3 Material und Methoden
4.8 Reinigung von p170 aus Xenopus laevis Eiextrakt
Durch die Expression von p170-Teilfragmenten und die Immunisierung von Kaninchen mit diesen Teilfragmenten stehen mit dem Erhalt von monospezifischen p170-Antikörpern effektive Werkzeuge zur Verfügung um p170 aus Eiextrakt aufzureinigen.
Das Vorhandensein von größeren Mengen an hochgereinigtem p170 Protein ermöglicht eine genauere Charakterisierung und Funktionsanalyse in biochemischen Versuchen.
4.8.1 Mengenverhältnisse und Stabilität von p170 in Eiextrakt
Um einen Eindruck von den Mengenverhältnissen von p170 und auch p58 im Eiextrakt zu anderen bekannten Proteinen zu geben, wurde die Kopienzahl von diesen beiden Proteinen in Eiextrakt abgeschätzt. Durch den Vergleich der Signalstärke im Immuno-Blot von bakteriell exprimiertem Protein (Fragment C) und p170 bzw. p58 im Eiextrakt konnte auf die Kopienzahl pro µl in Metaphase-Extrakt geschlossen werden. Die Untersuchungen wurden für p58 zusätzlich in WAK-Zellen durchgeführt.
Rekombinantes Protein wurde über eine Nickel-Agarose-Säule aufgereinigt, und über einen Bradford-Assay wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Im Falle der Bestimmung der Molekülzahl in WAK-Zellen wurde die Zellzahl bestimmt. Die restlichen Zellen wurden pelletiert und direkt in einem definierten Volumen Laemmli-Probenpuffer aufgenommen. Die lysierten Zellen wurden sonifiziert und abzentrifugiert.
Die Proteine wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Im Immunoblot wurden steigende Proteinmengen des rekombinanten Fragments C (p170 aa 965-1328) mit 1µl Eiextraktes bzw. einem definiertem Aliquot von Zellen verglichen.
Abb. 36A oben links und unten Mitte zeigt, daß die Proteinkonzentration von p58 im Eiextrakt einer Signalstärke entspricht, die zwischen der von 0,5 und 0,75 ng rekombinantem Protein liegt. Nach Auswertung mit dem NIH-Image Programm (densiometrisches Scannen) ergibt sich somit eine ungefähre p58 Konzentration von 0,6 ng pro µl Eiextrakt. Die p170-Konzentration im Eiextrakt liegt demgegenüber bei ungefähr 0,45 ng pro µl Eiextrakt (Abb. 36A oben rechts).
Somit liegen ungefähr 6 x 109 p58 Moleküle und 1.5 x109 p170 Moleküle pro µl Eiextrakt vor. Bezogen auf WAK-Zellen wurden etwa 5000 p58 Moleküle pro Zelle errechnet (vgl. dazu: MCM3 Kopienzahl 1 Million pro HeLa-Zelle, Untersuchungen von R. Burkhart, Dissertation 1995 und DEK Kopienzahl 6 Millionen pro Zelle, Untersuchungen von F. Kappes, Diplomarbeit 2000). Für das Replikationsprotein Cdc6 werden in der Literatur Werte um ca. 6 ng/µl Eiextrakt angegeben (Coleman et al., 1996), dies entspricht einer Konzentration von etwa 80 nM. Cdc6 liegt somit im Eiextrakt um den Faktor 10-12 mal häufiger vor als p58 oder p170.
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Abb. 36: Abschätzung der Kopienzahl von p170 und p58 in Xenopus laevis Eiextrakt und WAK-Zellen sowie Stabilitätsuntersuchungen
A: oben links: Metaphase-Eiextrakt wurde parallel zu steigenden Mengen bakteriell exprimiertem Protein (Fragment C) in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Der immunologische Nachweis erfolgte mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635 und anti C 663)
Unten: Ein Aliquot, entsprechend 8,4x105 WAK-Zellen, wurde gelelektrophoretisch neben steigenden Mengen von bakteriell exprimiertem Protein (Fragment C) aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635) untersucht.
B: Xenopus laevis Metaphase-Extrakt wurde bei 4°C, 25°C und 37°C inkubiert. Nach 0, 0.5, 1, 3,5 h wurden Proben abgenommen und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Proben wurden auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Der immunologische Nachweis erfolgte mit anti-p170 spezifischem Serum (anti N 636).
4 Ergebnisse 86
Um die Ausbeute einer Reinigung kalkulieren zu können, ist es auch wichtig zu untersuchen, wie stabil das Protein im verwendeten Ausgangsmaterial vorliegt. Die Stabilität von p170 und p58 wurde getestet, indem Xenopus laevis Metaphase-Extrakt bei verschiedenen Temperaturen unterschiedlich lang inkubiert wurde. Abb. 36B zeigt, daß p170 bei 4°C über einen Zeitraum von 4h sehr stabil ist, aber bei 25°C nach 3 Stunden teilweise abgebaut wird. Dieser Abbau verstärkt sich zusätzlich bei Inkubation bei 37°C, wo p170 bereits nach 3h nicht mehr nachweisbar ist. Beim Abbau von p170 konnte keine gleichzeitige Zunahme von p58 festgestellt werden. p58 ist bei allen drei untersuchten Temperaturbedingungen über einen Zeitraum von 5h gleich stabil.
4.8.2 Chromatographische Reinigung von p170
Die Reinigung von p170 erfolgte aus 30 ml Metaphase-Eiextrakt. Geht man von einer p170 Konzentration von 0,45 ng/µl Eiextrakt aus, so enthält das zur Reinigung verwendete Ausgangsmaterial nur knapp 14 µg des p170 Proteins. Die Gesamtproteinmenge des Ausgangsmaterial entspricht etwa 1,8 g.
Abb. 37A zeigt die verwendeten Säulen für die p170 Reinigung. p170 zeichnet sich durch eine starke Bindung an Phenyl-Sepharose aus, und erwies sich als mit Salz nicht eluierbar. Erst durch den Einsatz von 1% Triton konnte p170 von dieser Säule zurückgewonnen werden. In Abb. 37B sind die einzelnen Reinigungsstadien im Silbergel (oben) und im Immunoblot mit p170 spezifischen Antikörpern gezeigt (anti N 636). In dem verwendeten Ausgangsmaterial ist p58 nicht nachweisbar. Der Vergleich mit einer Polysomenfraktion aus Xenopus laevis Eiern zeigt, daß p58 hier in größeren Mengen vorliegt (Spur 2). Vergleicht man die zunehmende Reinigungsstadien von p170, insbesondere die Elutionsfraktion von der Phenyl-Sepharose-Säule (Spur 5 und 6) so fällt auf, daß die Proteinbande für p58 zunimmt. Dies kann als starker Hinweis dafür gewertet werden, daß p58 ein Abbauprodukt von p170 ist. Abb. 37C zeigt den abschließenden Sucrosedichtegradient der p170 Reinigung. p170 ist in den untersuchten Fraktionen im Silbergel als prominente Bande zu erkennen (Silbergel oben, Spur 6-7) und mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 663) im Immunoblot nachweisbar (Spur 5 und 6). Zusätzliche Proteine zwischen 43 und 67 kDa kontaminieren diese Fraktionen, ihre Identität ist nicht geklärt. Die Ausbeute der Reinigung wird auf ungefähr 1 µg Protein eingeschätzt, das sich auf 3 Fraktionen (à 300 µl) verteilt.
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Abb. 37: Reinigung von p170 aus Xenopus laevis Eiextrakt
A: Reinigungsschema für p170. Die angegeben Zahlen entsprechen mM NaCl.
B: Reinigungsschritte für p170 im Silbergel (oben) und im Immunoblotnachweis (anti C 663).
C: Dargestellt ist der abschließende Glycerindichtegradient. Eiextrakt wurde über FF Q-Sepharose, Phenyl-Sepharose, S-Sepharose, Heparin-Sepharose und FF Q-Sepharose chromatographiert. Aliquote des Glyceringradienten wurden in zwei 10%igen SDS Gelen aufgetrennt. Ein Gel wurde Silber gefärbt, das andere Gel wurde auf eine Nitrocellulose- Membran transferiert. Der immunologische Nachweis erfolgte mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 663).
4 Ergebnisse 88