Molekulargenetische Methoden

3.3.1 DNA-Präparationen

Die für die Klonierung benötigen Plasmide (pRSET A, B, C, pEG 202, pSG5-GAL) wurden nach der Methode von Birnboim (1979) für Plasmid-Großpräparationen isoliert und anschließend über einen CsCl-Dichtegradienten nach Sambrook et al. (1989) aufgereinigt. Die Minipräparationen wurden wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Alternativ zu klassischen Präparationsmethoden wurden DNA-Präparationskits von den Firmen Qiagen, Promega, Peqlab und Clontech verwendet. Zur Reinigung von Restriktionsfragmenten wurden diese aus dem 1%igem Agarosegel ausgeschnitten und mit Hilfe eines Gel-Extraktionskits von Qiagen (Hilden) aufgereinigt. Die extrahierte DNA wurde für weitere Schritte wie Klonierungen, Sequenzierungen etc. verwendet.

3.3.2 RNA-Präparationen

Gesamt-RNA aus verschiedenen Xenopus laevis Organen wurde mit der Guanidinthiocyanat-CsCl-Methode nach Chirgwin (1979) präpariert. Für die Präparation aus Xenopus laevis WAK-Zellen und Xenopus laevis Metaphase- und Interphase-Eiextrakt wurde der Qiagen Kit RNeasy (# 74103) verwendet. Die Qualität der RNA wurde in einem Formaldehyd-haltigen Agarosegel (Sambrook et al., 1989) anhand der 18S- und 28S-rRNA überprüft. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt (OD 1= 40 µg/ml). Poly A⁺ -mRNA wurde über das Oligotex Reinigungssystem der Firma Qiagen gereinigt (#70022).

3.3.3 Durchmustern („Screening“) von cDNA-Bibliotheken

Das Durchmustern von cDNA-Bibliotheken sowie das Aufreinigen von positiven Klonen wurde nach Standardmethoden durchgeführt (Sambrook et al. 1989). Eine Xenopus laevis Ovarien cDNA-Bibliothek in Lambda Unizap (oligo dT primed) (Stratagene, #937652) wurde mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern (gegen ein 12 Aminosäuren-Peptid aus ScCdc6 gerichtet) durchmustert.

Eine weitere embryonale Xenopus laevis Bibliothek in Lambda ZapII (Stratagene # 936652 Xenopus laevis stage 30, oligo dT and random primed) wurde mit monospezifischen p170 Antikörpern (Serum 635) durchmustert, um längere Klone zu finden.

12 3 Material und Methoden

Eine menschliche HeLa-cDNA-Expressions-Bibliothek in Lambda Unizap (Stratagene,

# 937216, oligo dT primed) wurde auf DNA-Ebene mit einer Digoxigenin-markierten Sonde aus Klon C (p170 aa 629-1335) und auf Protein-Ebene mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern durchmustert.

Eine Saccharomyces cerevisiae cDNA-Bibliothek (oligo dT and random primed) in Lambda gt 11 (Clontech, #YL 1007b) wurde mit monospezifischen p170-Antikörpern aus Serum 635 durchmustert. Alle gefundenen Klone wurden subkloniert und von der Firma GATC (Konstanz) ansequenziert.

3.3.4 Transformationen

• TSS-Transformation

Bakterien einer exponentiell wachsenden Bakterienkultur wurden bei einer OD600nm von 0,3-0,5 abzentrifugiert und in 500 µl LB und 500 µl 2x TSS (200 mg/ml PEG 8000, 100 mM MgSO4, 10% DMSO in LB-Medium) aufgenommen und resuspendiert. Pro Ansatz wurden 180 ul verwendet und 10-100 ng DNA zugegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden auf LB-Platten mit Antibiotika (Ampicillin oder Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

• Elektrotransformation

Zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen wurden von 1l XL1 Zellen Kulturen bei 37° bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis abgekühlt und bei 4000 g bei 4°C für 15 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde 2x mit eiskaltem sterilem bisdestilliertem Wasser gewaschen und ein weiteres Mal mit 20 ml eiskalter steriler 20%iger Glycerinlösung. Die Zellen wurden in 2 ml dieser Lösung resuspendiert, in 40 µl Aliquoten aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei –70°C.

40 µl elektrokompetenter Zellen wurden für 30 min bei 4°C mit 10-100 ng DNA inkubiert und in 1mm Elektroporationsküvetten der Firma Peqlab überführt. Die Elektrotransformation wurde im Gene Pulser der Firma BioRad bei einer Feldstärke von 12.5 kV/cm² durchgeführt. Die Zellen wurden sofort in 1 ml SOC-Medium (2% Bacto Trypton, 0.5% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) aufgenommen, für 1h bei 37°C inkubiert, abzentrifugiert und in 20 µl LB resuspendiert, auf LB-Platten mit Antibiotikum (Ampicillin oder Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

3.3.5 DNA-Sequenzierung

Doppelsträngige DNA wurde nach dem Direct Blotting System (GATC) nach Angaben des Herstellers mit dem „Cycle Sequencing“ Kit sequenziert. Seit Juli 1998 erfolgte die Sequenzierung direkt bei der Firma GATC (Konstanz).

3 Material und Methoden 13

3.3.6 Konstruktion von Expressionsklonen

5 µg des cDNA-Klons mit Insert wurden mit 5 Units des entsprechenden Restriktionsenzyms für 4 h bei 37°C verdaut. Das Fragment wurde über ein 1%iges Agarosegel aufgetrennt und mit dem Qiagen-Gel-Extraktionskit aufgereinigt. 5 µg des entsprechenden Vektors (pRSET, GAL4-) wurden identisch behandelt. Nach Dephosphorylierung des Vektors mit 20 Units alkalischer Phosphatase wurde dieser zur Reinigung mit Phenol/Chloroform extrahiert. Nach Konzentrationsbestimmung von Vektor und Insert wurden verschiedene Mengenverhältnisse mit einem Überschuß an Insert über Nacht mit 1 Unit T4 DNA Ligase (Roche, #481220) bei 16°C ligiert und in kompetente E.coli-Zellen transfiziert. Positive Klone wurden in DNA-Minipräparationen identifiziert und im analytischen Maßstab auf Proteinexpression untersucht.

Alternativ wurde die DNA des beim „Screenen“ gefundenen Klons C pBluescript SK als Matrize für eine PCR-Reaktionen verwendet. Dabei wurden folgende Primer verwendet, bei denen überhängende Restriktionsschnittstellen (diese sind in nachfolgender Tabelle grau hervorgehoben) konstruiert wurden:

Die 5’ Primer sind jeweils komplementär zum Beginn der kodierenden Region der cDNA und erzeugen die entsprechende Enzymschnittstelle, während der 3’ Primer revers-komplementär ist. In PCR-Reaktionen wurden 1 ng Matrizen-DNA in 100 µl 10 mM Tris HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, je 100 µM dNTPs, 50 pmol jedes Primers und 5 Enzymeinheiten Pfu-Polymerase für 30 Zyklen amplifiziert. Als Zyklusparameter wurden 5 min Denaturierung bei 95°C, 30sek Annealing je nach Primer und 3 min Extension bei 72°C gewählt. Die Amplifikationsprodukte wurden über DNA bindende Säulen (NucleoTrap, Machery Nagel, # S1950) aufgereinigt, mit den entsprechenden Enzymen verdaut und in die Vektoren ligiert. Positive Klone wurden in DNA-Minipräparationen identifiziert und für weitere Anwendungen eingesetzt.

14 3 Material und Methoden

3.3.7 „Northernblot“

RNA oder poly A⁺-RNA aus verschiedenen Geweben wurde in DEPC-behandeltem Wasser gelöst, mit RNA Probenpuffer (50% Formamid, 6% Formaldehyd in 1x Gelpuffer (10x Gelpuffer pH 8: 200 mM MOPS, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA) und 1/10 Volumen RNA-Farbmarker (50 % Saccharose, 0,25% Bromphenolblau in DEPC-H₂O) versetzt, durch kurzes Kochen denaturiert und auf einem 1%igem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel bei 60 V aufgetrennt (Sambrook et al. 1989).

Die RNA wurde über Nacht in 5x SSC (20x ist 3M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) auf eine Nylonmembran (ROTH) transferiert und durch 90 sek UV-Bestrahlung auf die Membran fixiert. Die Membran wurde mit 10 ml formaldehydhaltiger RNA-Hybridisierungslösung (0,1% SDS, 50% Formamid, 5x SSC, 50 mM NaPO4 pH 6.8, 0,1% NaP₂O₇, 5x Denhards Reagenz, 50 µg/ml Hering Sperm DNA) in eine Plastiktasche eingeschweißt und für 4h bei 42°C vorhybridisiert. Die DNA-Sonde (50 ng) wurde mit α³²P-dATP über eine „Random-Primed“ Synthese markiert. Die bei 95°C denaturierte DNA-Sonde (spezifische Aktivität 2x10⁶ cpm/ml) wurde in neue Hybridisierungslösung gegeben und die Membran für 16h bei 42°C inkubiert. Die Membran wurde dann zweimal mit 1x SSC + 0,2% SDS für 30 min bei RT gewaschen und dann ein weiteres mal für 1h in 0,2x SSC + 0,2% SDS. Die Hybridisierungssignale wurden durch eine Autoradiographie für 12-48 h bei –70°C auf einem Röntgenfilm (Fuji-RXmedical) sichtbar gemacht.

3.3.8 PCR-“Screening” von cDNA-Bibliotheken

Verschiedene Xenopus laevis cDNA- Bibliotheken wurden mit Standard-Primern in 5’-Richtung aus den Vektoren und verschiedenen genspezifischen Primern auf die Anwesenheit von vollständigen cDNA-Klonen getestet. Dabei wurden steigende Mengen der cDNA-Bibliothek eingesetzt (1, 2, 5 µl) und Kontrollansätze mit jeweils nur einem Primer durchgeführt. Bei Bibliotheken, die in Unizap-Lambda gt11 kloniert wurden, wurde der M13 RP-Primer verwendet, bei Bibliotheken, die bidirektional in den Lambda-Phagen kloniert wurden, wurden M13 Forward- und M13 RP-Primer verwendet. Bei Lambda gt22 A Bibliotheken wurden Lambda-spezifische Primer verwendet. Als genspezifische Primer wurden 28-mer, 35-mer und 39-mer Primer verwendet, um eine höchstmögliche Spezifität durch eine hohe Annealing-Temperatur zu erreichen. Die PCR-Reaktionen wurden mit folgenden Parametern durchgeführt:

Tabelle 2: PCR Bedingungen für cDNA-Bibliothek „Screening“

3 Material und Methoden 15

3.3.9 „RACE“- Rapid amplification of cDNA ends-System

Zur Vervollständigung der in dieser Arbeit gefundenen cDNA wurde der SMART RACE cDNA Amplification Kit von Clontech (# K1811-1) verwendet (SMART = Switching Mechanism at 5`end of RNA Transcript).

• Primärstrangsynthese

3 ug Total-RNA oder poly A⁺-RNA (Metaphase-Eiextrakt RNA) wurden mit dem 5`CDS Primer ( 5’ RACE cDNA Synthesis Primer 5’ (T)25N-1N-3’ N= A,C, G or T, N-1

= A, G or C) zusammengegeben und auf ein Volumen von 5 µl gebracht. Die Probe wurde gemischt und für 2 min auf 70°C erhitzt. Die Probe wurde anschließend für 2 min auf Eis gekühlt und es wurden 2 µl 5x Erststrangsynthese Puffer, 1µl DTT (20 mM), 1µl dNTP (10 mM) und 1 µl MMLV reverse Transkriptase (Superscript II, Gibco BRL, # 18064-014) zugegeben. Die Erststrangsynthese erfolgte bei 45°C für 1.5 h in einem Inkubatorschrank. Die Erststrangreaktion wurde mit 100 µl Tricine EDTA Puffer (10 mM Tricine KOH pH 8.5, 1mM EDTA) und einer sieben-minütigen Inkubation bei 72°C abgestoppt.

• RACE PCR

Um die Sensivität der PCR zu erhöhen, wurde der Advantage2 PCR Kit von Clontech (# K1905-y) (Kellogg et al., 1994) verwendet. Für eine PCR mit dem Endvolumen von 50 µl wurden folgende Komponenten zusammengegeben:

5’ RACE ready cDNA: 2,5 µl, Universal Primer (10x): 5 µl, Genspezifischer Primer (10 µM): 1 µl, H2O: 34,5 µl, 10x Advantage2 PCR Puffer: 5 µl, dNTP (10 mM): 1 µl, Tag Enzym (50 x Advantage 2 Polymerase Mix): 1 µl.

Für die an die Primärstrangsynthese anschließende Touchdown-PCR-Reaktion (Rubie et al., 1999) wurde eine touchdown PCR (bei Primern mit T_m > 70°C) mit folgendem Programm im Perkin–Elmer DNA Thermal Cycler 2400 verwendet:

Tabelle 3: PCR Bedingungen für RACE -PCR

16 3 Material und Methoden

Für Primer mit Tm= 60-70°C wurde folgendes PCR-Programm verwendet:

25 Zyklen: 94°C 5 sec, 68°C 10 sec, 72°C 3 min.

10 µl des PCR-Produkts (1/10 des Ansatzes) wurden in einem 1%igem Agarosegel analysiert.

•

:

Um sicherzustellen, daß die PCR-Produkte einen durch die Tag-Polymerase produzierten dA- Überhang an den 3’ Enden besitzen, wurden die PCR-Produkte einem finalen Extensions-Schritt (7 min 72°C ) unterzogen. Anschließend wurden die PCR-Produkte in den Topo TA Cloning Vektor (Invitrogen, # K4500-01) umkloniert. Dazu wurden 4 µl frisches PCR-Produkt mit 1 µl Salzlösung (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2) und 1 µl Topovektor für 5 min bei RT inkubiert. Die Proben wurden anschließend auf Eis gestellt, und 2 µl wurden mit Topo 10 Zellen (One Shot Chemical competent cells) gemischt. Die Bakterienzellen wurden für 30 min auf Eis inkubiert und anschließend für 30 sec einem Hitzeschock in einem auf 42°C temperiertem Wasserbad ausgesetzt. Die Zellen wurden daraufhin sofort auf Eis transferiert und mit 250 µl SOC-Medium (Ansatz: 10 ml LB Medium, 200 µl 0,5 M Mg2SO4, 200 µl 1M Glucose, 50 µl 2 M MgCl₂) versetzt. Die Bakterien wurden für 1h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Auf ampicillinhaltige LB-Platten (50 µg Ampicillin/ml) wurden je 10 µl und 100 µl des Transformationsansatzes ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 12 Klone gepickt und ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert. Aus den Bakterienkulturen wurden DNA-Minipräparationen durchgeführt. Die DNA wurde mit Standardprimern (M13 forward Primer, M13 reverse Primer) durch die Firma GATC (Konstanz) ansequenziert.

Einen Tag vor der geplanten Transfektion wurden 3,5 x 10⁵ 293-Zellen (embryonale menschliche Nierenzellen) pro Vertiefung einer 6 Well-Platte ausgesät. Am Tag der Transfektion waren die Zellen zu ca. 40-80% konfluent. 3 µg Gesamt-DNA wurden mit 100 µl Optimem (serumfreies Medium, Gibco #51985-026) gemischt und abzentrifugiert. 12 µl Superfect (Qiagen) wurden zu der DNA–Lösung gegeben und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Zur Komplexbildung wurden die Proben 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen vorsichtig

3 Material und Methoden 17

mit 1x PBS (4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gewaschen. Die DNA-Dendrimer-Komplexe wurden in 600 ul Serum-haltigem Medium aufgenommen, gemischt und auf die Zellen gegeben. Die Zellen wurden mit den Komplexen für 3h bei 37°C inkubiert. Nach Abnahme des komplexhaltigen Mediums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt und für 48h inkubiert. Für Genexpressionstudien wie den Luciferase-Assay und β-Galactosidase Assay wurden die Zellen mit 1x Reporter Lysis Buffer (Promega, # E4030) behandelt und bei –70°C aufbewahrt.

3.3.11 Hefe „Two Hybrid“-System

Für die Expression des klonierten Fusionsproteins wurde der Hefestamm EGY48 verwendet. In diesem Stamm sind die „upstream“ aktivierenden Sequenzen des chromosomalen Leu2 Genes, die für den biosynthetischen Leucin Stoffwechselweg verantwortlich sind, durch 6 LexA Operatoren (DNA-Bindungsstellen) ersetzt. Durch Verwendung dieses Stammes wird die Selektion für eine transkriptionelle Aktivierung bei Ausplattierung auf ein Medium ohne Leucin möglich. Es können nur solche Hefen überleben, die mit einem Plasmid transfiziert worden sind, das die LexA Bindungsdomäne mit einem transaktivierenden Protein als Fusionsprotein exprimiert und dadurch an das LexA- Operon binden kann und die Ablesung des Leucingens ermöglicht. Dieser Stamm wurde nicht-selektiv auf einem Komplett-Medium (YPD=

Yeast extract-peptone-dextrose) kultiviert. Für die Selektion auf eine bestimmte Aminosäure-Biosynthese der verwendeten Hefeplasmide wurden SC-Medien (SC=synthetic complete drop out) verwendet (Golemis and Khazak, 1997). Die Hefen wurden bei 30°C kultiviert, kleine Kulturen wurden in einem Rotor inkubiert, 50 ml Kulturen wurden auf dem Magnetrührer inkubiert. Die Transformation der Hefen mit Plasmid-DNA erfolgte nach der Methode von Agatep, 1998. Proteinextrakte von transformierten Hefen wurden nach Wobbe, 1990 hergestellt. Zur Überprüfung des Aktivitätsprofils des Fusionsproteins wurde der β-Galactosidase-Assay nach Reynolds et al. (1998) durchgeführt. Als Reporterplasmid wurde der Vektor pSH18-14 verwendet. Dieser Vektor enthält einen LexA-Operator, der vor einem Lac-Z Gen liegt, er trägt zusätzlich einen Uracil Selektionsmarker. Die Verwendung dieses Reporterplasmids ermöglicht eine Selektion durch eine Farbreaktion bei Wachstum der Hefe auf Xgal-haltigem Medium oder die Durchführung eines β-Galactosidase Assays, bei dem die Aktivität der durch das LacZ Gen kodierten β-Galactosidase gemessen wird.

18 3 Material und Methoden