Biochemische und zellbiologische Eigenschaften von p170

5.3.1 Die Lokalisation von p170 und p58

Immunfluoreszenzaufnahmen von XTH2-Zellen, die mit monospezifischen p170 Antikörpern gefärbt wurden, haben eine präferenzielle Kernfärbung mit einer Teilanfärbung des Cytoplasmas (Abb. 31) gezeigt. Die Zellfraktionierung von XTH2-Zellen zeigt, daß dieser Befund sehr wahrscheinlich auf eine unterschiedliche Lokalisation der beiden Proteine, die durch anti-p170 Antikörper erkannt werden, zurückzuführen ist. p170 ist bei einer mit Digitonin durchgeführten Zellfraktionierung im Cytoplasma nachweisbar. p58 dagegen ist in zwei Populationen nachweisbar: einer cytoplasmatischen und einer nucleosolischen (nicht aber in der NP40-Fraktion, wie es für P50 beschrieben wurde) (vgl. Abb. 7 und Abb. 32). Die Kernfärbung in der Immunfluoreszenz ist demnach sehr wahrscheinlich auf das p58 Protein zurückzuführen. Um die cytoplasmatische p58 Population genauer zu charakterisieren, wurde eine Fraktionierung von Eiextrakt in Membranen und Cytoplasma durchgeführt.

Derartige Untersuchungen werden in der Literatur auch für andere Cytoplasma-Proteine beschrieben, z.B. Xklp3, eine Untereinheit von Xenopus laevis Kinesin II (Wittmann et al., 1998). Die durch einen Zentrifugationsschritt gewonnenen Membranen wurden in einem Sucrosedichte-Gradienten weiter in schwere (Golgi-Apparat und endo-plasmatisches Reticulum assoziierte) und leichte Membranen (Kernmembranen) aufgetrennt. Die Membranen unterscheiden sich in ihrem Verhalten im Sucrose-Gradienten dadurch, daß sie eine unterschiedliche Auftriebsdichte haben.

p58 wurde in den Fraktionen nachgewiesen, die die Golgi-Membranen und Membranen des endoplasmatischen Reticulums enthielten. Ein solches Verhalten wird in der Literatur für zahlreiche Intermediär-Kompartment-Proteine beschrieben (Griffiths et al., 1994; Tang et al., 1993).

5.3.2 Das Sedimentationsverhalten von p170 und p58

p170 sedimentiert entsprechend seinem Molekulargewicht mit ca. 9 S (vgl. Abb. 34).

Aus diesem Sedimentationsverhalten kann geschlossen werden, daß p170 vermutlich keine Filamente ausbildet, da es dann mit einem geringeren S-Wert sedimentieren sollte. p58 sedimentiert in einem großen Proteinkomplex von etwa 17 S. Der Komplex kann durch Hochsalz (z.B. 1.2 M LiCl) oder Zugabe von 0,1 % SDS aufgelöst werden.

Im Gegensatz zu dem P50 Proteinkomplex ist der p58 Proteinkomplex nicht empfindlich gegenüber RNase- Behandlung (Abb. 35).

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5.3.3 Die Expression von p170 und p58

Es konnte gezeigt werden, daß sowohl p58 als auch p170 reguliert exprimiert werden (vgl. Abb. 28 und Abb. 29). p170 ist während der Embryonalentwicklung bereits nach 5 Teilungsstadien mit den p170 spezifischen Antikörpern kaum mehr nachweisbar (Abb.

30). Dies könnte dafür sprechen, daß p170 in Embryonalzellen nur in sehr frühen Stadien benötigt wird und dann abgebaut wird. Auch die Proteinmenge von p58 ist nicht in jedem untersuchten Embryonalstadium gleich, ab Stadium 10 ist eine Abnahme von p58 festzustellen.

Die Existenz von p170 wurde auch in unreifen Oocyten und Hoden (vgl.4.6.1) nachgewiesen. In Northernblot-Studien wurde gezeigt, daß die p170 mRNA in Xenopus laevis Ei in großen Mengen nachweisbar ist. In WAK-Zellen konnte ebenfalls eine p170 mRNA detektiert werden, deren Vorkommen bei der Untersuchung von gleichen Gesamt-RNA-Mengen im Vergleich zu Ei wesentlich geringer ist (Abb. 29).

Daher läßt sich vermuten, daß die beiden Proteine hauptsächlich in den Reproduktionsorganen (Ovar und Hoden) von Xenopus laevis entwicklungsspezifisch reguliert exprimiert werden und ihre Funktion dort ausüben.

5.3.4 Reinigung von p170

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsschema entwickelt, um p170 aus Eiextrakt aufzureinigen. Die Expressionsuntersuchungen haben ergeben, daß p170 im Ei im Vergleich zu den untersuchten Organen in den größten Mengen vorliegt, dennoch ist die p170 Konzentrationen auch hier noch sehr gering (0.4 ng/ µl Eiextrakt) und erschweren eine Reinigung mit großen Ausbeuten. In der hier vorliegenden Arbeit konnten von 14 µg Ausgangsmaterial in 30 ml Eiextrakt, etwa 1µg p170 Protein relativ sauber dargestellt werden. Die Menge an p170 in XTH2 oder WAK-Zellen wurde nicht bestimmt, sie dürfte aber anhand der vorliegenden Experimente noch mal um den Faktor 10 geringer sein, so daß ein Reinigungsversuch von p170 aus Zellmaterial auch hier wegen der begrenzten Menge wenig erfolgversprechend erscheint.

5.3.5 Transaktivierende Eigenschaft des p170 Carboxy-Terminus in Hefe

Im β-Galactosidase-Assay konnte gezeigt werden, daß der Klon C als Fusionsprotein mit einer LexA-Bindungsdomäne in Hefe transaktivierend wirkt (Abb. 39). Diese Eigenschaft konnte jedoch in menschlichen 293-Zellen nicht bestätigt werden (Abb.

40). Transaktivierende Eigenschaften von Proteinen können durch saure Domänen im Protein hervorgerufen werden (Hahn, 1993). Die Analyse der p170 Aminosäuresequenz zeigt, daß zwar ein Großteil aller Aminosäuren sauer ist (>30%), diese jedoch über das gesamte Protein verteilt vorliegen, statt in Gruppen, wie für eine Transaktivierung nötig.

In der Literatur wird ebenso beschrieben, daß Glutamin-Abschnitte in Hefeproteinen

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aktivierend wirken können (Gill, 1994) und (Xiao and Jeang, 1998)- p170 verfügt über einen solchen Glutaminreichen Abschnitt (aa 657-665 QQTLQQQQHMLQQ). Dieser Glutaminstretch ist auch in den p170 Homologen Mensch und Maus konserviert. Er könnte die mögliche Ursache für die gemessene transkriptionelle Aktivierung in Hefe sein. Andererseits kann nicht ausgeschlossen werden, daß der C-Terminus von p170 in Xenopus laevis Zellen transaktivierend wirkt. Für derartige Untersuchungen standen zwar zwei Xenopus laevis Zelltypen zur Verfügung. Aufgrund ihres langsamen Wachstums erwiesen sich XTH2-Zellen für die hier durchgeführten transienten Transfektionen jedoch als ungeeignet. WAK-Zellen dagegen ließen sich äußerst schwierig transfizieren. Um die transaktivierende Eigenschaft von p170 in Xenopus laevis weiter zu untersuchen, muß deshalb eine geeignete Zelllinie gefunden werden.

Nach den vorliegenden Untersuchungen erscheint eine embryonale Zelllinie am geeignetsten.

Die Anwendung eines konventionellen „Two Hybrid-Screening“ ist aufgrund der transaktivierenden Eigenschaft von p170 nicht möglich. Das „Two Hybrid“-System beruht auf einer Kombination von „bait“ und „fish“-Fusionen, die die Transkription durch ihre Interaktion stimulieren. p170 stimuliert jedoch bereits fusioniert an eine LexA-Bindungsdomäne alleine die Transkription. Um einen klassischen „Two-Hybrid“

Screen durchführen zu können, müßten die Sequenzen, die für die Eigenaktivierung verantwortlich sind, aus dem Protein entfernt werden. Alternative Ansätze dazu wären mit einem strenger selektionierenden Hefestamm wie EGY191 (2 statt 6 LexA Operatoren) denkbar (Golemis and Khazak, 1997). Aufgrund der starken α-helicalen Struktur über den gesamten Bereich von p170 muß eine Zerlegung in Domänen zum Einsatz im „Two Hybrid“-System als ungünstig erachtet werden. Sehr wahrscheinlich würden damit funktionelle Einheiten von p170 zerstört. Alternative „Two Hybrid“-Systeme, die nicht auf einer direkten Aktivierung beruhen, werden von (Aronheim, 1997) und (Karimova et al., 1998) beschrieben und könnten einen lohnenden Alternativ-Ansatz darstellen.

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