%iges SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Immunfärbung erfolgte mit monospezifischen P50-Antikörpern. Nach Entfernung der Antikörper von der Membran erfolgte eine zweite Immundekoration mit anti Cdc6-AK.

B: Aliquote von X.l. Metaphase-Eiextrakt, entsprechend 20µg Protein, wurden in einer 7,5%iger SDS-PAGE aufgetrennt. Eine Spur wurde mit Coomassie Blau gefärbt, die anderen beiden wurden auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Membran wurde nach dem Transfer zerschnitten und die beiden Hälften mit Cdc6 AK und P50 AK immungefärbt.

C: X.l.Metaphase-Eiextrakt wurde in einer 7,5%igen SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde nacheinander mit CDC6 AK und P50 AK inkubiert.

Somit wurde gezeigt, daß der P50-Peptidantikörper sowohl in humanen Zellen als auch in Xenopus laevis ein Protein mit dem apparenten Molekulargewicht von 60 kDa erkennt. Bei diesem Protein handelt es sich jedoch nicht wie erwartet um das Cdc6 Protein. Im folgenden Experiment sollte überprüft werden, ob das Antigen des P50-Peptidantikörpers auch in anderen Organismen mit dem P50-Antikörper nachgewiesen werden kann. Hierzu wurden Extrakte von Xenopus laevis (Zellen, Oocyten, Ei), sowie Zellextrakte von Hefe, Dictyostelium, Seestern, Drosophila, Schwein, Hamster, Affe, sowie Organextrakte von Hammelleber, Rinderherz, Rattenleber, Rattenniere und Rattenmuskel im Immunoblot untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses

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Antigen ein konserviertes Protein ist, das in fast allen Extrakten und Geweben höherer Eukaryonten exprimiert wird (vgl. Abb. 5). In Hefe konnte kein entsprechendes Homolog nachgewiesen werden. Die Konservierung über die Evolution dieses Proteins läßt vermuten, daß das Genprodukt, das der Peptidantikörper erkennt, eine wichtige Funktion in der eukaryontischen Zelle ausführt.

Abb. 5: P50 ist unter Eukaryonten konserviert

Zellextrakte verschiedener Spezies wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurde einmal mit Coomassie Blau gefärbt und ein weiteres Mal auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern angefärbt.

Für eine Reihe von weiteren Experimenten war es interessant festzustellen, ob der P50-Peptidantikörper für eine Immunpräzipitation geeignet ist. Hierzu wurden verschiedene Immunpräzipitationsparameter wie zum Beispiel Menge der Antikörper, Waschpufferbedingungen etc. getestet. Bei diesen Experimenten konnten keine Bedingungen gefunden werden, bei denen der P50-Peptidantikörper das Antigen aus Xenopus laevis Eiextrakt immunpräzipitiert.

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Die beschriebenen Versuche haben gezeigt, daß der P50-Peptidantikörper nicht spezifisch für Cdc6 ist. Dieser Antikörper erkennt in Immunoblotstudien ein Protein mit ähnlichem apparentem Molekulargewicht. Das von dem Peptidantikörper detektierte Protein wird im folgenden in Anlehnung an die Bezeichnung des Peptides als „P50“

bezeichnet und sollte in den nachstehenden Untersuchungen näher charakterisiert werden, um festzustellen, ob es sich bei diesem Protein um ein Homolog zu Cdc6 handelt.

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