Luciferase-Assay

Nach einer Transfektion von 293-Zellen für 48 h wurde das Medium entfernt und die Zellen mit 1x PBS gewaschen. In jedes Loch einer 6 Well-Platte wurden 200 µl Reporter-Lysis-Puffer (Promega, # E4030) gegeben und die Zellen unter gleichmässigem Schütteln für 10 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zusammengescharpt und in ein Eppendorfgefäß transferiert. Die Proben wurden gevortext und bei 12000g in der Mikrozentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt und als Zellextrakt bei –70°C aufbewahrt. Zur Messung der Luciferase Aktivität wurden 10 µg Aliquots in 96 well-Titerplatten gegeben, mit 100 µl Luciferase Reagenz (Promega, # E1483) versetzt, und die Luciferase-Aktivität wurde für 10 sek im Luminometer (Victor II, Firma Wallac) vermessen.

24 3 Material und Methoden

3.4.16 ββββ -Galactosidase Assay

10µg Gesamtprotein-Aliqots wurden in 96 well-Platten überführt und mit 70 µl Reaktionspuffer (Tropix, PE Biosystems, Galacto Light& Galacto Light Plus, # BL 110P) für 60 min inkubiert. Nach Platzierung in das Luminometer wurden 100 µl des Accelerators (Bezugsquelle siehe Reaktionspuffer) zugegeben und die β-Gal-Aktivität über OD Messung bei 410 nm für 10 sec/well gemessen.

3.4.17 In vitro-Translation

Der im pBluescript-SK vorliegende Klon C (p170 aa 629-1335) wurde mit dem TNT-T3-Retikulozytenlysat-System (Promega‚ #4610) in Anwesenheit von ³⁵S-Methionin in vitro transkribiert und translatiert. Dazu wurden 2 µg DNA-Matrize in einen 30 µl Prämix bestehend aus:

25 µl Kaninchen-Retikulozytenlysat, 1,5 µl RNasin (40 Units/ml), 0,5 µl MgCl₂ (1 M), 2,5 µl NTP Mix (je 10 mMolar), 1 µl aa Mix- Met (je 1mM, ohne Methionin), 1,25µl

35S Met (1200 Ci/mmol mit 10 mCi/ml), 2 µl T3-Polymerase (40 Units), 0,5 µl H₂O gegeben und für 60-120 Minuten bei 30°C inkubiert. Ein Zehntel des Ansatzes der in vitro synthetisierten Proteine wurde in der SDS-PAGE aufgetrennt. Danach wurde das Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau angefärbt, weitgehend entfärbt und mit Amplify-Fluorigraphiereagenz (Amersham) für 30 min inkubiert. Anschließend wurde das Gel bei 65°C auf dem Vakuumtrockner getrocknet. Der Nachweis der radioaktiv markierten Proteine erfolgte durch Fluorigraphie auf einem Röntgenfilm.

3.4.18 Herstellung von Zellextrakten aus Organen von Xenopus laevis

Ein Xenopus laevis-Weibchen wurde auf Eis gekühlt und mit einer Schere dekapitiert.

Die Organe wurden nach dem Öffnen der Bauchdecke mit Skalpell mit einer Pinzette vorsichtig entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Jedes Organ wurde dann unter flüssigem Stickstoff im Mörser mit dem Pistill fein zermahlen. Dieses Pulver wurde direkt in Laemmli-Probenpuffer aufgenommen und durch 4-5 maliges Stoßen im Douncer weiter aufgeschlossen. Die Proben wurden für 5 min gekocht, in der Eppendorf-Tischzentrifuge abzentrifugiert und der Überstand bis zum Auftrag auf ein 10% iges SDS-Gel bei –20°C aufbewahrt.

3.4.19 In vitro Befruchtung von Xenopus laevis

Ein adultes Xenopus laevis-Männchen wurde dekapitiert, mit einem Skalpell wurden die Hoden vorsichtig entnommen und bis zu ihrer Verwendung in 0,1x Marc´s Modified Ringers Lösung aufbewahrt (10 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, 0,2 mM KCl, 0,5 mM Hepes, 1 mM EDTA). Frisch abgelegte Eier eines adulten Xenopus laevis-Weibchens wurden befruchtet, indem die Hoden vorsichtig mit einer Pinzette zerdrückt wurden und damit jedes Ei berührt wurde. Die so befruchteten Eier wurden mit 0,1x

3 Material und Methoden 25

Marc’s Modified Ringers Lösung überschichtet und die Embryonalentwicklung wurde mit Hilfe eines Binokulars verfolgt. Nach erfolgter Befruchtung wurden in Abständen von 30 min jeweils 10 Embryonen eingesammelt. Bis zur Analyse in der SDS-PAGE wurden diese Eier bei –70°C aufbewahrt. Die eingefrorenen Embryonen wurden mit mEB Puffer (20 mM Hepes, 80 mM Glycerolphosphate, 20 mM EGTA, 15 mM MgCl2, 50 mM NaF, 1 mM NaVO₄, 0,5 mM PMSF, 0,5% NP40) aufgebrochen, indem sie 20 mal auf- und abpipettiert wurden. Die aufgeschlossenen Extrakte wurden 15 min auf Eis inkubiert und durch eine Zentrifugation für 15 min bei 4°C in der Tischzentrifuge von unlöslichen Bestandteilen befreit. Der cytosolische Überstand wurde abgenommen und mit Laemmli-Probenpuffer versetzt.

3.4.20 Proteinreinigung aus Xenopus laevis Metaphase-Eiextrakt

30 ml Xenopus laevis Metaphase-Eiextrakt wurden in Puffer 1 verdünnt und für 1h bei 40000 rpm im SW40-Rotor zentrifugiert. Das Pellet wurde in Puffer 1 mit 0,05%

Tween 20, 1% NP40 und 800 mM NaCl extrahiert und weiter aufgereinigt. Die folgenden Reinigungsschritte sind in nachfolgender Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle 6: Reinigungschritte für p170

Reinigungsschritt Auftragbedingungen/

Volumen

Elution von der Säule:

1) FF Q Sepharose II 170 ml Säulenmaterial 25 ml

3) SP Sepharose Triton-Eluat aus 2) mit Puffer 2 Dialyse gegen Puffer 3

6) Glyceringradient 5-30% Dialyse gegen Puffer 1 SW 40, 38000 rpm, 16 h, 4°C Puffer 1: 20 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 80 mM NaCl Puffer 2: Puffer 1 (+1% Triton, 10% Glycerin, 0,1% NP40)

Puffer 3: 50 mM Na-Phosphat, 10% Glycerin, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,1% NP40

Das p170 Protein eluierte von den verschiedenen Säulen meist unter

26 3 Material und Methoden

Hochsalzbedingungen bei 800-1M NaCl (vgl. Abb. 37). Die Reinigung wurde im Immunoblot-Verfahren verfolgt und erstreckte sich über einen Zeitraum von 14 Tagen.

Nach jeder Elution wurden die Proben bei –20°C aufbewahrt. Ausgehend von einer p170 Gesamtproteinmenge von 14 µg in 30 ml Xenopus laevis Extrakt, konnten 1µg gereinigt werden.

3.4.21 Isolierung von schweren und leichten Membranen aus Xenopus laevis Eiextrakt

Ein Interphase-Eiextrakt wurde dreimal mit Acetatpuffer (100 mM K-Acetat, pH 7,2, 2,5 mM MgCl₂, 60 mM EGTA, 0,01 mg/ml Cytochalasin D, 1 mM DTT) verdünnt und für 30 min bei 100 000 g zentrifugiert, um Membran- und Cytosolfraktion zu erhalten.

Die Membranen wurden in 2 M Sucrose in Acetatpuffer resuspendiert und auf den Boden eines mehrstufigen Sucrose-Gradienten geladen (1,3/ 0,86/ 0,5/ 0,25 M Sucrose in Acetatpuffer). Der Gradient wurde für 12h bei 300000g im SW60-Rotor zentrifugiert.

300 µl Fraktionen wurden von oben abgenommen, mit Laemmli-Probenpuffer versetzt und in der SDS-PAGE analysiert (Wittmann et al., 1998).

27

4 Ergebnisse

4.1 Herstellung von Antikörpern gegen das Xenopus laevis Cdc6 Protein

Eine wichtige Voraussetzung für die Analyse von Proteinen ist der Besitz von spezifischen Antikörpern. Zu Beginn dieser Studien im April 1997 war bekannt, daß Cdc6 an der Initiation der DNA-Replikation beteiligt ist und in Hefe ein Substrat von Cyclin-abhängigen Kinasen darstellt (Piatti et al., 1996). Zur weiteren Untersuchung des Proteins Cdc6 in Xenopus laevis sollten Antikörper gegen dieses Xenopus laevis Protein hergestellt werden. Die Sequenz des Xenopus laevis Cdc6 Proteins wurde 1996 publiziert (Coleman et al., 1996). Zu einem früheren Zeitpunkt wurden in unserem Labor Schritte für die Herstellung eines Peptidantikörpers gegen einen besonders konservierten Abschnitt aus dem Saccharomyces cerevisiae Hefe Cdc6 Protein eingeleitet. Ziel war es, einen Antikörper gegen eine konservierte Domäne des Cdc6 Proteins zu erhalten, der im Xenopus laevis-System anwendbar ist und dort dieses Protein spezifisch erkennt. Mit Hilfe eines solchen Werkzeuges sollte die Funktion des Xenopus laevis Cdc6 Proteins im Hinblick auf die Initiation der DNA-Replikation genauer untersucht werden.

4.1.1 Auswahl von homologen Cdc6 Peptid-Sequenzen als Antigen für einen Peptidantikörper

Die Aminosäuresequenzen des Cdc6 Proteins in Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Homo sapiens wurden verglichen und auf besonders konservierte Bereiche hin untersucht. Es wurden drei Peptidsequenzen ausgewählt (Bezeichnung: P48, P49, P50). Die Peptide wurden chemisch synthetisiert, an ein Trägermolekül (KLH) gebunden und es wurden Kaninchen damit immunisiert (vgl.

3.4.2). Abb. 2 zeigt das zur Immunisierung ausgewählte Peptid „P50“. Es besteht aus 12 Aminosäuren. Oben sind die Cdc6 Proteinsequenzen von Spalt- und Bäckerhefe sowie Mensch dargestellt. Die Xenopus laevis Cdc6 Proteinsequenz, die kurz darauf publiziert wurde (Coleman et al., 1996), ist im unteren Teil der Abbildung dargestellt.

4 Ergebnisse 28

Abb. 2: Homologe Regionen des Cdc6 Proteins

Dargestellt sind konservierte Cdc6-Sequenzen von jeweils 12 AS aus S. cerevisiae, S.pombe und H.sapiens und das zur Immunisierung ausgewählte P50 Peptid. Die entsprechende Aminosäuresequenz des Cdc6 Xenopus laevis Protein ist unten angegeben (gelb: unpolare Aminosäuren, grün: polare Aminosäuren, rot: saure Aminosäuren, blau: basische Aminosäuren).

Antikörper gegen zwei weitere Peptide, P48 und P49, aus dem ScCdc6 Protein (P48:

AIELAARKVAASSGDLRKAL- 20 AS und P49: LIGMANSLDMKDRFLSRL- 18 AS) wurden ebenfalls erfolgreich hergestellt. Sie erwiesen sich im ELISA als positiv zu ihrem Antigen, im Immunoblot zeigten sie jedoch keine Reaktion und waren somit für weitere Untersuchungen nicht geeignet (Daten nicht gezeigt).

Der Vergleich des 12 Aminosäuren-Peptides P50 aus Hefe und Mensch mit der entsprechenden Sequenz in Xenopus zeigt, daß 7 von 12 Aminosäuren aus der gewählten Peptidsequenz übereinstimmen. Die ausgewählte Peptidsequenz umfaßt einen Bereich, der das sogenannte Walker B-Motiv umschließt, das auch bei den DNA-Replikationsfaktoren Orc1 und RFC vorkommt. Das Walker B-Motiv ist für die Wechselwirkung von Cdc6 mit MCM Molekülen von Bedeutung (Weinreich et al., 1999). Die Sequenz beinhaltet die Aminosäurenabfolge „DEMD“ und ist somit auch dem „DEAD“-Motiv verwandt, welches bei zellulären Helikasen und bei MCM-Proteinen gefunden wurde.

4 Ergebnisse 29

4.1.2 Die Spezifität der P50-Peptidantikörper

Die Zunahme des Antikörpertiters wurde in einem ELISA-Assay verfolgt. Als Antigen wurde dabei das P50-Peptid an BSA gekoppelt verwendet, um sicherzustellen, daß die im Serum vorliegenden Antikörper auch gegen das Peptid gerichtet waren, und nicht gegen den Kopplungspartner KLH. Abb. 3 zeigt die Zunahme des Antikörpertiters gegen das Peptid P50.

Abb. 3 ELISA: Immunisierung mit P50

Eine Multititerplatte wurde mit BSA-P50 beschichtet. Beginnend mit einer 1: 100 Verdünnung wurden die Seren bzw. gereinigten Antikörper in einer 1: 1 Verdünnungsreihe aufgetragen. Zur Normierung wurde die maximal erreichte OD _405nm gleich 1 gesetzt.

Aus dem ELISA-Assay ist zu erkennen, daß das Präimmunserum keine Antikörper gegen das P50-Peptid enthielt. Die im Serum enthaltenen Antikörper sind spezifisch für das P50-Peptid. Bereits nach der zweiten Immunisierung war eine Reaktion erkennbar.

Das Kaninchen wurde nach drei Immunisierungen getötet und ausgeblutet.

Nach Erhalt des Serums wurden durch eine BSA-P50-Affinitätschromatographie aus dem Serum monospezifische Antikörper präpariert (vgl. 3.4.3). Diese P50-spezifischen Antikörper wurden im Immunoblot auf Xenopus laevis Meta-, Interphase-Ei- und HeLa-Extrakten getestet. Abb. 4A oben zeigt, daß der Peptidantikörper ein ca. 60 kDa großes Protein erkennt. Dies entspricht dem apparenten Molekulargewicht von Cdc6 in Hefe oder Mensch. Da das P50-Peptid eine konservierte Region im Cdc6 Protein umfaßt, wurde zunächst angenommen, daß es sich bei dem erkannten 60 kDa Protein um Cdc6

4 Ergebnisse 30

handelt. Datenbankanalysen hatten außerdem gezeigt, daß die ausgewählte Peptidsequenz in keinem weiteren bis dahin beschriebenen Protein vorkommt.

Im Zeitraum der Herstellung P50-spezifischer Antikörper wurde die Xenopus laevis Cdc6 Sequenz publiziert (Coleman et al., 1996). Die cDNA wurde uns von Piotr Romanowski in einem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt und ermöglichte uns, Xenopus laevis-Cdc6 im Baculovirussystem rekombinant herzustellen. Die Immunisierung von Kaninchen mit dem rekombinanten Xenopus laevis Cdc6 Protein führte zu einem polyklonalen Antiserum. Mit monospezifischen Cdc6-Antikörpern konnten nun vergleichende Studien zu dem P50-Peptidantikörper durchgeführt werden.

Im Immunblot zeigte sich, daß der P50-Peptidantikörper rekombinantes XlCdc6 Protein nicht erkennt (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis war überraschend, da aus den oben genannten Gründen davon ausgegangen wurde, daß der Peptidantikörper spezifisch für XlCdc6 ist. Abb. 4A zeigt die unterschiedliche Spezifität von P50-Peptidantikörpern und polyklonalen anti Cdc6-Antikörpern. Die P50-Peptidantikörper erkennen auf HeLa-(Spur 1) und Eiextrakt HeLa-(Spur 2 und 3) ein 60 kDa Protein, auf Hefe-Extrakt HeLa-(Spur 4) wird dagegen kein Protein detektiert. Da das P50-Peptid, gegen das der Antikörper gerichtet ist, aus der Hefesequenz stammt, sollte der Peptidantikörper das Cdc6 Protein in Hefe erkennen. Der polyklonale Cdc6-Antikörper gegen das rekombinante Xenopus laevis Protein erkennt Cdc6 auf Hefe-Extrakt und Xenopus laevis Eiextrakt. In HeLa-Extrakten erkennt der Antikörper ein ca. 80 kDa Protein über dessen Identität keine Aussage getroffen werden kann.

Abb. 4B verdeutlicht durch ein vergleichendes 7,5%iges SDS-Proteingel die Verschiedenheit des Proteins das von dem Peptidantikörper erkannt wird und dem Cdc6 Protein. Hier wurde Xenopus laevis Metaphase-Eiextrakt zweimal gelelektrophoretisch aufgetrennt und die Immunfärbung erfolgte auf zwei unabhängigen Membranen. Abb.

4C zeigt das Ergebnis eines Immunoblots von Xenopus laevis Meta- und Interphase-Eiextrakt, der nacheinander mit P50- und Cdc6-Antikörpern inkubiert wurde. Es ist zu erkennen, daß Cdc6 in Interphase-Extrakt durch sein apparentes Laufverhalten in der Elektrophorese nicht von dem Protein zu unterscheiden ist, welches vom P50-Peptidantikörper detektiert wird (Spur 2). Dieses Protein migriert in der Gelelektrophorese nur wenig langsamer als Cdc6 (vgl. Spur 1). Das unterschiedliche Laufverhalten der beiden Proteine ist nur im Metaphase-Extrakt zu erkennen, da Cdc6 dort hyperphosphoryliert vorliegt.

4 Ergebnisse 31

Abb. 4: Monospezifische P50-Peptidantikörper erkennen ein 60 kDa Protein, das sich von Cdc6 unterscheidet

A: Jeweils 20 µg Proteinextrakt von Xenopus laevis Metaphase- und Interphase Eiextrakt (M, I), HeLa-Zellen und Hefe (EY48) wurden in einer 10%iges SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Immunfärbung erfolgte mit monospezifischen P50-Antikörpern. Nach Entfernung der Antikörper von der Membran erfolgte eine zweite Immundekoration mit anti Cdc6-AK.

B: Aliquote von X.l. Metaphase-Eiextrakt, entsprechend 20µg Protein, wurden in einer 7,5%iger SDS-PAGE aufgetrennt. Eine Spur wurde mit Coomassie Blau gefärbt, die anderen beiden wurden auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Membran wurde nach dem Transfer zerschnitten und die beiden Hälften mit Cdc6 AK und P50 AK immungefärbt.

C: X.l.Metaphase-Eiextrakt wurde in einer 7,5%igen SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde nacheinander mit CDC6 AK und P50 AK inkubiert.

Somit wurde gezeigt, daß der P50-Peptidantikörper sowohl in humanen Zellen als auch in Xenopus laevis ein Protein mit dem apparenten Molekulargewicht von 60 kDa erkennt. Bei diesem Protein handelt es sich jedoch nicht wie erwartet um das Cdc6 Protein. Im folgenden Experiment sollte überprüft werden, ob das Antigen des P50-Peptidantikörpers auch in anderen Organismen mit dem P50-Antikörper nachgewiesen werden kann. Hierzu wurden Extrakte von Xenopus laevis (Zellen, Oocyten, Ei), sowie Zellextrakte von Hefe, Dictyostelium, Seestern, Drosophila, Schwein, Hamster, Affe, sowie Organextrakte von Hammelleber, Rinderherz, Rattenleber, Rattenniere und Rattenmuskel im Immunoblot untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses

4 Ergebnisse 32

Antigen ein konserviertes Protein ist, das in fast allen Extrakten und Geweben höherer Eukaryonten exprimiert wird (vgl. Abb. 5). In Hefe konnte kein entsprechendes Homolog nachgewiesen werden. Die Konservierung über die Evolution dieses Proteins läßt vermuten, daß das Genprodukt, das der Peptidantikörper erkennt, eine wichtige Funktion in der eukaryontischen Zelle ausführt.

Abb. 5: P50 ist unter Eukaryonten konserviert

Zellextrakte verschiedener Spezies wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurde einmal mit Coomassie Blau gefärbt und ein weiteres Mal auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern angefärbt.

Für eine Reihe von weiteren Experimenten war es interessant festzustellen, ob der P50-Peptidantikörper für eine Immunpräzipitation geeignet ist. Hierzu wurden verschiedene Immunpräzipitationsparameter wie zum Beispiel Menge der Antikörper, Waschpufferbedingungen etc. getestet. Bei diesen Experimenten konnten keine Bedingungen gefunden werden, bei denen der P50-Peptidantikörper das Antigen aus Xenopus laevis Eiextrakt immunpräzipitiert.

4 Ergebnisse 33

Die beschriebenen Versuche haben gezeigt, daß der P50-Peptidantikörper nicht spezifisch für Cdc6 ist. Dieser Antikörper erkennt in Immunoblotstudien ein Protein mit ähnlichem apparentem Molekulargewicht. Das von dem Peptidantikörper detektierte Protein wird im folgenden in Anlehnung an die Bezeichnung des Peptides als „P50“

bezeichnet und sollte in den nachstehenden Untersuchungen näher charakterisiert werden, um festzustellen, ob es sich bei diesem Protein um ein Homolog zu Cdc6 handelt.

4 Ergebnisse 34

4.2 Biochemische Charakterisierung von P50

4.2.1 Intrazelluläre Lokalisation von P50

Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz ist geeignet, die intrazelluläre Lokalisation eines Proteins zu analysieren. Hierzu wurde das P50 Protein durch monospezifische P50-Peptidantikörper in XTH2- und X1-Zellen nachgewiesen. Die Zellen wurden 5 Stunden vor der Fixierung in BrdU-haltigem Medium inkubiert, dadurch können anschließend mit einem anti-BrdU-Antikörper jene Zellen detektiert werden, die sich gerade in der S-Phase befanden.

Abb. 6: Lokalisation von P50 in Xenopus laevis-Zellen

XTH2-Zellen wurden auf Deckgläschen kultiviert, mit 3,5% Paraformaldehyd fixiert und mit Aceton permeabilisiert. Nach dem Absättigen unspezifischer AK-Bindungsstellen mit BSA wurden die Zellen im Phasenkontrast betrachtet (A), die DNA mit Hoechst 33258 sichtbar gemacht (B) und mit monospezifischen anti-P50-Peptidantikörpern gefärbt. Durch anschließende Inkubation mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppeltem sekundären Antikörpern wurde die Verteilung von P50 analysiert (C).

Parallel dazu wurde eine Tubulinfärbung mit monoklonalen Tubulin-Antikörpern durchgeführt (D). In E-G ist die Immunfluoresezenz von Xenopus laevis X1-Zellen gezeigt. (E) Phasenkontrast, (F) P50-Anfärbung, (G) BrdU-Färbung mit monoklonalen AK.

4 Ergebnisse 35

Abb. 6 zeigt das Ergebnis einer solchen Untersuchung. Ein Vergleich der Phasen-Kontrastbilder mit den Fluoreszenzsignalen für die DNA (gefärbt mit dem Farbstoff Hoechst 33258) legt dar, daß P50 eine starke Kernanfärbung zeigt. Der Bereich der Nucleoli bleibt dabei ausgespart (vergleiche B und C). Als Kontrolle für die Lokalisation eines cytoplasmatischen Proteins wurde eine Tubulin-Färbung mit einem monoklonalen anti-Tubulin-Antikörper durchgeführt (D). Der BrdU Antikörper färbt die Zellen an, die sich innerhalb des Inkubationszeitraumes gerade in der S-Phase befinden und neue DNA synthetisieren. Ein Vergleich der P50-Anfärbung (F) mit der BrdU-Anfärbung(G) zeigt, daß die Lokalisation von P50 im Zellkern nicht auf Zellen der S-Phase begrenzt ist.

Die indirekte Immunfluoreszenz von XTH2- und X1-Zellen mit monospezifischen P50-Antikörpern hat die Lokalisation des P50 Proteins im Zellkern gezeigt. Um genauere Aussagen über die Wechselwirkung von P50 mit Bestandteilen des Kern treffen zu können, wurden biochemische Fraktionierungen von Zellen und Zellkernen zur weiteren Charakterisierung herangezogen. Durch verschiedene Extraktions- und Zentrifugationsschritte sollten Aussagen über die exakte Lokalisation des Proteins im Kern gemacht werden.

Für die Untersuchungen wurden proliferierende HeLa- und WAK-Zellen verwendet.

Die Zellen wurden in Acetatpuffer mit Digitonin lysiert. Dabei permeabilisiert Digitonin nur die Cytoplasmamembran, während die Kernmembran erhalten bleibt.

Nach niedrigtouriger Zentrifugation befindet sich das Cytoplasma im Überstand. Die Zellkerne werden mit hypotonem Puffer zum Anschwellen und zur Lyse gebracht und ebenfalls niedrigtourig abzentrifugiert (modifiziert nach Hancock, 1974). Der Überstand enthält das Nuclesol mit den löslichen Kernproteinen. Die verbleibenden Kernstrukturen wurden mit NP40-haltigem hypotonem Puffer gewaschen, nach niedrigtouriger Zentrifugation enthält das verbleibende Pellet einen Komplex aus Chromatin und Kernmatrix (vgl. 3.4.6)

Abb. 7 zeigt, daß sich P50 in beiden untersuchten Zelltypen zu etwa 40% in der nucleosolischen und zu etwa 60% in der NP40 Fraktion befindet. Gleiche Ergebnisse wurden durch Fraktionierungen von X1-und XTH2-Zellen erhalten (Daten nicht gezeigt). Das Versuchsergebnis läßt auf ein lösliches Kernprotein schließen, das möglicherweise membranassoziiert vorliegt oder mit Kernstrukturen wechselwirkt.

Die gleichen Proben wurden zur Kontrolle der Fraktionierung mit Antikörpern von Proteinen untersucht, deren Lokalisation bekannt ist. Erwartungsgemäß konnte gezeigt werden, daß Tubulin in der Cytoplasma-Fraktion vorliegt. Die gewonnenen Kernfraktionen (Nucleoplasma, NP40-Wash und Chromatin) wurden mit Mcm4-Antikörpern überprüft. Mcm4 liegt in Übereinstimmung mit Burkhart (1995) an Chromatin gebunden und in löslicher Form vor.

4 Ergebnisse 36

Abb. 7: Zellfraktionierung

HeLa-Zellen (A) und WAK-Zellen (B) wurden fraktioniert und jeweils gleiche Anteile der Fraktionen in der SDS-PAGE aufgetrennt. Links: Dreistufiges Polyacrylamidgel (15%, 10%, 7,5%) gefärbt mit Coomassie-Blau, rechts: Immunofärbung und prozentuale Verteilung der Proteinmengen auf die Fraktionen. Spur 1: Gesamtzellextrakt von 1,5 x10 ⁶ Zellen, Spur 2: Cytoplasma, Spur 3: Nucleoplasma, Spur 4: NP40-Waschung, Spur 5: ”Chromatin”-Pellet, rechts unten: Immunofärbung mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern, Mcm4- und Tubulin-Antikörpern.

4 Ergebnisse 37

Die bisher dargestellten Befunde zeigen, daß P50 nicht an Chromatin gebunden vorliegt. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, daß P50 nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus kurzfristig an Chromatin gebunden ist. Um dies zu überprüfen, wurden HeLa-Zellen durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und Chromatin (modifiziert nach Hancock, 1974) wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus präpariert. Das Ergebnis ist in Abb. 8A dargestellt und zeigt, daß P50 in keiner Phase des Zellzyklus an Chromatin gebunden vorliegt. Die gleichen Proben wurden zur Kontrolle mit monospezifischen Mcm4-Antikörper untersucht. Von dem Mcm4 Protein ist bekannt, daß es von der späten M-Phase bis zu Beginn der S-Phase an Chromatin assoziiert ist, und dann sich dann sukzessiv vom Chromatin ablöst (Ritzi et al., 1998). Als Kontrolle wurde zusätzlich Gesamtprotein von HeLa-Zellen aufgetragen ("total cells"). Die Coomassiefärbung verdeutlicht, daß in allen Präparaten gleiche Mengen an Core-Histonen enthalten sind (siehe Abb. 8A unten). Dies zeigt, daß gleiche Proteinmengen analysiert wurden.

Um zu untersuchen, ob P50 an andere Strukturen des Kerns assoziiert ist, wurde eine Kernmatrixpräparation (Romig et al., 1992) durchgeführt. Von den Fraktionen wurde jeweils die einem Zehntel einer HeLa-Platte entsprechende Menge in der SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und im Immunoblot mit monospezifischen P50-Antikörpern untersucht (vgl. Abb. 8 B). P50 liegt in der Fraktion der löslichen Kernproteine vor. Damit unterscheidet es sich vom SAF-A Protein, das an die Kernmatrix gebunden vorliegt und hier als Kontrolle mit monospezifischen SAF-A Antikörpern untersucht wurde. Die Hälfte der Gesamtmenge von SAF-A liegt salzresistent mit den Kernstrukturen assoziiert vor (Fackelmayer and Richter, 1994).

Diese Befunde deuten darauf hin, daß P50 ein lösliches Kernprotein ist, das nicht an Chromatin oder Kernmatrixstrukturen gebunden ist.

Abb. 8: P50 ist ein lösliches Kernprotein, das nicht an Chromatin oder die Kernmatrix gebunden

Abb. 8: P50 ist ein lösliches Kernprotein, das nicht an Chromatin oder die Kernmatrix gebunden

Im Dokument Molekularbiologische Untersuchungen über ein neues Cytoskelett-verwandtes Protein (Seite 40-0)