Das CDC6 Gen wurde erstmals bei genetischen Studien der Zellzyklus-Progression in S.cerevisiae identifiziert (Hartwell, 1973). Bereits 1976 wurde vermutet, daß Cdc6 einen Faktor darstellt, der für die Initiation der DNA-Replikation notwendig ist (Hartwell, 1976). Mutationen im CDC6-Gen führen zu einer hohen Verlustrate von Minichromosomen, die jedoch durch das Einfügen multipler Origins in das Minichromosom supprimiert werden können (Hogan and Koshland, 1992) Im Labor von Paul Nurse wurde das zu CDC6 homologe Gen CDC18 der Spalthefe
1 Einleitung 6
Schizosaccharomyces pombe untersucht (Kelly et al., 1993; Nishitani and Nurse, 1995).
Die Expression von Cdc18 führt zur Initiation der DNA-Replikation, während der Abbau dieses Proteins für die Vermeidung einer weiteren DNA-Replikationsrunde und für das Eintreten in die Mitose wichtig ist.
In Saccharomyces cerevisiae konnte durch in vivo „footprinting“ Analysen gezeigt werden, daß sich der Pre-Replikationskomplex nicht ausbilden kann, wenn ScCdc6 abwesend oder inaktiv ist (Cocker et al., 1996; Santocanale and Diffley, 1996).
Demzufolge scheint Cdc6 direkt in den Aufbau des Proteinkomplexes am Origin involviert zu sein. Cdc6 wird in der frühen G1-Phase durch den ORC-Komplex auf das Chromatin rekrutiert. Das Hefe Cdc6 Protein wiederum scheint als Beladungsfaktor des Chromatins mit den Mcm-Initiatorproteinen zu fungieren (Perkins and Diffley, 1998;
Weinreich et al., 1998). Der Übergang von der G1 zur S-Phase wird durch die Aktivierung von Proteinkinasen wie z.B. die Cdc7/Dbf4 Kinase und S-Phase fördernde Cyclin-abhängige Kinasen koordiniert (Dutta and Bell, 1997; Johnston et al., 1999;
Wuarin and Nurse, 1996). Der Übergang ist durch eine Ablösung des Cdc6 Proteins vom Chromatin und einen durch Cdc45 vermittelten Aufbau der DNA-Replikationsfaktoren gekennzeichnet. Durch die Dissoziation von Cdc6 zu Beginn der DNA-Replikation wird eine erneute Bindung der Mcm-Proteine an bereits repliziertes Chromatin verhindert und somit auch eine DNA-Rereplikation. In Hefe konnte gezeigt werden, daß Cdc6 ein Substrat der Cyclin-abhängigen Proteinkinase Cdc28 ist (Elsasser et al., 1996).
Ein prinzipiell ähnliches Schema für den Aufbau des Initiationskomplexes der DNA-Replikation wurde durch biochemische Studien im Xenopus-System abgeleitet. Das Xenopus laevis CDC6 Gen wurde über Homologie zu den CDC6 Genen in S. cerevisiae und S. pombe identifiziert (Coleman et al., 1996). Im Xenopus laevis zellfreien Eiextraktsystem wurde nachgewiesen, daß Xenopus Cdc6 nur an das Chromatin binden kann, das bereits ORC Proteine trägt. Die Bindung von Cdc6 ist nachweislich essentiell für die anschließende Beladung des Chromatins mit XlMcm3 und anderen Mcm-Proteinen (Coleman et al., 1996; Maiorano et al., 2000; Romanowski et al., 1996;
Rowles et al., 1996). Durch Cdc6 Immundepletionsexperimente in Xenopus-Eiextrakt wurde gezeigt, daß XlCdc6 für die Initiation der Replikation von doppelsträngiger DNA notwendig ist, nicht aber für die Replikation von Einzelstrang-DNA. Die Zugabe von rekombinantem XlCdc6 stellt in XlCdc6-depletierten Eiextrakten die Replikations-fähigkeit wieder her. Dies ist jedoch nicht möglich, wenn das Protein nach dem Aufbau des Chromatins zu intakten Kernen zugegeben wird. Dies läßt vermuten, daß Cdc6 oder ein Protein, welches für die Funktion von Cdc6 notwendig ist, nicht die Kernmembran passieren kann. Nach dem Zusammenbau des Zellkerns ist XlCdc6 mit Chromatin assoziiert, während es sich nach der Initiation der DNA-Replikation vom Chromatin ablöst. Im Gegensatz zu ScCdc6 wird XlCdc6 nach der Initiation der DNA-Replikation nicht abgebaut sondern in Vesikeln relokalisiert (Coleman et al., 1996).
7
2 Zielsetzung
Das Protein Cdc6 spielt bei der Initiation der DNA-Replikation zusammen mit den Orc-Proteinen und den Mcm-Orc-Proteinen eine entscheidende Rolle. Das zellfreie Xenopus laevis Eiextrakt-System bietet sich für Replikationsstudien an, da die oben genannten Proteine hier in großen Mengen vorliegen. Im Xenopus-System wird die zugesetzte DNA in Zellkerne assembliert und unter Beteiligung sämtlicher Zellzyklus-kontrollmechanismen semikonservativ repliziert.
Ausgangspunkt dieser Arbeit war deshalb die Absicht einen spezifischen Antikörper gegen das Xenopus laevis Cdc6 Protein zu gewinnen. Dazu wurde ein Peptidantikörper gegen eine konservierte Peptidsequenz von 12 Aminosäuren des Saccharomyces cerevisiae Cdc6 Proteins entwickelt. Dieser Antikörper war jedoch nicht für Cdc6 spezifisch, sondern detektierte in Immunoblotstudien ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht. Um festzustellen, ob es sich dabei um ein mögliches Cdc6-Homolog handelte, sollte eine Xenopus laevis Ovarien-cDNA-Bibliothek mit diesem Peptidantikörper durchmustert werden, und die zu diesem Protein kodierende cDNA sollte isoliert werden.
Das Ziel der weiteren Studien war es nun, die bislang unbekannte cDNA und die Funktion des entsprechenden Genproduktes näher zu untersuchen. Hierbei sollten zunächst bakteriell exprimierte Teilfragmente erzeugt werden, um Werkzeuge zu erhalten, mit denen das von der cDNA kodierte Protein biochemisch charakterisiert werden konnte. Die Untersuchung dieses Genprodukts und seiner Funktion in der Zelle stand bei allen Studien im Vordergrund.
Es sollte untersucht werden, wo das Protein in der Zelle lokalisiert ist. Dazu sollten Methoden der Immunfluoreszenz und der Zellfraktionierung angewandt werden. In diesem Zusammenhang sollte die Frage geklärt werden, wie und an welche Strukturen in der Zelle das Protein gebunden ist.
Weiterhin sollte die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Proteinen untersucht werden. In einem „Two Hybrid“-Ansatz sollten Interaktionspartner identifiziert werden, um einen Hinweis auf eine mögliche Funktion zu erhalten.
Expressionsstudien sollten Antwort auf die Frage geben, wann und wo das Protein exprimiert wird. Dies sollte Rückschlüsse erlauben, ob das Protein reguliert exprimiert wird oder ob es sich um ein Haushaltsgen handelt.
2 Zielsetzung 8
Ein weiterer Teilaspekt war herauszufinden, ob das Protein in der Evolution konserviert worden ist und ob es Homologe in anderen eukaryontischen Systemen (z.B. Mensch, Maus oder Hefe) gibt. Diese sollten gegebenenfalls identifiziert und analysiert werden.
Durch eine detaillierte Beschreibung der molekulargenetischen und biochemischen Eigenschaften des Proteins sollen Rückschlüsse auf die mögliche Funktion in der Zelle geschlossen werden.
9