Sonja Steppan
Molekularbiologische Untersuchungen
über ein neues Cytoskelett-verwandtes Protein
Dissertation
Universität Konstanz Fakultät für Biologie
Lehrstuhl für Molekulare Genetik
Molekularbiologische Untersuchungen über ein neues Cytoskelett-verwandtes Protein
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz
vorgelegt von Sonja Steppan
Konstanz, im November 2000
Dissertation der Universität Konstanz 1. Referent: Prof. Dr. Rolf Knippers 2. Referent: Prof. Dr. Dieter Malchow
Tag der mündlichen Prüfung: 16. Februar 2001 Prüfer: Prof. Dr. Rolf Knippers
Prof. Dr. Klaus Schäfer PD Dr. Dr. Thomas Hartung
In Dir muß brennen, was du in anderen entzünden willst.
Augustinus, Aurelius (354-430)
Die vorliegende Dissertation wurde von der Friedrich-Naumann-Stiftung mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie gefördert.
Die in dieser Arbeit erstmalig beschriebene cDNA-und Protein-Sequenz ist in der EMBL/Genbank unter folgender „accession number“ veröffentlicht:
• AF166261 Xenopus laevis p170 (Sojo)
Veröffentlichungen zu Teilen dieser Arbeit sind in Vorbereitung:
• Steppan, S., Danielson P., Brinkmann H. , und Strausfeld, U. (2001). Structure of Human p170- a Novel Gene Conserved in Vertebrates and Related to Cytoskeleton Associated Proteins.
• Steppan, S., Kapitza T., und Strausfeld, U. (2001)
Molecular Characterization of a novel 170 kDa Protein in Xenopus laevis
Die vorliegende Dissertation wurde in der Zeit von April 1997 bis September 2000 in der Fakultät für Biologie der Universität Konstanz am Lehrstuhl für Molekulare Genetik von Prof. Dr. Rolf Knippers angefertigt. Vom Januar bis März 2000 wurde ein Teil der Versuche am Scripps Research Institute, San Diego, USA im Labor von Prof. Dr. Joel Gottesfeld durchgeführt.
Herrn Prof. Dr. Rolf Knippers danke ich für seine Förderung, sein stetiges Interesse am Fortschreiten dieser Arbeit, seine Fähigkeit zu motivieren sowie seine ständige Diskussionsbereitschaft.
Bei Prof. Dr. Joel Gottesfeld bedanke ich mich für die Möglichkeit meines Forschungsaufenthaltes am Scripps Research Institute und die herzliche Aufnahme in sein Labor.
Diese Dissertation wurde für den Zeitraum von April 1997 bis März 2000 von der Friedrich-Naumann-Stiftung gefördert. Ich bin der Stiftung aufgrund dieser Förderung und dem begleitenden Programm zu großem Dank verpflichtet. Frau Marie Luise Wohlleben danke ich für die herzliche Betreuung während meiner Stipendiatenzeit.
Bei der hier vorgelegten Arbeit haben mich zahlreiche Menschen unterstützt, die ich im folgenden nennen möchte:
Ich bedanke mich bei Dr. Ulrich Strausfeld für die Zusammenarbeit, seine stetige Hilfsbereitschaft, seine Diskussionsfreudigkeit und seine Korrekturvorschläge für das Manuskript. Thomas Kapitza möchte ich meinen Dank aussprechen für die Unterstützung bei zahlreichen Experimenten und sein großes experimentelles Geschick.
Bei Dr. Marco Findeisen bedanke ich mich für gemeinsame Laborzeiten. Dietmar Funck danke ich für die geduldige Einführung in den Laboralltag während der ersten Monate.
Großes Dankeschön geht an Dr. Frank Fackelmayer für die kompetente Einführung in zahlreiche Techniken, seine stets uneingeschränkte Zeit für die Auseinandersetzung mit wissenschaftlichen Fragen, viele wertvolle Denkanstösse und die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Martina Baack danke ich für viele technische Ratschläge und ihre enorme Hilfsbereitschaft. Dr. Andreas Richter danke ich für sein Interesse an meiner Arbeit, seine Hilfsbereitschaft ausgedrückt unter anderem durch zahlreiche Diskussionen und viele kreative Vorschläge. Sandra Kreitz danke ich für ihre Hilfsbereitschaft in kritischen Situationen.
Dr. Kai Treuner und Dr. Vassilios Alexiadis danke ich besonders für die intensive und kritische Auseinandersetzung mit dem ersten Manuskript, die herzliche Unterstützung aus San Diego auf die ich mich immer verlassen konnte und gemeinsame Konstanzer Laborzeiten.
Johannes Graumann danke ich für die tolle Zusammenarbeit, seinen engagierten Einsatz bei diesem Projekt, für viele stimulierende Diskussionen und die gemeinsame Begeisterung für „Sojo“. Ingo Scholten danke ich für seine große Hilfsbereitschaft und seinen ansteckenden Humor in allen Situationen. Carmen Eckerich danke ich für ihre Freundschaft und ihre grenzenlose Hilfsbereitschaft. Bei Melanie Zimmermann bedanke ich mich sehr herzlich für die gemeinsam erlebte Euphorie bei der Entdeckung des hier beschriebenen Proteins und ihre Mitarbeit an diesem Projekt sowie die von ihr so zügig durchgeführten Abschlußkorrekturen des Manuskriptes.
Dr. Henner Brinkmann danke ich herzlich für die mir entgegengebrachte Diskussionsbereitschaft und seine Zeit bei der Phylogenie-Analyse.
Dr. Liliane Dickinson vom Scripps Research Institute danke ich für die kompetente Betreuung während meiner Zeit im „Gottesfeld lab“, die für mich sehr lernintensiv war.
Dank geht auch an Laura Neely für ihre große Hilfsbereitschaft im Labor und Dank geht an Kathy Sterling für ihre Hilfe in allen Lebensbereichen während meiner Zeit in San Diego.
Ein großes Dankeschön geht ebenfalls an Patria Danielson vom Scripps Research Institute für die erfolgreiche Zusammenarbeit bei dem Sequenzpuzzle und ihre großartige Unterstützung durch einen intensiven email Kontakt nach meiner Rückkehr aus den USA.
Dr. Marion Schmidt-Zachmann vom Deutschen Krebsforschungszentrum danke ich herzlich für sehr hilfreiche Anregungen und ihre freundliche Unterstützung.
Allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe danke ich für ihre stetige Hilfsbereitschaft, viele nette Worte und das sehr gute Arbeitsklima.
Meinem Biologie-Leistungskurslehrer Dr. Ruthard Friedel möchte ich ebenfalls meinen Dank aussprechen. Seine lebhaften, Begeisterung vermittelnde Unterrichtsstunden und die von ihm mit uns durchgeführten Drosophila-Kreuzungsexperimente waren für mich prägende Erlebnisse. Sie haben zweifellos den Grundstein für mein großes Interesse an der Molekularbiologie und für diese Arbeit gelegt.
Meinen Eltern und meiner Schwester Sandra danke ich für Ihre uneingeschränkte liebevolle Unterstützung aus 400 km Entfernung und besonders dafür, daß sie die Höhen und Tiefen dieser Arbeit stets miterlebt und nachempfunden haben.
Großer Dank geht an Sven für seine unendliche Geduld, seine stetige Unterstützung in allen meinen Entscheidungen, seinen Zuspruch und Beistand, aus dem ich immer wieder Kraft geschöpft habe.
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
Abbildungen- und Tabellenverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Das Modellsystem Xenopus laevis. ...1
1.1.1 Oogenese, Oocytenreifung und frühe Embryogenese in Xenopus laevis. 2 1.1.2 Xenopus laevis Sequenzierungsprojekte ... 3
1.2 Der Zellzyklus einer eukaryontischen Zelle ... 4
1.3 Die Initiation der DNA-Replikation ... 4
1.4 Das Replikationsprotein Cdc6 ... 5
2 Zielsetzung ... 7
3 Material und Methoden ... 9
3.1 Material ... 9
3.2 Allgemeine Methoden... 10
3.3 Molekulargenetische Methoden... 11
3.3.1 DNA-Präparationen ... 11
3.3.2 RNA-Präparationen ... 11
3.3.3 Durchmustern („Screening“) von cDNA-Bibliotheken ... 11
3.3.4 Transformationen... 12
3.3.5 DNA-Sequenzierung... 12
3.3.6 Konstruktion von Expressionsklonen ... 13
3.3.7 „Northernblot“ ... 14
3.3.8 PCR-“Screening” von cDNA-Bibliotheken... 14
3.3.9 „RACE“- Rapid amplification of cDNA ends-System... 15
3.3.10 Transfektionen von eukaryontischen Zellen... 16
3.3.11 Hefe „Two Hybrid“-System ... 17
3.4 Proteinbiochemische Methoden ...11
3.4.1 Expression und Reinigung von rekombinaten Protein im Expressionssystem pRSET...18
3.4.2 Antikörperproduktion in Kaninchen ...18
3.4.3 Präparation von monospezifischen Antikörpern ...19
3.4.4 ELISA...19
3.4.5 Antikörperkonzentrationen für Immunoblots...19
3.4.6 Zellfraktionierung...20
3.4.7 Chromatinpräparation modifiziert nach Hancock (1974) ...21
3.4.8 Kernmatrixpräparatation ...21
3.4.9 Immunpräzipitation ...21
3.4.10 Immunfluoreszenz ...22
3.4.11 Glycerin-Gradientenzentrifugation ...22
3.4.12 Synchronisation von HeLa-Zellen und Xenopus X1 Zellen durch doppelten Thymidinblock ...22
3.4.13 Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase...23
3.4.14 Deglycosylierung von Xenopus laevis-Eiextrakt mit PNGase F...23
3.4.15 Luciferase-Assay...23
3.4.16 β-Galactosidase Assay ...24
3.4.17 In vitro-Translation ...24
3.4.18 Herstellung von Zellextrakten aus Organen von Xenopus laevis...24
3.4.19 In vitro Befruchtung von Xenopus laevis...24
3.4.20 Proteinreinigung aus Xenopus laevis Metaphase-Eiextrakt ...25
3.4.21 Isolierung von schweren und leichten Membranen aus Xenopus laevis Eiextrakt ...26
4 Ergebnisse ...27
4.1 Herstellung von Antikörpern gegen das Xenopus laevis Cdc6 Protein...27
4.1.1 Auswahl von homologen Cdc6 Peptid-Sequenzen als Antigen für einen Peptidantikörper ...27
4.1.2 Die Spezifität der P50-Peptidantikörper ...29
4.2 Biochemische Charakterisierung von P50 ...34
4.2.1 Intrazelluläre Lokalisation von P50 ...34
4.2.2 Untersuchungen von P50 im Zellzyklus ...40
4.2.3 Das Sedimentationsverhalten von P50...41
4.3 Die cDNA für p170 ...45
4.3.1 Klonierung und Sequenzierung von Klon C ...45
4.3.2 Bestimmung der Länge der mRNA und Vervollständigung der cDNA...46
4.3.3 Analyse der Xenopus laevis p170 cDNA und der kodierten
Aminosäuresequenz ... 49
4.4 Homologe Proteine zu p170 ... 54
4.5 Bakterielle Expression von p170-Teilfragmenten und Entwicklung eines polyklonalen anti-p170-Antiserums ... 61
4.5.1 Expression und Reinigung von p170-Teilfragmenten ... 61
4.5.2 Charakterisierung der anti-p170-Antikörper ... 63
4.6 Expressionsstudien von p170... 69
4.6.1 Expression von p170 in Xenopus laevis Oocyten, Hoden und adulten Zellen ... 69
4.6.2 Gewebespezifische Expression von p170... 70
4.6.3 Nachweis einer p170 spezifischen RNA in verschiedenen Geweben durch Northernblot-Analysen ... 72
4.6.4 Entwicklungsspezifische Expression von p170 ... 73
4.7 Biochemische und zellbiologische Charakterisierung von p170 ... 76
4.7.1 Intrazelluläre Lokalisation von p170 ... 76
4.7.2 Sedimentationsverhalten von p170 und p58 ... 80
4.8 Reinigung von p170 aus Xenopus laevis Eiextrakt... 84
4.8.1 Mengenverhältnisse und Stabilität von p170 in Eiextrakt ... 84
4.8.2 Chromatographische Reinigung von p170 ... 86
4.9 Suche nach p170 Interaktionspartnern im Hefe „Two Hybrid“-System ... 88
4.9.1 Konstruktion des p170-Köder-Proteins für das „Two Hybrid“-System und Analyse seiner biologischen Aktivität ... 88
4.9.2 Transfektionen von 293-Zellen und Luciferase-Reporter-Assays... 92
5 Diskussion... 97
5.1 Die verwendeten Antikörper und ihre Spezifität ... 97
5.2 Das P50 Protein ... 100
5.3 Biochemische und zellbiologische Eigenschaften von p170 ... 101
5.3.1 Die Lokalisation von p170 und p58... 101
5.3.2 Das Sedimentationsverhalten von p170 und p58... 101
5.3.3 Die Expression von p170 und p58 ... 102
5.3.4 Reinigung von p170... 102
5.3.5 Transaktivierende Eigenschaft des p170 Carboxy-Terminus in Hefe .. 102
5.4 In welchem Verhältnis stehen p58 und p170? ... 104
5.5 p170 hat Ähnlichkeiten zu Cytoskelett assoziierten Proteinen... 107
5.5.1 BLAST-„Search“- Ergebnisse und Aminosäurezusammensetzung
von p170 ...107
5.5.2 Analysen der p170 Proteinsequenz mit derPFAM-Datenbank liefern Ähnlichkeiten zur ERM-Protein Familie ...110
5.5.3 Vergleich von p170 mit 3D-Strukturen von bekannten Proteinen ...111
5.6 p170 ist ein in der Evolution konserviertes Protein ...111
6 Zusammenfassung ...113
7 Anhang...115
7.1 Xenopus laevis p170 cDNA- und Proteinsequenz...115
7.2 Homo sapiens p170 cDNA- und Proteinsequenz...122
7.3 Mus musculus p170 cDNA- und Proteinsequenz...126
7.4 Sequenzen und Lage der zu p170 homologen EST Klone...131
7.5 Aminosäurevergleich X.l.p170/ USO1 ...133
7.6 Aminosäurevergleich X.l.p170/ „Heavy Chain Myosin fast skeletal muscle, embryonic, Chicken“ ...135
8 Literaturverzeichnis ...139
Abkürzungen
aa amino acids
AS Aminosäuren Abb. Abbildung AK Antikörper
ARS autonom replizierende Sequenz ATP Adenin-Triphosphat bp Basenpaar
B. t. Bos taurus
BSA Rinderserumalbumin
°C Grad Celsius
CAT Katalase CDC cell division cycle
CdK cyclin dependent kinase, Cyclin-abhängige Kinase cDNA copy DNA
CHCl3 Chloroform CHO chinese hamster ovaries
dA didesoxy Adenin
DMSO Dimethylsulfoxid DOC Natrium-Deoxycholat dT desoxy-Thymidin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ERM Ezrin, Radixin und Moesin Protein Familie EST expressed sequence tags
EtOH Ethanol
FCS fetal calf serum, fötales Kälberserum g Erdbeschleunigung h Stunde(n)
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonsäure
H.s. Homo sapiens
IP Immunpräzipitation kb KiloBasenpaar kDa KiloDalton
KLH Keyhole limpet hemocyanin (m)M (milli)Molar
M Metaphase Eiextrakt
MCM minichromosome maintenance MeOH Methanol
µ Mikro (10 –6)
min Minute
ml Milliliter
mRNA messanger Ribonukleinsäure
M.m. Mus musculus
n Nano (10 –9)
NIH National Institutes of Health, USA NP 40 Nonidet P 40
NTP Nukleotid-Triphosphate (ATP, GTP, CTP, UTP)
OD optische Dichte
ORC Origin recognition complex ORF Open reading frame
RACE Rapid amplification of cDNA ends
rRNA ribosomale RNA
mRNA messanger RNA
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung PCR Poly chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
RNA Ribonukleinsäure
rpm Rounds per minute, Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur
S Synthese
SAF-A Scaffold attachment factor A
SDS Sodium dodecylsulfate, Natrium-Dodecylsulfat
s.u. siehe unten
Tab. Tabelle
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan Tween20 Polyoxyethylen-Sorbitan Monolaurat
X.l. Xenopus laevis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Oogenese, Oocytenreifung und frühe Embryogenese in Xenopus laevis 2 Abb. 2: Homologe Regionen des Cdc6 Proteins 28
Abb. 3: ELISA: Immunisierung mit P50 29
Abb. 4: Monospezifische P50-Peptidantikörper erkennen
ein 60 kDa Protein, das sich von Cdc6 unterscheidet 31 Abb. 5: P50 ist unter Eukaryonten konserviert 32
Abb. 6: Lokalisation von P50 in Xenopus laevis-Zellen 34
Abb. 7: Zellfraktionierung 36
Abb. 8: P50 ist ein lösliches Kernprotein, das nicht an Chromatin
oder die Kernmatrix gebunden ist 37
Abb. 9: Magnesiumzugabe verändert das Kernextraktionsverhalten von P50 39 Abb. 10: Die P50 Proteinmenge bleibt über den Zellzyklus konstant 41 Abb. 11: Sedimentationsverhalten von P50 in X.l. Eiextrakt 42 Abb. 12: Sedimentationsverhalten von P50 unter Einfluß von Salz und RNase 44 Abb. 13: Durchmustern (“Screening”) einer
Xenopus laevis Ovarien-cDNA-Bibliothek 45 Abb. 14: Klon C stellt ein Teilfragment eines längeren Leserasters dar 47
Abb. 15: Überlappungsbereich von Klon C („Screening“-Produkt)
und Klon N (RACE PCR-Produkt) 49
Abb. 16: Kodierungspotential der p170 cDNA 51
Abb. 17: p170 verfügt über Präferenzen zu Ausbildung von Coiled Coils 52 Abb. 18: Lage der homologen EST-Klone im p170 Carboxy-Terminus 55 Abb. 19: Konservierter Proteinsequenzbereich im p170 Carboxy–Terminus 55 Abb. 20: Chromosomale Lokalisation und Genstruktur
des humanen p170 Gens 56
Abb. 21: Alignment von p170-Homologen 60
Abb. 22: Lage der Expressionsfragmente 61
Abb. 23: Expression und Reinigung von rekombinanten p170-Teilfragmenten 62
Abb. 24: Die Spezifität der p170-Antikörper 64
Abb. 25: Immunpräzipitation mit p170-Antikörpern 67 Abb. 26: Nachweis von p170 in verschiedenen eukaryontischen Organismen 68 Abb. 27: Expression von p170 in adulten Zellen
und Organen des Reproduktionstraktes 70
Abb. 28: Organspezifische Expression von p170 71
Abb. 29: p170 wird reguliert exprimiert 73
Abb. 30: Expression von p170 in Embryonalstadien 74 Abb. 31: Immunfluoreszenz- Nachweis von p170/ p58 in XTH2-Zellen 76
Abb. 32: Lokalisation von p170 in XTH2-Zellen 77
Abb. 33: p58 ist mit schweren Membranen aus X.l.Eiextrakt assoziiert 79
Abb. 34: Sedimentation von p58 und p170 in der
Glyceringradienten-Zentrifugation 81
Abb. 35: Sedimentationseigenschaften von p58 83
Abb. 36: Abschätzung der Kopienzahl von p170 und p58 in Xenopus laevis
Eiextrakt und WAK-Zellen sowie Stabilitätsuntersuchungen 85 Abb. 37: Reinigung von p170 aus Xenopus laevis Eiextrakt 87 Abb. 38: Klonierung des Carboxy-Terminus von p170 in pEG202 und
Expression des Fusionsproteins in Hefe 89 Abb. 39: Das transkriptionelle Aktivitätsprofil des p170 C/LexA
Fusionsproteins 91
Abb. 40: Luciferase Assay 93
Abb. 41: Übersicht über die verwendeten Antikörper 98 Abb. 42: In welchem Verhältnis stehen p58 und p170 zueinander? 104
Abb. 43: Blast Search 107
Abb. 44: Große Bereiche von p170 (hier humanes p170) weisen
Domänenähnlichkeiten zur ERM-Familie auf 111
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Für PCR-Klonierungen verwendete Primer
Tabelle 2: PCR Bedingungen für cDNA-Bibliothek „Screening“
Tabelle 3: PCR Bedingungen für RACE -PCR Tabelle 4: Verwendete RACE Primer
Tabelle 5: Verwendete Antikörper und ihre Konzentrationen Tabelle 6: Reinigungschritte für p170
Tabelle 7: Aminosäureaustausche im Überlappungsbereich Tabelle 8: Aminosäurezusammensetzung von p170
Tabelle 9: Leucin Zipper Motive
Tabelle 10: Mögliche Modifikationsstellen in p170
Tabelle 11: Identifizierte homologe ESTs (Expressed Sequence Tags) Stand 10/2000 Tabelle 12: Intron-Exon Übergänge im humanen p170 Gen
Tabelle 13: Aminosäure-Zusammensetzungen im Vergleich Tabelle 14: p170 spezifische Antikörper
Tabelle 15: β-Galactosidase-Aktivitäten Tabelle 16: Maus EST-Klone
1 Einleitung
1.1 Das Modellsystem Xenopus laevis
Viele Eigenschaften des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis haben diesen Organismus zu einem wichtigen Modellsystem für die molekularbiologische Forschung werden lassen. Die Vorteile dieses Systems beruhen im wesentlichen auf der enormen Größe der Eier. Diese Zellen haben einen Durchmesser von 1.2 mm und können mit minimaler technischer Ausstattung untersucht werden. Ein Xenopus Ei enthält eine Proteinmenge, die mit der Menge von 105 bis 106 somatischen Zellen vergleichbar ist.
Aufgrund ihrer Größe sind die Eier einfach zu manipulieren und bieten sich für Mikroinjektionsexperimente an. Studien zur Embryonalentwicklung können aufgrund der einfach zu identifizierenden Entwicklungsstadien und der leichten Manipulierbarkeit der Eier besonders gut durchgeführt werden. Die Haltung der Krallenfrösche in Aquarien ist darüberhinaus kostengünstig und denkbar einfach (Prigent, 1999). Die Eiablage von Xenopus laevis ist nicht jahreszeitlich gebunden sondern kann durch Hormoninjektion jederzeit induziert werden (Amaya et al., 1998).
In befruchteten Xenopus laevis-Eiern findet in der frühen Entwicklung keine Transkription statt (Newport and Kirschner, 1982). In den ersten sieben Stunden nach der Befruchtung durchläuft das Erbmaterial in Xenopus Eiern elf Runden semikonservativer DNA-Replikationen. Das bedeutet, daß sämtliche Faktoren, die für die frühe Entwicklung benötigt werden, bereits maternal vorliegen. Xenopus laevis Eiextrakte stellen somit eine wichtige Quelle für Faktoren dar, die an der DNA- Replikation beteiligt sind (Mechali et al., 1983).
Das Fehlen einer nennenswerten Transkriptionsaktivität in der frühen Embryogenese führte zur Entwicklung von experimentellen Ansätzen, bei denen die endogene mRNA durch Antisense-Oligonucleotide dem Translationsprozess entzogen wird oder eine modifizierte mRNA in die befruchtete Eizelle eingeführt wird. Somit eignet sich die Oocyte, das unreife Ei, auch gut für Translationsstudien.
Zellfreie Xenopus laevis Eiextrakte können in vitro manipuliert werden. Ein Protein von Interesse kann durch Immunpräzipitation aus dem Extrakt entfernt werden und durch ein rekombinantes, eventuell mutiertes Protein ersetzt werden. Diese experimentellen Ansätze eröffnen Möglichkeiten die Funktion eines Proteins näher zu charakterisieren.
1 Einleitung 2
Xenopus laevis hat neben wichtigen Erkenntnissen zu den Grundlagen der DNA- Replikation und der Transkription auch wesentlich zum Verständnis von zahlreichen zellbiologischen und biochemischen Prozessen in der Zelle wie zum Beispiel der DNA- Reparatur, dem Kern-Zusammenbau, dem Aufbau von Ionenkanälen der Chromosomenkondensation und dem Spindelaufbau beigetragen (Smythe and Newport, 1991; Dascal, 1987).
1.1.1 Oogenese, Oocytenreifung und frühe Embryogenese in Xenopus laevis
Eine Xenopus Oocyte beginnt ihr Zellwachstum mit einer Größe, die der einer somatischen Zelle gleicht. Zu Beginn eines meiotischen Zellzyklus durchläuft die Oocyte eine DNA-Replikationsrunde und tritt dann in eine meiotische Prophase ein. In den nächsten Monaten befindet sich die Oocyte in einer G2-ähnlichen Wachstumsphase.
In dieser Phase ist die Kernhülle (bzw. die Germinalvesikelhülle) intakt und das Chromatin teilweise dekondensiert.
Abb. 1: Oogenese, Oocytenreifung und frühe Embryogenese in Xenopus laevis
Dargestellt ist die Entwicklung einer Oocyte bis zur Befruchtung und den ersten Embryonalstadien.
Nähere Einzelheiten siehe Text (Ferrell, 1999).
Ist die Oocyte vollständig ausgewachsen (dies entspricht dem in Abb. 1 dargestellten Dumont Stadium VI), tritt sie in ein G2-arretiertes Stadium ein. Oocyten, die sich im Stadium VI befinden, sind sehr große Zellen mit Durchmessern von bis zu 1.3 mm und einem intrazellulärem Volumen von etwa 1 µl. Dies entspricht dem millionenfachen Volumen einer typischen somatischen Zelle. Über die Hälfte des Volumens einer Oocyte besteht aus Eidotter, der in der hell pigmentierten vegetalen Hälfte der Oocyte
1 Einleitung 3
konzentriert ist. Der Eidotter dient als Nahrungsquelle für die heranwachsende Kaulquappe. Der verbleibende Rest der Oocyte besteht aus Cytoplasma und Nucleoplasma. Eine einzige Oocyte enthält ca. 25 µg cytoplasmatische Proteine. Der riesige Kern der Oocyte, der Germinal-Vesikel, hat einen Durchmesser von 300-400 nm und liegt in der dunkel pigmentierten animalen Hemisphäre. Die unreife Oocyte kann für lange Zeit in dem G2-artigem Stadium verharren oder durch Progesteron in die Reifungsphase überführt werden. Das Steroidhormon Progesteron wird von Follikelzellen synthetisiert und entlassen. Die reifende Oocyte tritt dann in die Meiose I ein, der Germinal-Vesikel bricht zusammen („germinal vesicle breakdown“ (GVBD)) und die Oocyte vervollständigt die erste meiotische Teilung. Das Durchlaufen der Meiose I ist anhand eines weißen Flecks im animalen Pol zu verfolgen, der durch eine Umverteilung der kortikalen Pigmentkörner zustande kommt. Die Oocyte tritt anschließend in die Meiose II ein, ohne eine Interphase zu durchlaufen und arretiert dann in der Metaphase, wo sie bis zur Befruchtung verharrt.
Nach der Befruchtung beginnt die Embryonalentwicklung mit einer Serie schneller Zellzyklen: dadurch wird das Ei in zahlreiche kleine Zellen unterteilt. Diese schnellen Zellzyklen bestehen hauptsächlich aus aufeinanderfolgenden S- und M-Phasen, mit nur kurzen oder fehlenden G1- und G2-Phasen. Es findet keine Transkription statt: alle mRNAs sowie die meisten Proteine, die in diesen frühen Stadien der Embryonalentwicklung benötigt werden, sind maternal bereits vorhanden. Bei diesen frühen Teilungszyklen (sog. Furchungsteilungen) findet kein Zellwachstum statt und alle Zellen des Embryos teilen sich synchron (Ferrel, 1999).
1.1.2 Xenopus laevis Sequenzierungsprojekte
Ein Nachteil des Xenopus laevis Systems ist, daß genetische Studien erschwert werden, da sich das Genom von Xenopus laevis in der Evolution verdoppelt hat und somit tetraploid vorliegt. Außerdem eignet sich Xenopus weniger für Generationsstudien, da es 12 Monate dauert bis die Tier fortpflanzungsfähig sind. Kerntransplantationen und transgenetische Studien wie sie mit Knockout-Mäusen durchgeführt werden, befinden sich für Xenopus tropicalis, einem nahen Verwandten von Xenopus laevis, in der Entwicklung. Dieser Organismus ist im Gegensatz zu Xenopus laevis jedoch diploid (Amaya, 1998). Das Genom von Xenopus laevis ist mit etwa 3.1 x109 bp ähnlich komplex aufgebaut wie das menschliche Genom. Die Anzahl der kodierenden Gene wird auf ca. 100 000 geschätzt. Im Vergleich zu anderen Organismen liegen von Xenopus laevis zum jetzigen Zeitpunkt noch sehr wenig DNA-Sequenzinformationen vor. Ein Hauptziel der Xenopus laevis-Forschung ist es deshalb das exprimierte Genom besser zu verstehen. Dazu werden Genomtechnologien, insbesondere die Sequenzierung von ESTs (expressed sequence tags) und die systematische Sequenzierung von „full- length“ Genen aus cDNA-Bibliotheken herangezogen.
1 Einleitung 4
Zur Zeit gibt es zwei Xenopus laevis Sequenzierungsprojekte. Das erste Sequenzierungsprojekt zielt auf die Aufstellung einer EST-Datenbank, die einmal aus 500 000 Klonen bestehen soll. Die sequenzierten ESTs stammen bislang aus cDNA- Bibliotheken von frühen Stadien, Oocyte, Ei und spätem Gastrula-Stadium. Dieses Projekt soll zunächst mit bereits existierenden Bibliotheken durchgeführt werden und dann durch die Herstellung weiterer Bibliotheken von ausgewählten Stadien vervollständigt werden (Blackshear, 2000). Ein anderes in Planung befindliches Projekt zielt auf die Sequenzierung einer großen Zahl von „full-length“ cDNAs. Dazu werden nur solche cDNA-Bibliotheken zum Einsatz kommen, die vollständige cDNAs enthalten. Bei der Herstellung dieser cDNA-Bibliotheken werden unvollständige mRNAs durch Liganden weggefangen (persönliche Mitteilung von Joel Jessee, Life Technology, USA). Im November 2000 sind in der EST-Datenbank am National Institutes of Health, USA bereits mehr als 15 000 Xenopus laevis EST Sequenzen enthalten.
1.2 Der Zellzyklus einer eukaryontischen Zelle
Vor jeder Zellteilung einer eukaryontischen Zelle kommt es zu einer Verdopplung der DNA, so daß jede Tochterzelle eine komplette Kopie des genetischen Materials erhält.
Dieser Vorgang findet innerhalb des Zellzyklus statt und wird in die G1-Phase, S-Phase (DNA-Synthese-Phase), G2-Phase und Mitose untergliedert. In der S-Phase wird das genetische Material genau einmal verdoppelt, und in der darauffolgenden G2-Phase überprüft die Zelle die korrekte Duplikation des Genoms und bereitet sich auf die bevorstehende Teilungsphase vor. Der Übergang von einer Zellzyklusphase in die nächste wird von einer Familie von Proteinen reguliert, die als Cyclin-abhängige Kinasen (Cyclin dependent kinases- CDKs) bezeichnet werden. Die Aktivität dieser Kinasen wird von regulatorischen Untereinheiten kontrolliert. Aufgrund ihrer Zellzyklus-abhängigen Expression werden die regulatorischen Untereinheiten als Cycline bezeichnet. Das am besten charakterisierte Mitglied der Cyclin-abhängigen Kinasen ist der sogenannte M-Phase-Faktor (MPF). MPF ist ein Proteinkomplex bestehend aus cdc2 und Cyclin B, der für den Übergang von der G2-Phase in die M- Phase verantwortlich ist (Gautier et al., 1990). MPF reguliert über die Phosphorylierung von bestimmten Zielproteinen Vorgänge wie zum Beispiel den Abbau der Kernhülle in der M-Phase (Nigg, 1995).
1.3 Die Initiation der DNA-Replikation
Innerhalb des Zellzyklus ist die Initiation der Genom-Replikation ein essentieller und stark regulierter Prozess. Im Gegensatz zu Prokaryonten wird die DNA-Synthese bei Eukaryonten von vielen Stellen auf der DNA aus gestartet. Zahlreiche über das Genom verteilte Startpunkte, sogenannte Origins werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten
1 Einleitung 5
während der S-Phase aktiviert. Ein Origin kann während einer S-Phase nur einmal genutzt werden. Damit bleibt gewährleistet, daß auch große Genome innerhalb kurzer Zeit vollständig repliziert werden können, ohne daß es dabei zur wiederholten Replikation der gleichen DNA-Abschnitte kommt. Bei der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden Replikationsstartpunkte identifiziert und untersucht, die man autonom replizierende Sequenzen (ARS) nennt (DePamphilis, 1993). Die ARS- Elemente bestehen aus einem essentiellen 11 bp AT-reichen Konsensus A-Element und zwei oder drei kurzen, funktionell wichtigen aber weniger stark konservierten Elementen, die B1-B3 genannt werden. Bei Untersuchungen in S.cerevisiea konnte gezeigt werden, daß ein Proteinkomplex, der als „Origin recognition complex (ORC)“
bezeichnet wird, an die ARS-Elemente bindet. ORC ist ein Proteinkomplex, der aus sechs verschiedenen Untereinheiten besteht (ORC 1-6) (Bell and Stillman, 1992;
Stillman et al., 1992). Der „Origin recognition complex“ scheint in Hefe während aller Zellzyklusphasen stabil an Chromatin gebunden zu sein (Aparicio et al., 1997; Diffley, 1994; Diffley and Cocker, 1992; Diffley et al., 1994; Liang et al., 1995) und rekrutiert in der frühen G1-Zellzyklusphase weitere Initiationsfaktoren. Es zeigte sich, daß ORC- Proteine über die Evolution konserviert worden sind. So konnten homologe Proteine in Xenopus laevis und anderen Organismen nachgewiesen werden. Sequenzunter- suchungen zeigen, daß Orc-Proteine potentielle Phosphorylierungsstellen für Cyclin- abhängige Kinasen besitzen. In biochemischen und genetischen Experimenten konnte eine Wechselwirkung zwischen Orc und cdc2-Kinasen beobachtet werden (Leatherwood et al., 1996). Gegen Ende der Mitose und während der G1-Phase kommt es zur Bildung eines sogenannten Prä-Replikationskomplexes (engl.: "pre-replication complex" (pre-RC). Zu diesem Zeitpunkt binden weitere Faktoren an ORC, was durch DnaseI-Schutzexperimente gezeigt werden konnte (Diffley and Stillman, 1992). Einer dieser Faktoren ist das Cdc6 Protein, das vom Gen CDC6 (cell division cycle) kodiert wird (Cocker et al., 1996). Cdc6 wiederum ist für einen weiteren essentiellen Schritt bei der Initiation der DNA-Replikation verantwortlich, der ATP-abhängigen Beladung des Chromatins mit den sechs Mcm-Proteinen (minichromosome maintenance) (Perkins and Diffley, 1998; Weinreich et al., 1999). Dadurch wird das Chromatin replikationskompetent gemacht.
1.4 Das Replikationsprotein Cdc6
Das CDC6 Gen wurde erstmals bei genetischen Studien der Zellzyklus-Progression in S.cerevisiae identifiziert (Hartwell, 1973). Bereits 1976 wurde vermutet, daß Cdc6 einen Faktor darstellt, der für die Initiation der DNA-Replikation notwendig ist (Hartwell, 1976). Mutationen im CDC6-Gen führen zu einer hohen Verlustrate von Minichromosomen, die jedoch durch das Einfügen multipler Origins in das Minichromosom supprimiert werden können (Hogan and Koshland, 1992) Im Labor von Paul Nurse wurde das zu CDC6 homologe Gen CDC18 der Spalthefe
1 Einleitung 6
Schizosaccharomyces pombe untersucht (Kelly et al., 1993; Nishitani and Nurse, 1995).
Die Expression von Cdc18 führt zur Initiation der DNA-Replikation, während der Abbau dieses Proteins für die Vermeidung einer weiteren DNA-Replikationsrunde und für das Eintreten in die Mitose wichtig ist.
In Saccharomyces cerevisiae konnte durch in vivo „footprinting“ Analysen gezeigt werden, daß sich der Pre-Replikationskomplex nicht ausbilden kann, wenn ScCdc6 abwesend oder inaktiv ist (Cocker et al., 1996; Santocanale and Diffley, 1996).
Demzufolge scheint Cdc6 direkt in den Aufbau des Proteinkomplexes am Origin involviert zu sein. Cdc6 wird in der frühen G1-Phase durch den ORC-Komplex auf das Chromatin rekrutiert. Das Hefe Cdc6 Protein wiederum scheint als Beladungsfaktor des Chromatins mit den Mcm-Initiatorproteinen zu fungieren (Perkins and Diffley, 1998;
Weinreich et al., 1998). Der Übergang von der G1 zur S-Phase wird durch die Aktivierung von Proteinkinasen wie z.B. die Cdc7/Dbf4 Kinase und S-Phase fördernde Cyclin-abhängige Kinasen koordiniert (Dutta and Bell, 1997; Johnston et al., 1999;
Wuarin and Nurse, 1996). Der Übergang ist durch eine Ablösung des Cdc6 Proteins vom Chromatin und einen durch Cdc45 vermittelten Aufbau der DNA- Replikationsfaktoren gekennzeichnet. Durch die Dissoziation von Cdc6 zu Beginn der DNA-Replikation wird eine erneute Bindung der Mcm-Proteine an bereits repliziertes Chromatin verhindert und somit auch eine DNA-Rereplikation. In Hefe konnte gezeigt werden, daß Cdc6 ein Substrat der Cyclin-abhängigen Proteinkinase Cdc28 ist (Elsasser et al., 1996).
Ein prinzipiell ähnliches Schema für den Aufbau des Initiationskomplexes der DNA- Replikation wurde durch biochemische Studien im Xenopus-System abgeleitet. Das Xenopus laevis CDC6 Gen wurde über Homologie zu den CDC6 Genen in S. cerevisiae und S. pombe identifiziert (Coleman et al., 1996). Im Xenopus laevis zellfreien Eiextraktsystem wurde nachgewiesen, daß Xenopus Cdc6 nur an das Chromatin binden kann, das bereits ORC Proteine trägt. Die Bindung von Cdc6 ist nachweislich essentiell für die anschließende Beladung des Chromatins mit XlMcm3 und anderen Mcm- Proteinen (Coleman et al., 1996; Maiorano et al., 2000; Romanowski et al., 1996;
Rowles et al., 1996). Durch Cdc6 Immundepletionsexperimente in Xenopus-Eiextrakt wurde gezeigt, daß XlCdc6 für die Initiation der Replikation von doppelsträngiger DNA notwendig ist, nicht aber für die Replikation von Einzelstrang-DNA. Die Zugabe von rekombinantem XlCdc6 stellt in XlCdc6-depletierten Eiextrakten die Replikations- fähigkeit wieder her. Dies ist jedoch nicht möglich, wenn das Protein nach dem Aufbau des Chromatins zu intakten Kernen zugegeben wird. Dies läßt vermuten, daß Cdc6 oder ein Protein, welches für die Funktion von Cdc6 notwendig ist, nicht die Kernmembran passieren kann. Nach dem Zusammenbau des Zellkerns ist XlCdc6 mit Chromatin assoziiert, während es sich nach der Initiation der DNA-Replikation vom Chromatin ablöst. Im Gegensatz zu ScCdc6 wird XlCdc6 nach der Initiation der DNA-Replikation nicht abgebaut sondern in Vesikeln relokalisiert (Coleman et al., 1996).
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2 Zielsetzung
Das Protein Cdc6 spielt bei der Initiation der DNA-Replikation zusammen mit den Orc- Proteinen und den Mcm-Proteinen eine entscheidende Rolle. Das zellfreie Xenopus laevis Eiextrakt-System bietet sich für Replikationsstudien an, da die oben genannten Proteine hier in großen Mengen vorliegen. Im Xenopus-System wird die zugesetzte DNA in Zellkerne assembliert und unter Beteiligung sämtlicher Zellzyklus- kontrollmechanismen semikonservativ repliziert.
Ausgangspunkt dieser Arbeit war deshalb die Absicht einen spezifischen Antikörper gegen das Xenopus laevis Cdc6 Protein zu gewinnen. Dazu wurde ein Peptidantikörper gegen eine konservierte Peptidsequenz von 12 Aminosäuren des Saccharomyces cerevisiae Cdc6 Proteins entwickelt. Dieser Antikörper war jedoch nicht für Cdc6 spezifisch, sondern detektierte in Immunoblotstudien ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht. Um festzustellen, ob es sich dabei um ein mögliches Cdc6-Homolog handelte, sollte eine Xenopus laevis Ovarien-cDNA-Bibliothek mit diesem Peptidantikörper durchmustert werden, und die zu diesem Protein kodierende cDNA sollte isoliert werden.
Das Ziel der weiteren Studien war es nun, die bislang unbekannte cDNA und die Funktion des entsprechenden Genproduktes näher zu untersuchen. Hierbei sollten zunächst bakteriell exprimierte Teilfragmente erzeugt werden, um Werkzeuge zu erhalten, mit denen das von der cDNA kodierte Protein biochemisch charakterisiert werden konnte. Die Untersuchung dieses Genprodukts und seiner Funktion in der Zelle stand bei allen Studien im Vordergrund.
Es sollte untersucht werden, wo das Protein in der Zelle lokalisiert ist. Dazu sollten Methoden der Immunfluoreszenz und der Zellfraktionierung angewandt werden. In diesem Zusammenhang sollte die Frage geklärt werden, wie und an welche Strukturen in der Zelle das Protein gebunden ist.
Weiterhin sollte die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Proteinen untersucht werden. In einem „Two Hybrid“-Ansatz sollten Interaktionspartner identifiziert werden, um einen Hinweis auf eine mögliche Funktion zu erhalten.
Expressionsstudien sollten Antwort auf die Frage geben, wann und wo das Protein exprimiert wird. Dies sollte Rückschlüsse erlauben, ob das Protein reguliert exprimiert wird oder ob es sich um ein Haushaltsgen handelt.
2 Zielsetzung 8
Ein weiterer Teilaspekt war herauszufinden, ob das Protein in der Evolution konserviert worden ist und ob es Homologe in anderen eukaryontischen Systemen (z.B. Mensch, Maus oder Hefe) gibt. Diese sollten gegebenenfalls identifiziert und analysiert werden.
Durch eine detaillierte Beschreibung der molekulargenetischen und biochemischen Eigenschaften des Proteins sollen Rückschlüsse auf die mögliche Funktion in der Zelle geschlossen werden.
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3 Material und Methoden
3.1 Material
Chemikalien wurden von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Riedel de Haen, Sigma oder Fluka (Deisenhofen) erworben und waren, wenn nicht anders vermerkt, von analytischem Reinheitsgrad. Radioaktive Substanzen stammten von Amersham Pharmacia (Braunschweig). Lösungen für Proteinbestimmungen wurden von Pierce (St.Augustin) und Bio-Rad (München) bezogen. Restriktionsnukleasen und Enzyme wurden von der Firma New England Biolabs (Schwalbach) bezogen. T7-RNA- Polymerase, der RNase-Inhibitor RNasin sowie Kaninchen Retikulozytenlysat und das TNT-T3-Retikulozytenlysat-System (# L4610) für die in vitro Translation stammten von Promega (Mannheim). Die Tag-DNA-Polymerase und die Pfu-DNA-Polymerase stammten von Stratagene (#600135)(Heidelberg). Lösungen für ECL-„Western“-Blots wurden von Amersham Life Science (Braunschweig) bezogen, Nitrocellulose- Membranen stammten von Schleicher& Schuell (Dassel), Immobilon-Membranen wurden von der Firma Millipore (Frankfurt) bezogen.
Antikörper
Für die Experimente wurden sowohl polyklonale Kaninchen-Antikörper, als auch monoklonale Maus-Antikörper (anti-Tubulin) (Sigma, Deisenhofen) verwendet. An Peroxidase gekoppelte sekundäre Antikörper wurden von Sigma bezogen. Die Immunisierung der Kaninchen erfolgte mit bakteriell exprimierten Teilproteinen. Der monospezifische anti-RNA Polymerase II-Antikörper (C-Term) wurde von der Firma Santa Cruz (# sc-900) (Heidelberg) bezogen.
DNA-, RNA-Marker und Primer
DNA-Marker wurden von der Firma MBI Fermentas (St. Leon Rot) bezogen. RNA- Marker stammten von der Firma Promega (# G319) und der Firma Gibco (# 15620- 016). Oligonucleotide wurden bei MWG Biotech (Ulm) oder Gibco Life Technologies (Karlsruhe) erworben.
10 3 Material und Methoden
Bakterienstämme
Die Stämme XL1 Blue, SOL R, JM 110 und SURE2 wurden von Stratagene (Heidelberg) bezogen, der Stamm Y1090 stammte von Clontech (Heidelberg).
Zellen
Nährmedium und fötales Kälberserum (FCS) für die Zellkultur wurden von der Firma Gibco (Hannover) bezogen. HeLa-Zellen und 293-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) wurden von der Firma Computer Cell Culture Center (Brüssel) bezogen.
Diese Zellen wurden bei 37°C in DMEM (Dulbeccos modified Eagle´s Medium) mit 5% FCS gezogen. Xenopus laevis Herzendothelzellen (XTH2-Zellen= embryonal, stage 52/53 normal heart, endothelium, tadpole heart) wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen& Zellkulturen, Abt. Zellkulturen (Hannover) bezogen (#
Acc190). Xenopus laevis Nierenzellen (WAK-Zellen) und X1-Zellen wurden von Julian Gannon, ICRF, Clare Hall Laboratories zur Verfügung gestellt. WAK und XTH2-Zellen wurden in L15 Medium (Leibowitz mit Glutamat) bei 22°C (Gibco, # 31415-029) gezogen.
3.2 Allgemeine Methoden
Folgende Methoden wurden nach Sambrook (1989) oder Harlow (1988) ausgeführt oder dem jeweils angegebenen Zitat durchgeführt und werden nicht näher beschrieben.
• SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) oder Schägger (1988)
• Nachweis von Proteinen durch Coomassie-Färbung und Silberfärbung von PAA-Gelen nach Bramhall (1969) und Wray et al (1981)
• Naßblotting und Semi Dry Immunoblot nach Towbin et al. (1979), modifiziert wie in Findeisen Dissertation 1999 und Ritzi Diplomarbeit 1996 beschrieben.
• Nachweis von Proteinen mit polyklonalen Seren oder monoklonale Antikörper (Harlow&Lane, 1988) mittels Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpern und Chemilumineszenz (ECL) modifiziert nach Towbin et al. (1979).
Immunoblots wurden in TBST-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH7,5, 120 mM NaCl, 1% Tween 20) durchgeführt, die Blockierung erfolgte in 3% Milchpulver.
• ELISA- Methode für die Bestimmung von Antikörpertitern
• Fällung von Proteinen mit Methanol/Chloroform-Extraktion nach Wessel&
Flügge (1984)
• Proteinbestimmung nach Bradford (1976) und BioRad- bzw. Pierce- Anleitung
• Analyse von DNA (Elektrophorese, Restriktionsverdau, DNA-Reinigung über Phenol-, Chloroform/ Isoamylalkohol-Extraktion und Ethanolfällung, Ligation, Dephosphorylierung von DNA)
• Präparation von Xenopus laevis Metaphase- und Interphase-Eiextrakt wurde nach Strausfeld et al. (1994) durchgeführt.
3 Material und Methoden 11
3.3 Molekulargenetische Methoden
3.3.1 DNA-Präparationen
Die für die Klonierung benötigen Plasmide (pRSET A, B, C, pEG 202, pSG5-GAL) wurden nach der Methode von Birnboim (1979) für Plasmid-Großpräparationen isoliert und anschließend über einen CsCl-Dichtegradienten nach Sambrook et al. (1989) aufgereinigt. Die Minipräparationen wurden wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Alternativ zu klassischen DNA-Präparationsmethoden wurden DNA- Präparationskits von den Firmen Qiagen, Promega, Peqlab und Clontech verwendet. Zur Reinigung von Restriktionsfragmenten wurden diese aus dem 1%igem Agarosegel ausgeschnitten und mit Hilfe eines Gel-Extraktionskits von Qiagen (Hilden) aufgereinigt. Die extrahierte DNA wurde für weitere Schritte wie Klonierungen, Sequenzierungen etc. verwendet.
3.3.2 RNA-Präparationen
Gesamt-RNA aus verschiedenen Xenopus laevis Organen wurde mit der Guanidinthiocyanat-CsCl-Methode nach Chirgwin (1979) präpariert. Für die Präparation aus Xenopus laevis WAK-Zellen und Xenopus laevis Metaphase- und Interphase-Eiextrakt wurde der Qiagen Kit RNeasy (# 74103) verwendet. Die Qualität der RNA wurde in einem Formaldehyd-haltigen Agarosegel (Sambrook et al., 1989) anhand der 18S- und 28S-rRNA überprüft. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt (OD 1= 40 µg/ml). Poly A+- mRNA wurde über das Oligotex Reinigungssystem der Firma Qiagen gereinigt (#70022).
3.3.3 Durchmustern („Screening“) von cDNA-Bibliotheken
Das Durchmustern von cDNA-Bibliotheken sowie das Aufreinigen von positiven Klonen wurde nach Standardmethoden durchgeführt (Sambrook et al. 1989). Eine Xenopus laevis Ovarien cDNA-Bibliothek in Lambda Unizap (oligo dT primed) (Stratagene, #937652) wurde mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern (gegen ein 12 Aminosäuren-Peptid aus ScCdc6 gerichtet) durchmustert.
Eine weitere embryonale Xenopus laevis Bibliothek in Lambda ZapII (Stratagene # 936652 Xenopus laevis stage 30, oligo dT and random primed) wurde mit monospezifischen p170 Antikörpern (Serum 635) durchmustert, um längere Klone zu finden.
12 3 Material und Methoden
Eine menschliche HeLa-cDNA-Expressions-Bibliothek in Lambda Unizap (Stratagene,
# 937216, oligo dT primed) wurde auf DNA-Ebene mit einer Digoxigenin-markierten Sonde aus Klon C (p170 aa 629-1335) und auf Protein-Ebene mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern durchmustert.
Eine Saccharomyces cerevisiae cDNA-Bibliothek (oligo dT and random primed) in Lambda gt 11 (Clontech, #YL 1007b) wurde mit monospezifischen p170-Antikörpern aus Serum 635 durchmustert. Alle gefundenen Klone wurden subkloniert und von der Firma GATC (Konstanz) ansequenziert.
3.3.4 Transformationen
• TSS-Transformation
Bakterien einer exponentiell wachsenden Bakterienkultur wurden bei einer OD600nm von 0,3-0,5 abzentrifugiert und in 500 µl LB und 500 µl 2x TSS (200 mg/ml PEG 8000, 100 mM MgSO4, 10% DMSO in LB-Medium) aufgenommen und resuspendiert. Pro Ansatz wurden 180 ul verwendet und 10-100 ng DNA zugegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden auf LB-Platten mit Antibiotika (Ampicillin oder Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
• Elektrotransformation
Zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen wurden von 1l XL1 Zellen Kulturen bei 37° bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis abgekühlt und bei 4000 g bei 4°C für 15 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde 2x mit eiskaltem sterilem bisdestilliertem Wasser gewaschen und ein weiteres Mal mit 20 ml eiskalter steriler 20%iger Glycerinlösung. Die Zellen wurden in 2 ml dieser Lösung resuspendiert, in 40 µl Aliquoten aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei –70°C.
40 µl elektrokompetenter Zellen wurden für 30 min bei 4°C mit 10-100 ng DNA inkubiert und in 1mm Elektroporationsküvetten der Firma Peqlab überführt. Die Elektrotransformation wurde im Gene Pulser der Firma BioRad bei einer Feldstärke von 12.5 kV/cm2 durchgeführt. Die Zellen wurden sofort in 1 ml SOC-Medium (2% Bacto Trypton, 0.5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) aufgenommen, für 1h bei 37°C inkubiert, abzentrifugiert und in 20 µl LB resuspendiert, auf LB-Platten mit Antibiotikum (Ampicillin oder Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
3.3.5 DNA-Sequenzierung
Doppelsträngige DNA wurde nach dem Direct Blotting System (GATC) nach Angaben des Herstellers mit dem „Cycle Sequencing“ Kit sequenziert. Seit Juli 1998 erfolgte die Sequenzierung direkt bei der Firma GATC (Konstanz).
3 Material und Methoden 13
3.3.6 Konstruktion von Expressionsklonen
5 µg des cDNA-Klons mit Insert wurden mit 5 Units des entsprechenden Restriktionsenzyms für 4 h bei 37°C verdaut. Das Fragment wurde über ein 1%iges Agarosegel aufgetrennt und mit dem Qiagen-Gel-Extraktionskit aufgereinigt. 5 µg des entsprechenden Vektors (pRSET, GAL4-) wurden identisch behandelt. Nach Dephosphorylierung des Vektors mit 20 Units alkalischer Phosphatase wurde dieser zur Reinigung mit Phenol/Chloroform extrahiert. Nach Konzentrationsbestimmung von Vektor und Insert wurden verschiedene Mengenverhältnisse mit einem Überschuß an Insert über Nacht mit 1 Unit T4 DNA Ligase (Roche, #481220) bei 16°C ligiert und in kompetente E.coli-Zellen transfiziert. Positive Klone wurden in DNA- Minipräparationen identifiziert und im analytischen Maßstab auf Proteinexpression untersucht.
Alternativ wurde die DNA des beim „Screenen“ gefundenen Klons C pBluescript SK als Matrize für eine PCR-Reaktionen verwendet. Dabei wurden folgende Primer verwendet, bei denen überhängende Restriktionsschnittstellen (diese sind in nachfolgender Tabelle grau hervorgehoben) konstruiert wurden:
Tabelle 1: Für PCR- Klonierungen verwendete Primer
Primerbezeichnung Primer (5’ – 3’)
N Primer1(Xho1) CCG CTC GAG ATG AAA AGT CTA CAA AAT C Primer 2 (HindIII) CCC AAG CTT CGC AGC TCT CTG TTT CAG
C Primer 1 (BamH1) CTC GGA TCC GAG CTG AAA CAG AGA GCT GCG Primer 2 (Kpn1) CGG GGT ACC GCC ATC AAT CCC AGC AGC CTT GCT PEG202 Primer 1 (EcoRI) CGC GAA TTC CAT GAA AAG TCT ACA AAA TCA A
Primer 2 (XhoI) CGC CTC GAG CTA TCC TAA GGA TCC GCC ATC GAL4 Primer 1 (EcoRI) GCC GAA TTC GAG CGA AAC AGA GAG CTG CG
Primer 2 (BglII) CCG AGA TCT GCC ATC AAT CCC AGC AGC CTT GCT
Die 5’ Primer sind jeweils komplementär zum Beginn der kodierenden Region der cDNA und erzeugen die entsprechende Enzymschnittstelle, während der 3’ Primer revers-komplementär ist. In PCR-Reaktionen wurden 1 ng Matrizen-DNA in 100 µl 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, je 100 µM dNTPs, 50 pmol jedes Primers und 5 Enzymeinheiten Pfu-Polymerase für 30 Zyklen amplifiziert. Als Zyklusparameter wurden 5 min Denaturierung bei 95°C, 30sek Annealing je nach Primer und 3 min Extension bei 72°C gewählt. Die Amplifikationsprodukte wurden über DNA bindende Säulen (NucleoTrap, Machery Nagel, # S1950) aufgereinigt, mit den entsprechenden Enzymen verdaut und in die Vektoren ligiert. Positive Klone wurden in DNA-Minipräparationen identifiziert und für weitere Anwendungen eingesetzt.
14 3 Material und Methoden
3.3.7 „Northernblot“
RNA oder poly A+-RNA aus verschiedenen Geweben wurde in DEPC-behandeltem Wasser gelöst, mit RNA Probenpuffer (50% Formamid, 6% Formaldehyd in 1x Gelpuffer (10x Gelpuffer pH 8: 200 mM MOPS, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA) und 1/10 Volumen RNA-Farbmarker (50 % Saccharose, 0,25% Bromphenolblau in DEPC-H2O) versetzt, durch kurzes Kochen denaturiert und auf einem 1%igem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel bei 60 V aufgetrennt (Sambrook et al. 1989).
Die RNA wurde über Nacht in 5x SSC (20x ist 3M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) auf eine Nylonmembran (ROTH) transferiert und durch 90 sek UV-Bestrahlung auf die Membran fixiert. Die Membran wurde mit 10 ml formaldehydhaltiger RNA- Hybridisierungslösung (0,1% SDS, 50% Formamid, 5x SSC, 50 mM NaPO4 pH 6.8, 0,1% NaP2O7, 5x Denhards Reagenz, 50 µg/ml Hering Sperm DNA) in eine Plastiktasche eingeschweißt und für 4h bei 42°C vorhybridisiert. Die DNA-Sonde (50 ng) wurde mit α32P-dATP über eine „Random-Primed“ Synthese markiert. Die bei 95°C denaturierte DNA-Sonde (spezifische Aktivität 2x106 cpm/ml) wurde in neue Hybridisierungslösung gegeben und die Membran für 16h bei 42°C inkubiert. Die Membran wurde dann zweimal mit 1x SSC + 0,2% SDS für 30 min bei RT gewaschen und dann ein weiteres mal für 1h in 0,2x SSC + 0,2% SDS. Die Hybridisierungssignale wurden durch eine Autoradiographie für 12-48 h bei –70°C auf einem Röntgenfilm (Fuji-RXmedical) sichtbar gemacht.
3.3.8 PCR-“Screening” von cDNA-Bibliotheken
Verschiedene Xenopus laevis cDNA- Bibliotheken wurden mit Standard-Primern in 5’- Richtung aus den Vektoren und verschiedenen genspezifischen Primern auf die Anwesenheit von vollständigen cDNA-Klonen getestet. Dabei wurden steigende Mengen der cDNA-Bibliothek eingesetzt (1, 2, 5 µl) und Kontrollansätze mit jeweils nur einem Primer durchgeführt. Bei Bibliotheken, die in Unizap-Lambda gt11 kloniert wurden, wurde der M13 RP-Primer verwendet, bei Bibliotheken, die bidirektional in den Lambda-Phagen kloniert wurden, wurden M13 Forward- und M13 RP-Primer verwendet. Bei Lambda gt22 A Bibliotheken wurden Lambda-spezifische Primer verwendet. Als genspezifische Primer wurden 28-mer, 35-mer und 39-mer Primer verwendet, um eine höchstmögliche Spezifität durch eine hohe Annealing-Temperatur zu erreichen. Die PCR-Reaktionen wurden mit folgenden Parametern durchgeführt:
Tabelle 2: PCR Bedingungen für cDNA-Bibliothek „Screening“
Temperatur (°C) Inkubation (min:sec)
Denaturierung 95 5: 00
30x Denaturierung Annealing
Extension
95 60 72
1: 00 0: 30 2: 30
Final Extension 72 7: 00
3 Material und Methoden 15
3.3.9 „RACE“- Rapid amplification of cDNA ends-System
Zur Vervollständigung der in dieser Arbeit gefundenen cDNA wurde der SMART RACE cDNA Amplification Kit von Clontech (# K1811-1) verwendet (SMART = Switching Mechanism at 5`end of RNA Transcript).
• Primärstrangsynthese
3 ug Total-RNA oder poly A+-RNA (Metaphase-Eiextrakt RNA) wurden mit dem 5`CDS Primer ( 5’ RACE cDNA Synthesis Primer 5’ (T)25N-1N-3’ N= A,C, G or T, N-1
= A, G or C) zusammengegeben und auf ein Volumen von 5 µl gebracht. Die Probe wurde gemischt und für 2 min auf 70°C erhitzt. Die Probe wurde anschließend für 2 min auf Eis gekühlt und es wurden 2 µl 5x Erststrangsynthese Puffer, 1µl DTT (20 mM), 1µl dNTP (10 mM) und 1 µl MMLV reverse Transkriptase (Superscript II, Gibco BRL, # 18064-014) zugegeben. Die Erststrangsynthese erfolgte bei 45°C für 1.5 h in einem Inkubatorschrank. Die Erststrangreaktion wurde mit 100 µl Tricine EDTA Puffer (10 mM Tricine KOH pH 8.5, 1mM EDTA) und einer sieben-minütigen Inkubation bei 72°C abgestoppt.
• RACE PCR
Um die Sensivität der PCR zu erhöhen, wurde der Advantage2 PCR Kit von Clontech (# K1905-y) (Kellogg et al., 1994) verwendet. Für eine PCR mit dem Endvolumen von 50 µl wurden folgende Komponenten zusammengegeben:
5’ RACE ready cDNA: 2,5 µl, Universal Primer (10x): 5 µl, Genspezifischer Primer (10 µM): 1 µl, H2O: 34,5 µl, 10x Advantage2 PCR Puffer: 5 µl, dNTP (10 mM): 1 µl, Tag Enzym (50 x Advantage 2 Polymerase Mix): 1 µl.
Für die an die Primärstrangsynthese anschließende Touchdown-PCR-Reaktion (Rubie et al., 1999) wurde eine touchdown PCR (bei Primern mit Tm > 70°C) mit folgendem Programm im Perkin–Elmer DNA Thermal Cycler 2400 verwendet:
Tabelle 3: PCR Bedingungen für RACE -PCR
Temperatur (°C) Inkubation (min: sec) 5 Zyklen
Denaturierung 94 0: 05
Annealing 72 3: 00
5 Zyklen Denaturierung
Annealing Extension
94 70 72
0: 05 0: 10 3: 00 25 Zyklen
Denaturierung 94 0: 05
Annealing 68 0: 10
Final Extension 72 3: 00
16 3 Material und Methoden
Für Primer mit Tm= 60-70°C wurde folgendes PCR-Programm verwendet:
25 Zyklen: 94°C 5 sec, 68°C 10 sec, 72°C 3 min.
10 µl des PCR-Produkts (1/10 des Ansatzes) wurden in einem 1%igem Agarosegel analysiert.
•
Charakterisierung der RACE-Produkte:
Um sicherzustellen, daß die PCR-Produkte einen durch die Tag-Polymerase produzierten dA- Überhang an den 3’ Enden besitzen, wurden die PCR-Produkte einem finalen Extensions-Schritt (7 min 72°C ) unterzogen. Anschließend wurden die PCR- Produkte in den Topo TA Cloning Vektor (Invitrogen, # K4500-01) umkloniert. Dazu wurden 4 µl frisches PCR-Produkt mit 1 µl Salzlösung (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2) und 1 µl Topovektor für 5 min bei RT inkubiert. Die Proben wurden anschließend auf Eis gestellt, und 2 µl wurden mit Topo 10 Zellen (One Shot Chemical competent cells) gemischt. Die Bakterienzellen wurden für 30 min auf Eis inkubiert und anschließend für 30 sec einem Hitzeschock in einem auf 42°C temperiertem Wasserbad ausgesetzt. Die Zellen wurden daraufhin sofort auf Eis transferiert und mit 250 µl SOC-Medium (Ansatz: 10 ml LB Medium, 200 µl 0,5 M Mg2SO4, 200 µl 1M Glucose, 50 µl 2 M MgCl2) versetzt. Die Bakterien wurden für 1h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Auf ampicillinhaltige LB-Platten (50 µg Ampicillin/ml) wurden je 10 µl und 100 µl des Transformationsansatzes ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 12 Klone gepickt und ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus den Bakterienkulturen wurden DNA-Minipräparationen durchgeführt. Die DNA wurde mit Standardprimern (M13 forward Primer, M13 reverse Primer) durch die Firma GATC (Konstanz) ansequenziert.
Tabelle 4: Verwendete RACE Primer
Name Sequenz in 5’- 3’ Länge
( bp ) Smp in °C P28 GAC TGT CAG TGC AGA CTC CAG CTG GCTC 28 mer 66°
P3 GCA AGT ACA AGG CCA GTT CTT CTT TGC AGA CTG TCA G 37 mer 78°
Fp3 GCG GAG GGT CCA ACA CCA TCT TGA TG 26 mer 74°
3.3.10 Transfektionen von eukaryontischen Zellen
Einen Tag vor der geplanten Transfektion wurden 3,5 x 105 293-Zellen (embryonale menschliche Nierenzellen) pro Vertiefung einer 6 Well-Platte ausgesät. Am Tag der Transfektion waren die Zellen zu ca. 40-80% konfluent. 3 µg Gesamt-DNA wurden mit 100 µl Optimem (serumfreies Medium, Gibco #51985-026) gemischt und abzentrifugiert. 12 µl Superfect (Qiagen) wurden zu der DNA–Lösung gegeben und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Zur Komplexbildung wurden die Proben 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen vorsichtig
3 Material und Methoden 17
mit 1x PBS (4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gewaschen. Die DNA-Dendrimer-Komplexe wurden in 600 ul Serum-haltigem Medium aufgenommen, gemischt und auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden mit den Komplexen für 3h bei 37°C inkubiert. Nach Abnahme des komplexhaltigen Mediums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt und für 48h inkubiert. Für Genexpressionstudien wie den Luciferase-Assay und β-Galactosidase Assay wurden die Zellen mit 1x Reporter Lysis Buffer (Promega, # E4030) behandelt und bei –70°C aufbewahrt.
3.3.11 Hefe „Two Hybrid“-System
Für die Expression des klonierten Fusionsproteins wurde der Hefestamm EGY48 verwendet. In diesem Stamm sind die „upstream“ aktivierenden Sequenzen des chromosomalen Leu2 Genes, die für den biosynthetischen Leucin Stoffwechselweg verantwortlich sind, durch 6 LexA Operatoren (DNA-Bindungsstellen) ersetzt. Durch Verwendung dieses Stammes wird die Selektion für eine transkriptionelle Aktivierung bei Ausplattierung auf ein Medium ohne Leucin möglich. Es können nur solche Hefen überleben, die mit einem Plasmid transfiziert worden sind, das die LexA Bindungsdomäne mit einem transaktivierenden Protein als Fusionsprotein exprimiert und dadurch an das LexA- Operon binden kann und die Ablesung des Leucingens ermöglicht. Dieser Stamm wurde nicht-selektiv auf einem Komplett-Medium (YPD=
Yeast extract-peptone-dextrose) kultiviert. Für die Selektion auf eine bestimmte Aminosäure-Biosynthese der verwendeten Hefeplasmide wurden SC-Medien (SC=synthetic complete drop out) verwendet (Golemis and Khazak, 1997). Die Hefen wurden bei 30°C kultiviert, kleine Kulturen wurden in einem Rotor inkubiert, 50 ml Kulturen wurden auf dem Magnetrührer inkubiert. Die Transformation der Hefen mit Plasmid-DNA erfolgte nach der Methode von Agatep, 1998. Proteinextrakte von transformierten Hefen wurden nach Wobbe, 1990 hergestellt. Zur Überprüfung des Aktivitätsprofils des Fusionsproteins wurde der β-Galactosidase-Assay nach Reynolds et al. (1998) durchgeführt. Als Reporterplasmid wurde der Vektor pSH18-14 verwendet. Dieser Vektor enthält einen LexA-Operator, der vor einem Lac-Z Gen liegt, er trägt zusätzlich einen Uracil Selektionsmarker. Die Verwendung dieses Reporterplasmids ermöglicht eine Selektion durch eine Farbreaktion bei Wachstum der Hefe auf Xgal-haltigem Medium oder die Durchführung eines β-Galactosidase Assays, bei dem die Aktivität der durch das LacZ Gen kodierten β-Galactosidase gemessen wird.
18 3 Material und Methoden
3.4 Proteinbiochemische Methoden
3.4.1 Expression und Reinigung von rekombinaten Protein im Expressionssystem pRSET
Die bakterielle Expression und Reinigung der in dieser Arbeit beschriebenen Fragmente N und C erfolgte im Expressionssystem pRSET A von der Firma Invitrogen nach Angaben des Herstellers. Für die Expression wurde der rekombinante Vektor in den E.coli -Stamm BL21 (DE3) Lys5 transformiert. Dieser E.coli-Stamm trägt den Lambda abgeleiteten Prophagen DE3 in seinem Genom, der ein DNA-Fragment trägt, das die Gene für LacI und die T7-RNA Polymerase beinhaltet. Bei Erreichen des lysogenen Zustandes wird das Gen nur vom lacUV5-Promotor aus transkribiert, der durch IPTG induziert werden kann. Die Zugabe von IPTG zu einer wachsenden Kultur bewirkt die Induktion der T7-RNA-Polymerase, die wiederum die Ziel-DNA im Plasmid transkribiert. 10 ml LB-Medium wurden mit drei transformierten Kolonien BL21 direkt von der Platte angeimpft und bei 37°C inkubiert, bei OD595nm von 0.4 wurde in Abhängigkeit der Versuchsbedingungen durch Zugabe von verschiedenen IPTG- Konzentrationen (0,01-1mM) induziert.
Das Expressionsprodukt wurde analysiert, indem 1 ml Bakterienkultur pelletiert, in GET (50 mM Glucose, 25 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA) resuspendiert und sonifiziert wurden. Die Proben wurden in 100 µl Laemmli-Probenpuffer aufgenommen und in einer 10% SDS-PAGE analysiert.
Für eine Großkultur wurde 1 Liter LB-Medium mit mehreren transformierten BL21(DE3) Kolonien angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD595 nm von 0,4 wurde mit einer IPTG Konzentrationen (0.01mM) induziert. Das Expressionsprodukt wurde durch Coomassie-Färbung oder per Immunfärbung mit monoklonalen anti-His- tag-Antikörpern (Qiagen, Kat.# 34660) identifiziert. Die Reinigung des bakteriell exprimierten Proteins erfolgte über Nickel-NTA-Agarose (Qiagen) nach Angaben des Herstellers.
3.4.2 Antikörperproduktion in Kaninchen
Für die Gewinnung eines Peptidantikörpers wurde das aus 12 Aminosäuren bestehende chemisch synthetisierte Peptid an KLH (Keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt.
Maleimide aktiviertes KLH der Firma Pierce (Kat.# 77606) wurde in Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10 mg/ ml eingestellt. 2 mg in PBS gelöstes Peptid wurden mit 2 mg des aktivierten mcKLH gemischt und für zwei Stunden bei RT inkubiert. Das Immunogen wurde mit RAS-Adjuvans gemischt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet.
3 Material und Methoden 19
Vor der Immunisierung mit gereinigtem bakteriell exprimiertem Protein wurden dem Kaninchen 5 ml Blut als Nullserum abgenommen. Alle zwei Wochen wurden dem Kaninchen 200 µg Protein in 500 µl PBS mit 500 µl RAS-Adjuvans subkutan injiziert.
12-14 Tage nach jeder Immunisierung wurde dem Kaninchen Blut entnommen, für 5 min bei 3000g abzentrifugiert und der im Serum enthaltene Antikörpertiter im ELISA und im Immunoblot bestimmt. Nach fünf Immunisierungen wurde das Kaninchen ausgeblutet, das Blut abzentrifugiert und der zellfreie Überstand aliquotiert. Die polyklonale Antiseren wurden bei –20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
3.4.3 Präparation von monospezifischen Antikörpern
100 µg bakteriell exprimiertes Protein oder synthetisch hergestelltes (Peptid-) Antigen wurden an 500 µl SulfoLink (Pierce) oder 500 µl CNBr aktivierte Sepharose (Pharmacia Biotech, Uppsula) nach Angaben des Herstellers gekoppelt. 5 ml Serum wurden über Nacht mit dem Säulenmaterial auf einem Roller inkubiert. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumen NET (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8) gewaschen, anschließend mit 10 Säulenvolumen NET +1M NaCl, weiterhin mit 10 Säulenvolumen NET +0,5% NP40 und abschließend mit 10 Säulenvolumen NET ohne NP40 gewaschen. Nach einem Vorelutionsschritt mit 5 ml NaCitrat (0,1M pH 5,5) wurde die Säule mit 0,1M Citronensäure (pH 3) in 300 µl Schritten eluiert, wobei jeweils 100 µl Tris (1M, pH 8) zur Neutralisation des Elutionspuffers vorgelegt wurden.
Die Proteinbestimmung erfolgte im Photometer bei 280 nm (OD280nm1,4=1mg IgG/ml).
Fraktionen, die Antikörper enthielten, wurden vereinigt und im Immunoblot getestet.
Die Aufbewahrung erfolgte bei –20°C bis zur Verwendung.
3.4.4 ELISA
96 well Multititerplatten wurden über Nacht mit 50 ng Antigen in 0,1M NaHCO3, pH9.6 pro Loch beschichtet. Die Platte wurde für 30 min mit 3% Magermilchpulver in PBST (4,3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0.01%
Tween 20) blockiert. Die weitere Inkubation mit den Primärantikörpern für 1h und mit den peroxidase gekoppelten Sekundärantikörpern für 30min erfolgte in 3%
Magermilchpulver in PBST. Zwischen den Schritten wurde die Platte jeweils dreimal mit PBST gewaschen. Für die Farbreaktion wurde eine ABST-Tablette (Sigma) in 10ml ABST-Puffer (100 mM Na-Acetat, pH 4.2, 50 mM Na2HPO4, 0.01% H2O2). Nach 15- 20 min wurde mit einem ELISA-Reader die OD405 gemessen.
3.4.5 Antikörperkonzentrationen für Immunoblots
Tabelle 5 faßt die für Immunoblots verwendeten primären Antikörper zusammen.
Sekundäre Antikörper wurden als anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugate und anti- Maus-Peroxidase-Konjugate von der Firma Sigma bezogen. Gekaufte Antikörper
20 3 Material und Methoden
wurden nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Konzentrationen der selbst gereinigten Antikörper lagen im Durchschnitt bei 0,2 µg/ml.
Tabelle 5: Verwendete Antikörper und ihre Konzentrationen
Antikörper Herkunft Verdünnung im
Immunoblot P50-Peptidantikörper polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 10 000
anti C p170 (635) polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 500 anti N p170 (636) polyklonal, Kaninchen 1: 1000 anti C p170 (640) polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 500 anti C-p170 (663) polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 1000
anti-RNA-Pol II polyklonal, monospezifisch,Kaninchen Santa Cruz Laboraties (#sc900)
1: 100
anti-Mcm4 polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 400 anti-SAF-A polyklonal, monospezifisch, Kaninchen 1: 500 anti-Tubulin monoklonal Maus, Sigma (#T6557) 1: 1000
anti-BrdU monoklonal Maus, Böhringer (# 1585860)
1: 40
3.4.6 Zellfraktionierung
Je eine Platte HeLa-Zellen, WAK- und XTH2-Zellen (ungefähr 2x107 Zellen) wurden zweimal mit eiskaltem PBS mit 3 mM EDTA gewaschen, für 15 min bei RT inkubiert und anschließend durch Klopfen gelöst. Die Zellen wurden mit 5 ml eiskaltem Acetatpuffer (110 mM Kaliumacetat, 5 mM Kaliumacetat, 2 mM Magnesium, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 20 mM Hepes mit 50 µg/ml Digitonin für HeLa-Zellen, bzw. 35 µg/ml Digitonin für Xenopus-Zellen von der Platte abgespült und für 15 min auf Eis inkubiert. Danach folgte ein Zentrifugationschritt für 5 min bei 750 g im HB4-Rotor.
Der cytosolhaltige Überstand wurde abgenommen, das Pellet mit der Pasteurpipette trockengesaugt und in 5 ml hypotonem Puffer (1mM Hepes, pH 7,3, 0,5 mM EDTA) resuspendiert und für 15 min auf Eis resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für 5min bei 1700 g im HB4-Rotor zentrifugiert und der nucleoplasmahaltige Überstand abgenommen. Das Pellet wurde tropfenweise in 5 ml Hepes/ EDTA-Lösung + 0,5%
NP40 resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation von 5 min bei 1700g im HB4-Rotor wurde die NP40-lösliche Fraktion abgenommen und das verbleibende Chromatinpellet in 5 ml RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5%
DOC, 1% NP40, 50 mM Tris, pH 8) resuspendiert. Die Proben wurden sonifiziert, nach Wessel&Flugge gefällt und im Pierce-Assay wurde die Proteinkonzentration bestimmt.
