Charakterisierung der anti-p170-Antikörper

Die bakteriell exprimierten und gereinigten Fragmente wurden zur Immunisierung von insgesamt vier Kaninchen eingesetzt. Ein Kaninchen wurde dabei mit dem rekombinantem Fragment N immunisiert. Mit dem rekombinant hergestelltem Fragment C wurden drei weitere Kaninchen immunisiert und es wurden drei Seren gewonnen (anti C 635, 640, 663). Aus diesen drei Immunseren wurden über eine Proteinaffinitätssäule monospezifische anti-p170-Antikörper präpariert (vgl. 3.4.3). Die vorliegenden p170 spezifischen Antikörper werden in folgender Tabelle zusammengefaßt:

Fragment N 636 Serum anti-p170-Serum

Fragment C 635 monospezifisch monospezifische p170-Antikörper (anti C 635) Fragment C 640 monospezifisch monospezifische p170-Antikörper (anti C 640) Fragment C 663 monospezifisch monospezifische p170-Antikörper (anti C 663)

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Die gewonnenen Antikörper wurden im Immunoblot und im ELISA auf ihre Spezifität untersucht. Abb. 24A stellt die Lage der bakteriell exprimierten p170 Teilfragmente bezogen auf das p170 Gesamtprotein (1335 Aminosäuren) dar. Abb. 24B zeigt die Spezifität der gewonnen p170 Antikörper: im ELISA (links) als auch im Immunoblot (rechts) erkennen die monospezifischen p170 Antikörper (anti C 635) das Fragment C.

Dieses Fragment wird von den rekombinanten Bakterien stark überexprimiert (siehe Coomassie-Färbung Spur 2), und kann in Gesamtextrakt von rekombinanten Bakterien mit p170 monospezifischen Antikörpern nachgewiesen werden (Spur 4). Die Zunahme des Antikörper-Titers während der Immunisierung wurde im ELISA überprüft. Nach der 2. Immunisierung ist ein signifikanter Anstieg des Titers gegen das Fragment C zu erkennen.

Erwartungsgemäß erkennen alle Seren spezifisch p170 (Abb. 24C, Spur 1-8 oben).

Darüberhinaus wird von dem anti-p170-Serum (anti N 636) und einem von drei monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635) zusätzlich ein Protein von 58 kDa in Metaphase-Eiextrakt erkannt (Spur 1 und 3). Dieses Protein wird auch in Interphase-Extrakt von p170-Antikörpern (anti C 635) nachgewiesen (Spur 4) und wird im weiteren als p58 bezeichnet. p58 stellt sich in der Gelelektrophorese mit einem sehr ähnlichen apparenten Laufverhalten wie P50 dar, ist aber, wie weitere Analysen zeigen werden, von P50 verschieden. Möglicherweise handelt es sich bei p58 um ein Carboxy-Terminales Abbauprodukt von p170. Dies würde erklären, warum Antikörper gegen unterschiedliche p170 Fragmente p58 erkennen (vgl. Schematische Darstellung für die Lage der Fragmente in Abb. 24A). Eine unspezifische Kreuzreaktion der verwendeten Antikörper mit p58 ist ebenso denkbar, würde jedoch sehr überraschen, da p58 von zwei unabhängigen Antikörper gegen p170 nachgewiesen wird.

Abb. 24: Die Spezifität der p170-Antikörper

A: Schematische Darstellung der Lage der bakteriell exprimierten Fragmente innerhalb der p170 Proteinsequenz

B: Spezifität der Antikörper im Immunoblot auf bakteriellem Extrakt und im ELISA

Links: Eine 96-Loch-Multititerplatte wurde mit rekombinantem Protein (Fragment C) beschichtet.

Beginnend mit einer Verdünnung von 1: 100 wurden die Seren in einer 1: 1 Verdünnungsreihe aufgetragen

Rechts: Extrakt von induzierten und nicht induzierten Bakterien wurde in der SDS-PAGE aufgetrennt und einmal mit Coomassie Blau (Spur 1 und 2) und ein anderes Mal mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635) gefärbt (Spur 3 und 4).

C: Spezifität der Antikörper im Immunoblot auf Xenopus laevis Meta-und Interphase-Extrakt

Xenopus laevis Meta- und Interphase-Extrakt wurde viermal parallel zueinander gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrocellulose Membran transferiert und mit anti-p170-Serum (anti N 636) (Spur 1 und 2) oder monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635, 640 und 663) (Spur 3-8) untersucht. Alle untersuchten Prä-Immunseren gaben keine positiven Signale bei der Immunfärbung auf Eiextrakt

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p58 wird vom anti-p170-Serum (anti N 636) nur in Metaphase-, nicht aber in Interphase-Extrakt detektiert. Dies wurde in einem weiteren Experiment untersucht, bei dem Metaphase-Extrakt durch Zugabe von Calcium kontrolliert in die Interphase entlassen wurde. Hier konnte kein Abbau von p58 gezeigt werden (Daten nicht gezeigt).

Daraus kann geschlossen werden, daß die Nichtnachweisbarkeit von p58 in Interphase-Extrakt durch das p170 Serum (anti N 636) nicht mit dem Übergang des Eiextrakts von der Metaphase zur Interphase zusammenhängt.

p58 stellt sich darüberhinaus in Metaphase-Extrakt im Nachweis mit dem anti-p170 Serum (anti N 636) als Doppelbande dar (Spur 1). Die Möglichkeit, daß es sich dabei um verschiedene Modifikationsformen von p58 handelt, wurde durch Dephosphorylierungs- und Deglycosylierungsversuche untersucht. Bei diesen Versuchen wurden keine Hinweise auf eine Phosphorylierung oder Glycosylierung von p58 gefunden (Daten nicht gezeigt). Das anti-p170-Serum (anti N 636) erkennt ferner weitere Proteine in Metaphase- und Interphase-Extrakt, über deren Identität keine Aussage getroffen werden kann (bei 94 kDa, 50 kDa, 43 kDa, 30 kDa).

Mit dem Vorliegen von spezifischen p170-Antikörpern stellte sich die Frage, ob diese Antikörper p170 und auch p58 sowie eventuell assoziierte Protein immunfällen können.

Dazu wurden p170-Antikörper an Protein A Sepharose gekoppelt und für eine Immunpräzipitation aus Metaphase-Extrakt verwendet (vgl. 3.4.9). Die Proteine des Immunpellets wurden mit Laemmli-Proben-Puffer eluiert, in der SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit p170-Antikörpern analysiert.

Abb. 25 zeigt, daß Antikörper aus dem Serum 635 und 636 p170 immunpräzipitieren können (Spur 4 und 5) (gleiches gilt für die Seren 640 und 663, Daten nicht gezeigt).

Die schwere Kette des Antikörpers ist in Spur 5 deutlicher zu sehen als in Spur 4, da hier monospezifische p170-Antikörper (anti C 635) verwendet wurde, in Spur 5 dagegen das anti-p170 Serum (anti N 636). Bei Betrachtung der Überstände wird deutlich, daß p170 durch die eingesetzten Seren nahezu komplett aus Metaphase-Extrakt depletiert werden kann (Spur 2 und 3). Im Silbergel ist die p170 Bande schwach erkennbar (Spur 6 und 7), im Vergleich zur Kontrolle mit Präimmunserum wurden unter den verwendeten Bedingungen keine weiteren Proteine co-immunpräzipitiert. p58 konnte auch unter verschiedensten Bedingungen von keinem Serum immunpräzipitiert werden. Möglicherweise ist natives p58 für die verwendeten Antikörper nicht zugänglich. Aus dem Ergebnis der Immunpräzipitation kann geschlossen werden, daß die vorliegenden Antikörper spezifisch für p170 sind und dieses Protein aus Eiextrakt immunpräzipitieren können.

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Abb. 25: Immunpräzipitation mit p170-Antikörpern

Links: Protein A-Sepharose wurde mit je 20 µl Serum (anti N 636) oder 20 µl monospezifischen Antikörpern (anti C 635) über Nacht bei 4°C inkubiert. Das Sepharosematerial wurde mit NET-Puffer gewaschen, mit 20µl Metaphase-Extrakt (1: 4 verdünnt) versetzt und für 1h unter Rollen bei RT inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen und die verbleibenden Immunkomplexe wurden nach sorgfältigem Waschen in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte im Immuno-Blot mit monospezifischen p170-Antikörpern (anti C 635). Die schwere Kette des Antikörpers ist durch ein Sternchen markiert.

Rechts: Silberfärbung des Immunopellets mit monospezifischen p170 Antikörpern (anti C 635) (Spur 6) und anti-p170 Serum (anti N 636) (Spur 7). Es sind keine weiteren Banden als Copräzipitate im Vergleich zur Kontrolle sichtbar.

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Um zu untersuchen, ob p170 mit den gewonnen Antikörpern auch in anderen eukaryontischen Systemen nachgewiesen werden kann, wurden Zellextrakte von menschlichen Zellen, Drosophila-Zellen im Vergleich zu Xenopus laevis Eiextrakt und Zellen im Immunoblot untersucht. Abb. 26 zeigt, daß p170 in embryonalen menschlichen Nieren-Zellen (293-Zellen, Spur 5) von dem anti-p170 Serum (anti N 636) erkannt wird, in HeLa-Zellextrakt (Spur 5) dagegen nicht. Das menschliche p170 Protein stellt sich kleiner dar als das Xenopus laevis p170 Protein, dies stimmt mit der Aminosäurelängen-Heterogenität der beiden Homologe überein (Frosch 1335 aa, Mensch 1244 aa) (vgl. auch Abb. 21). In Drosophila-Zellen konnte mit den verwendeten p170-Antikörpern kein Homolog nachgewiesen werden. Ein Homolog konnte auch bei Datenbankanalysen des vollständig sequenzierten vorliegenden Drosophila-Genoms nicht identifiziert werden.

Abb. 26: Nachweis von p170 in verschiedenen eukaryontischen Organismen

Extrakte verschiedener Zellen (Spur 1 und 2 Meta- und Interphase-Eiextrakt, Spur 3 WAK, Spur 4 HeLa, Spur 5 293 embryonale Nierenzellen, Spur 6 Drosophila (embryonale Schneider S2-Zellen) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Membran transferiert und mit anti-p170 Serum (anti N 636) immundekoriert.

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