Intrazelluläre Lokalisation von P50

Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz ist geeignet, die intrazelluläre Lokalisation eines Proteins zu analysieren. Hierzu wurde das P50 Protein durch monospezifische P50-Peptidantikörper in XTH2- und X1-Zellen nachgewiesen. Die Zellen wurden 5 Stunden vor der Fixierung in BrdU-haltigem Medium inkubiert, dadurch können anschließend mit einem anti-BrdU-Antikörper jene Zellen detektiert werden, die sich gerade in der S-Phase befanden.

Abb. 6: Lokalisation von P50 in Xenopus laevis-Zellen

XTH2-Zellen wurden auf Deckgläschen kultiviert, mit 3,5% Paraformaldehyd fixiert und mit Aceton permeabilisiert. Nach dem Absättigen unspezifischer AK-Bindungsstellen mit BSA wurden die Zellen im Phasenkontrast betrachtet (A), die DNA mit Hoechst 33258 sichtbar gemacht (B) und mit monospezifischen anti-P50-Peptidantikörpern gefärbt. Durch anschließende Inkubation mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppeltem sekundären Antikörpern wurde die Verteilung von P50 analysiert (C).

Parallel dazu wurde eine Tubulinfärbung mit monoklonalen Tubulin-Antikörpern durchgeführt (D). In E-G ist die Immunfluoresezenz von Xenopus laevis X1-Zellen gezeigt. (E) Phasenkontrast, (F) P50-Anfärbung, (G) BrdU-Färbung mit monoklonalen AK.

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Abb. 6 zeigt das Ergebnis einer solchen Untersuchung. Ein Vergleich der Phasen-Kontrastbilder mit den Fluoreszenzsignalen für die DNA (gefärbt mit dem Farbstoff Hoechst 33258) legt dar, daß P50 eine starke Kernanfärbung zeigt. Der Bereich der Nucleoli bleibt dabei ausgespart (vergleiche B und C). Als Kontrolle für die Lokalisation eines cytoplasmatischen Proteins wurde eine Tubulin-Färbung mit einem monoklonalen anti-Tubulin-Antikörper durchgeführt (D). Der BrdU Antikörper färbt die Zellen an, die sich innerhalb des Inkubationszeitraumes gerade in der S-Phase befinden und neue DNA synthetisieren. Ein Vergleich der P50-Anfärbung (F) mit der BrdU-Anfärbung(G) zeigt, daß die Lokalisation von P50 im Zellkern nicht auf Zellen der S-Phase begrenzt ist.

Die indirekte Immunfluoreszenz von XTH2- und X1-Zellen mit monospezifischen P50-Antikörpern hat die Lokalisation des P50 Proteins im Zellkern gezeigt. Um genauere Aussagen über die Wechselwirkung von P50 mit Bestandteilen des Kern treffen zu können, wurden biochemische Fraktionierungen von Zellen und Zellkernen zur weiteren Charakterisierung herangezogen. Durch verschiedene Extraktions- und Zentrifugationsschritte sollten Aussagen über die exakte Lokalisation des Proteins im Kern gemacht werden.

Für die Untersuchungen wurden proliferierende HeLa- und WAK-Zellen verwendet.

Die Zellen wurden in Acetatpuffer mit Digitonin lysiert. Dabei permeabilisiert Digitonin nur die Cytoplasmamembran, während die Kernmembran erhalten bleibt.

Nach niedrigtouriger Zentrifugation befindet sich das Cytoplasma im Überstand. Die Zellkerne werden mit hypotonem Puffer zum Anschwellen und zur Lyse gebracht und ebenfalls niedrigtourig abzentrifugiert (modifiziert nach Hancock, 1974). Der Überstand enthält das Nuclesol mit den löslichen Kernproteinen. Die verbleibenden Kernstrukturen wurden mit NP40-haltigem hypotonem Puffer gewaschen, nach niedrigtouriger Zentrifugation enthält das verbleibende Pellet einen Komplex aus Chromatin und Kernmatrix (vgl. 3.4.6)

Abb. 7 zeigt, daß sich P50 in beiden untersuchten Zelltypen zu etwa 40% in der nucleosolischen und zu etwa 60% in der NP40 Fraktion befindet. Gleiche Ergebnisse wurden durch Fraktionierungen von X1-und XTH2-Zellen erhalten (Daten nicht gezeigt). Das Versuchsergebnis läßt auf ein lösliches Kernprotein schließen, das möglicherweise membranassoziiert vorliegt oder mit Kernstrukturen wechselwirkt.

Die gleichen Proben wurden zur Kontrolle der Fraktionierung mit Antikörpern von Proteinen untersucht, deren Lokalisation bekannt ist. Erwartungsgemäß konnte gezeigt werden, daß Tubulin in der Cytoplasma-Fraktion vorliegt. Die gewonnenen Kernfraktionen (Nucleoplasma, NP40-Wash und Chromatin) wurden mit Mcm4-Antikörpern überprüft. Mcm4 liegt in Übereinstimmung mit Burkhart (1995) an Chromatin gebunden und in löslicher Form vor.

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Abb. 7: Zellfraktionierung

HeLa-Zellen (A) und WAK-Zellen (B) wurden fraktioniert und jeweils gleiche Anteile der Fraktionen in der SDS-PAGE aufgetrennt. Links: Dreistufiges Polyacrylamidgel (15%, 10%, 7,5%) gefärbt mit Coomassie-Blau, rechts: Immunofärbung und prozentuale Verteilung der Proteinmengen auf die Fraktionen. Spur 1: Gesamtzellextrakt von 1,5 x10 ⁶ Zellen, Spur 2: Cytoplasma, Spur 3: Nucleoplasma, Spur 4: NP40-Waschung, Spur 5: ”Chromatin”-Pellet, rechts unten: Immunofärbung mit monospezifischen P50-Peptidantikörpern, Mcm4- und Tubulin-Antikörpern.

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Die bisher dargestellten Befunde zeigen, daß P50 nicht an Chromatin gebunden vorliegt. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, daß P50 nur in bestimmten Phasen des Zellzyklus kurzfristig an Chromatin gebunden ist. Um dies zu überprüfen, wurden HeLa-Zellen durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und Chromatin (modifiziert nach Hancock, 1974) wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Zellzyklus präpariert. Das Ergebnis ist in Abb. 8A dargestellt und zeigt, daß P50 in keiner Phase des Zellzyklus an Chromatin gebunden vorliegt. Die gleichen Proben wurden zur Kontrolle mit monospezifischen Mcm4-Antikörper untersucht. Von dem Mcm4 Protein ist bekannt, daß es von der späten M-Phase bis zu Beginn der S-Phase an Chromatin assoziiert ist, und dann sich dann sukzessiv vom Chromatin ablöst (Ritzi et al., 1998). Als Kontrolle wurde zusätzlich Gesamtprotein von HeLa-Zellen aufgetragen ("total cells"). Die Coomassiefärbung verdeutlicht, daß in allen Präparaten gleiche Mengen an Core-Histonen enthalten sind (siehe Abb. 8A unten). Dies zeigt, daß gleiche Proteinmengen analysiert wurden.

Um zu untersuchen, ob P50 an andere Strukturen des Kerns assoziiert ist, wurde eine Kernmatrixpräparation (Romig et al., 1992) durchgeführt. Von den Fraktionen wurde jeweils die einem Zehntel einer HeLa-Platte entsprechende Menge in der SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und im Immunoblot mit monospezifischen P50-Antikörpern untersucht (vgl. Abb. 8 B). P50 liegt in der Fraktion der löslichen Kernproteine vor. Damit unterscheidet es sich vom SAF-A Protein, das an die Kernmatrix gebunden vorliegt und hier als Kontrolle mit monospezifischen SAF-A Antikörpern untersucht wurde. Die Hälfte der Gesamtmenge von SAF-A liegt salzresistent mit den Kernstrukturen assoziiert vor (Fackelmayer and Richter, 1994).

Diese Befunde deuten darauf hin, daß P50 ein lösliches Kernprotein ist, das nicht an Chromatin oder Kernmatrixstrukturen gebunden ist.

Abb. 8: P50 ist ein lösliches Kernprotein, das nicht an Chromatin oder die Kernmatrix gebunden ist

A: HeLa-Zellen wurden durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und nach Entfernung des Blocks (0 Stunden) in die S-Phase entlassen. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden insgesamt 8 Kulturschalen modifiziert nach Hancock et al (1974) aufgearbeitet. Gleiche Aliquote wurden in einem 10%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit P50-Peptidantikörpern und als Kontrolle mit Mcm4-Antikörpern immungefärbt. Die Histone wurden in einem 15%igem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und durch eine Coomassie Blau Färbung sichtbar gemacht.

B: Eine biochemische Fraktionierung wurde mit Modifikationen nach (Fey and Penman, 1988) durchgeführt

Links: Gleiche Aliquote wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Blau gefärbt. Rechts:

Immunofärbung mit monospezifischen P50- und als Kontrolle mit SAF-A Antikörpern.

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Bei der in Abb. 7 dargestellten Zellfraktionierung und der in Abb. 8 dargestellten Kernmatrixpräparation wurden Detergenzien (NP40 und Triton X100) zur Fraktionierung und damit zur Charakterisierung der Lokalisation von P50 verwendet.

Auffällig war, daß P50 meist in größeren Mengen in den Fraktionen vorliegt, die durch den Einsatz von Detergenzien gewonnen wurden (vgl. NP40-Wash bei der Zellfraktionierung und S1-Fraktion bei der Kernmatrixpräparation). Es sollte nun festgestellt werden, ob P50 auch durch Behandlung der Zellkerne mit steigenden Salzkonzentrationen aus dem Kern extrahiert werden kann. Dazu wurden HeLa-Zellen zunächst mit hypotonem Puffer behandelt, wodurch eine Auftrennung in das Cytosol/

Nucleosol und verbleibenden Kernstrukturen erreicht wurde. Die Zugabe von Magnesium bewirkt eine Verengung der Kernporen und eine deutlich bessere Trennung in Cytosol und Kern (inklusive Nucleosol). Die weitere Extraktion erfolgte wie in Kapitel 3.4.6 beschrieben.

Abb. 9: Magnesiumzugabe verändert das Kernextraktionsverhalten von P50

Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden durch Zugabe von hypotonem Puffer (vgl. 3.4.6) mit und ohne 5mM MgCl₂ aufgebrochen (Überstand Spur 1 und 1`). Die verbleibenden Kerne wurden in drei aufeinanderfolgenden Elutionsschritten mit steigenden NaCl-Konzentrationen extrahiert (100 mM NaCl:

Spur 2 und 2’, 250 mM NaCl: Spur 3 und 3’, 450 mM: Spur 4 und 4’). Zuletzt folgte ein detergenzhaltiger Extraktionsschritt mit RIPA-Puffer (Spur 5 und 5’). Aliquote entsprechend 4x10⁵ Zellen wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit P50- und Cdc6-Antikörpern angefärbt.

Abb. 9 zeigt, daß die Hälfte von P50 bereits bei Zugabe von hypotonem Puffer aus dem Zellkern austritt. Durch steigende Salzbehandlung werden weitere Anteile von P50 aus dem Kern herausgelöst (Spur 2-4). Ein großer Teil von P50 kann jedoch erst durch eine detergenzhaltige RIPA-Extraktion aus dem Kern gelöst werden (Spur 5). Bei Zugabe von 5 mM MgCl2 verändert sich das Extraktionsverhalten von P50 aus dem Kern. Die

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Zugabe von Magnesiumionen führt zu einer Verengung der Kernporen: P50 ist in der löslichen Fraktion (Spur 1’) nicht mehr nachweisbar. Auch die sukzessive Erhöhung von Salz führt nur zu einem Herauslösen von kleinen P50 Anteilen aus dem Kern (Spur 2’-4’). Erst durch die detergenzhaltige Extraktion kann P50 aus dem Kern freigesetzt werden (Spur 5’). Wie auch bei der Zellfraktionierung (vgl. Abb. 7) gezeigt wurde, spricht dieses Ergebnis für zwei Populationen von P50: einer löslichen Population im Nucleosol und einer Population die fester an Kernstrukturen gebunden ist und nur detergenzlöslich ist. Bei diesen Kernstrukturen handelt es sich nachweislich nicht um Chromatin oder die Kernmatrix. Denkbar wäre eine Assoziation des Proteins mit der Kernmembran. Das Auftreten von zwei P50 Populationen gilt jedoch nur bei Abwesenheit von Magnesium. Ist Magnesium zugegen, ist der zuvor lösliche P50 Anteil ebenfalls erst durch Detergenzien aus dem Kern extrahierbar.

Die gleichen Proben wurden zur Kontrolle mit Cdc6-Antikörpern untersucht (vgl. Abb.

9). Der größte Teil des Cdc6 Proteins läßt sich mit 250 mM NaCl aus dem Kern extrahieren (Spur 3/ 3'). Cdc6 tritt bei Behandlung der Zellen mit hypotonem Puffer in geringen Mengen aus dem Kern aus (Spur 1), die Zugabe von Magnesium verhindert dies (Spur1’). P50 unterscheidet sich somit in seinem Kernextraktionsverhalten deutlich von Cdc6.