Zellen können sehr empfindlich auf Signale aus ihrer Umgebung reagieren. Dies ermöglicht es Einzellern und vielzelligen Organismen, sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Ein differenziertes System zum Informationsaustausch zwischen einzelnen Zellen macht es dem vielzelligen Organismus möglich, jeder einzelnen Zelle bestimmte Funktionen zuzuweisen und ihr Verhalten aufeinander abzustimmen. Schon lange vor dem Auftreten der ersten Vielzeller hatten Einzeller Mechanismen entwickelt, die es einer einzelnen Zelle ermöglichen, das Verhalten einer anderen Zelle zu beeinflussen. So können sich einzellige Eukaryoten wie Hefen gegenseitig die Vorbereitung zur Konjugation signalisieren. Die Aufnahme und Verarbeitung von Reizen in Zellen erfolgt über Signalkaskaden. Diese molekularen Schaltkreise der Zellen werden aus Rezeptoren an der Zelloberfläche,
Ionen-Kanälen, intrazellulären Rezeptorproteinen und regulatorischen Proteinen gebildet.
Diese sind in der Lage, Umweltreize wahrzunehmen, zu verstärken und zu integrieren. In eukaryotischen Zellen wurde ein weit reichendes Netz zur Signalverarbeitung gefunden, dessen Erforschung noch andauert.
Am Anfang steht die Bindung extrazellulärer Signalmoleküle wie z. B. Hormone, Zytokine oder Neurotransmitter an intra- oder extrazelluläre Rezeptoren und deren nachfolgende Aktivierung. Hydrophobe Moleküle wie die Steroidhormone durchqueren die Zellmembran und binden im Zytoplasma an spezifische Rezeptoren.
Diese Hormon-Rezeptor-Komplexe wandern in den Zellkern, wo sie an bestimmte Nukleotid-Sequenzen, so genannte „hormone response elements“, binden und die Transkription bestimmter Gene induzieren oder reprimieren. Hydrophile Hormone wie das Adrenalin, ein von Tyrosin abgeleitetes Katecholamin, oder das Peptidhormon Glukagon können die lipophile Zellmembran nicht passieren. Sie binden an in die Zellmembran integrierte Rezeptoren, die daraufhin ihre Raumstruktur auf der Innenseite der Membran verändern, was ein neues Signal auslöst.
Es werden drei Gruppen von Zelloberflächen-Rezeptoren unterschieden: (i) ionenkanalgekoppelte Rezeptoren, (ii) 7-Helix-Rezeptoren und (iii) katalytische Rezeptoren oder enzymgekoppelte Rezeptoren.
Ionenkanalgekoppelte Rezeptoren dienen der schnellen Signalübertragung im synaptischen Spalt der Neurone. Diese Rezeptoren sind oligomere Membranproteine, die einen ligandengesteuerten Ionenkanal bilden. Durch die Bindung von Neurotransmittern kommt es zum kurzfristigen Öffnen oder Schließen von Kanälen in der synaptischen Membran. Die Folge ist eine Ionenkonzentrationsveränderung über die Membran, welche die Erregbarkeit der Zelle innerhalb kürzester Zeit verändert.
7-Helix-Rezeptoren leiten äußere hormonelle oder sensorische Signale ins Zellinnere weiter. Hierbei handelt es sich um integrale Membranproteine, wie z. B. den β-adrenergen Rezeptor des Adrenalins. Diese sind über sieben α-Helices in der Zellmembran verankert. Der Hormon-Rezeptor-Komplex stimuliert das Guanosintriphosphat (GTP)-bindende Protein (G-Protein) an der Innenseite der
Zytoplasmamembran. Dieses leitet wiederum das Signal über Second-Messenger wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) oder nachgeschaltete Effektorproteine weiter.
Bei den enzymgekoppelten Rezeptoren oder den Rezeptoren mit eigener katalytischer Aktivität handelt es sich meistens um Proteinkinasen, die in der Zielzelle spezifische membranständige und zytosolische Proteine in einer Kaskade phosphorylieren und so das Signal zum Zellkern weiterleiten. Die Rezeptor-Tyrosinkinasen, z. B. der Insulin-Rezeptor oder der des Epidermiswachstumsfaktors (EGF), gehören zu dieser Gruppe, auf die im Folgenden näher eingegangen wird.
2.7.1 Die MAPK-Signalkaskade
Ein weit verzweigtes Netz aus Proteinkinase-Kaskaden und anderen Signaltransduktionswegen sorgt für die Reaktion der Zelle auf äußere Einflüsse, den interzellulären Informationsaustausch und die Koordination der Antworten der Zelle.
MAPKs gehören zu den Schlüsselelementen bei der Regulation der Differenzierung, der Proliferation, der Apoptose und den Stressantworten eukaryotischer Zellen (KYRIAKIS et al. 2001). Weiterhin spielen MAPK-Signaltransduktionswege eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis, der Psoriasis oder der Inflammatory Bowel Disease (HOMMES et al. 2003). Die Weiterleitung von Signalen durch die MAPK-Kaskade erfolgt durch Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen (Abb. 3). Nach der Bindung von spezifischen Liganden an Rezeptoren der Zelloberfläche kommt es zur Phosphorylierung einer MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK), die wiederum eine MAP-Kinase-Kinase (MAPKK) aktiviert. MAPKs werden durch für sie hochspezifische MAPKKs phosphoryliert und phosphorylieren anschließend wiederum unterschiedliche Ziele wie Transkriptionsfaktoren oder MAPK-aktivierte Proteinkinasen (MAPKAPKs). Die MAPKs können durch mehrere MAPK-Phosphatasen (MAPKPs) dephosphoryliert und inaktiviert werden. Jede MAPK besitzt ihre spezifischen MAPKKs, MAPKAPKs und MAPKPs. Im Gegensatz dazu können MAPKKs durch mehr als eine MAPKKK aktiviert werden, was die Komplexizität und Diversität der MAPK-Signalkaskade noch weiter erhöht. Vermutlich spricht jede MAPKKK auf einen ganz bestimmten Stimulus an.
Stimuli: z. B. Zytokine,
Abb. 3: Schematische Darstellung der MAPK-Signalkaskade. Verschiedene extrazelluläre Stimuli können nach einer Rezeptor-Ligand-Interaktion die Familie der MAPKs aktivieren. Diese aktivieren sich untereinander durch das Anhängen von Phosphatgruppen an Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Reste (modifiziert nach HOMMES et al. 2003).
Es werden bisher vier Gruppen in der MAPK-Familie der Säuger unterschieden: die
„extracellular signal-related kinases“ (ERK)-1/2, p38 Proteine (p38α/β/γ/δ), „c-Jun N-terminal kinases/ stress-activated protein kinases“ (JNK/SAPK)-1/2/3 und die ERK-5 (TANOUE und NISHIDA 2003). Die ERK-1/2 werden hauptsächlich durch mitogene Stimuli aktiviert, wohingegen p38 und JNK/SAPK überwiegend durch Stressreize oder inflammatorische Zytokine aktiviert werden. Die ERK-5 wird durch EGF, den neuronalen Wachstumsfaktor und durch osmotischen oder oxidativen Stress aktiviert.
Es sind bereits 22 Proteine gefunden worden, die zur Familie der MAPKs der Säuger gehören (PEARSON et al. 2001). Sie werden durch Phosphorylierung ihrer Threonin-
und Tyrosin-Reste des gemeinsamen Threonin-X-Tyrosin-Motivs aktiviert (PEARSON et al. 2001). Typisch für MAPKs ist die Phosphorylierung ihrer Substrate an Serin- oder Threonin-Resten vor einem Prolin-Rest. Die dreidimensionale Struktur der MAPKs besteht aus zwei Domänen. Die NH2-terminale kleinere Domäne wird aus den Subdomänen I-IV gebildet, liegt hauptsächlich in einer antiparallelen β-Faltblatt-Struktur vor und ist primär an der Bindung und Orientierung der Nukleotid-Substrate in Form von Adenosintriphosphat (ATP) oder GTP beteiligt. Die größere COOH-terminale Domäne besteht aus den Subdomänen VI-XI und ist überwiegend α-helikal. Sie ist verantwortlich für die Bindung der Peptidsubstrate und veranlasst den Phosphat-Transfer. Die beiden Domänen werden durch die Subdomäne V miteinander verbunden. Die tiefe Furche zwischen beiden Domänen stellt das katalytische Zentrum dar (PEARSON et al. 2001). MAPKs besitzen charakteristische Aminosäuresequenzen, besonders Reste in den Subdomänen VIb und VIII sind hoch konserviert (KÜLTZ 1998).
Abb. 4: Unphosphorylierte Struktur von ERK-2. ATP bindet im katalytischen Zentrum im Inneren der tiefen Furche zwischen beiden Domänen. Substrate binden an der Oberfläche der Furche. Die MAPK-Aktivität wird durch die Phosphorylierung eines Tyrosin(185)- und eines Threonin(183)-Restes reguliert, die sich an der so genannten Aktivierungslippe befinden (PEARSON et al. 2001).
In den letzten 10 Jahren wurden bei höheren Eukaryoten große Fortschritte in der Aufklärung der Verbindungen einzelner Signaltransduktionsschritte untereinander erreicht. Dies wurde durch die große Anzahl schon klonierter Gene und durch spezifische Antikörper möglich. MAPK-spezifische Inhibitoren, die mit essenziellen regulatorischen Prozessen der Zellen interferieren, wurden bereits gefunden (LEE et al. 1994, WILSON et al. 1997). Sie könnten potenzielle Therapeutika gegen Krankheiten wie den durch die Dysregulation der Zelldifferenzierung und Proliferation verursachten Krebs oder gegen bereits oben erwähnte entzündliche Erkrankungen darstellen. Ein MAPK-Inhibitor gegen die erhöhte ERK-Aktivität im Kolon-Karzinom hemmt das Tumorwachstum in der Maus und befindet sich zurzeit in klinischen Studien der Phase I (SEBOLT-LEOPOLD et al. 1999). In einer Pilotstudie an Morbus-Crohn-Patienten erwies sich ein MAPK-Inhibitor als potenter Entzündungshemmer, der die Phosphorylierung sowohl von p38 als auch von JNK inhibiert (HOMMES et al.
2002).
2.7.2 Proteinkinasen und Proteinphosphorylierungen bei Trypanosomatiden Im heteroxen Entwicklungszyklus der Leishmanien sind die Parasiten einer grundlegenden Veränderung ihrer Umgebung unterworfen, auf die sie mit einem Gestaltwechsel reagieren (siehe 2.2). Des Weiteren gehen sie im Verlauf ihrer Entwicklung im promastigoten Stadium von der teilungsfähigen prozyklischen in die nicht teilungsfähige metazyklische Form über. Diese Komplexizität ihres Lebenszyklus setzt große Veränderungen in ihrer Genexpression voraus. Die Registrierung von Reizen wie Temperatur- und pH-Wert-Änderungen der Umgebung und die koordinierte Antwort darauf werden wie bei anderen Eukaryoten über Signaltransduktionswege weitergeleitet und verarbeitet. In den Trypanosomatiden wurden Gene entdeckt, die Genen in höheren Eukaryoten ähneln und die für Moleküle kodieren, die an der Signaltransduktion beteiligt sind (Abb. 5). So fand man adenylatcyclasehomologe Rezeptoren bei L. donovani (SANCHEZ et al. 1995).
Jedoch gibt es bei den Trypanosomatiden keinen Hinweis darauf, dass bei der Aktivierung der Adenylatcyclasen trimere G-Proteine wie bei den höheren Eukaryoten beteiligt sind (PARSON und RUBEN 2000). cAMP ist ein allosterischer Effektor von Proteinkinasen A. Gene, die für PKA-homologe Moleküle kodieren, wurden bereits identifiziert (PARSON und RUBEN 2000). Der Abbau des cAMPs wird
durch Phosphodiesterasen katalysiert. Weitere Moleküle wie das cAMP, die mit extrazellulären Liganden interagieren, sind bisher nicht bekannt. Trypanosomatiden besitzen wie höhere Eukaryoten Mechanismen zur Produktion und Terminierung Ca2+-Ionen-vermittelter Signale. In Trypanosoma brucei werden Ca2+-Ionen im Kern gespeichert (XIONG und RUBEN 1998). Weiterhin besitzen sie drei verschiedene Zellkompartimente, die energieabhängig Ca2+-Ionen transportieren: das Mitochondrium, die Zytoplasmamembran und die Azidokalzisomen (ZILBERSTEIN 1993). Außerdem besitzen die Trypanosomatiden eine Reihe von Ca2+-bindenden Proteinen (CaBPs), u. a. Calmodulin, welche die Ca2+-Wirkung vermitteln (FLAWIÀ et al. 1997). Des Weiteren spielen einige Inositolphosphate und Phosphatidylinositolphosphate als „second messengers“ eine wichtige Rolle (PARSONS und RUBEN 2000).
Kern
Abb. 5: Vereinfachte, schematische Übersicht der Signalwege der eukaryotischen Zelle. Viele der in Säugerzellen vorkommenden Komponenten und Verbindungen konnten bisher noch nicht bei den Trypanosomatiden identifiziert werden. PDE: cAMP-Phosphodiesterase; PIK:
Phosphatidylinositol-Kinasen; PIPLC: Phospholipase C; PKA: cAMP-abhängige Proteinkinase; Ptdlns: Phosphatidylinositol; SH2: Src-Homologie-Region 2. Unterbrochene Linien/schwarzer Hintergrund: fehlende Interaktionen/Komponenten; durchgezogene Linien/weißer Hintergrund:
bekannte Interaktionen/Komponenten. (verändert nach PARSONS und RUBEN 2000)
Es wurden zahlreiche Unterschiede in den Proteinphosphorylierungsmustern und in den Proteinkinase-Aktivitäten während der unterschiedlichen Entwicklungsstadien festgestellt (DELL und ENGEL 1994, SAAR et al. 1998). So sind bei den Trypanosomatiden cyklinabhängige-Kinase 2 (CDK2)-ähnliche Kinasen bekannt. Es gelang, fünf dieser cyclinabhängigen Kinasen in T. brucei zu identifizieren
(HAMMARTON et al. 2000). Des Weiteren wurden in T. brucei zwei funktionelle Cycline gefunden (HELLEMOND et al. 2000). In Leishmanien wurden bisher drei homologe cyclinabhängiger Kinasen entdeckt (MOTTRAM et al. 1993, GRANT et al.
1998, WIESE et al. 2003). Die Entdeckung von MAPK-homologen Proteinen macht einen solchen Signaltransduktionsmechanismus auch bei den Trypanosomatiden wahrscheinlich. Es wurde bereits ein MAPK-homologes Potein von HUA und WANG (1994) in T. brucei beschrieben. Etwas später gelang die Klonierung eines MAPK-homologen Proteins, LmxMPK1, aus L. mexicana (WIESE 1998). Die Übereinstimmung der Aminosäure-Sequenz dieser MAPK mit einer MAPK in L.
braziliensis liegt bei 94,5 % und in L. amazonensis bei 98,7 % (WIESE und GÖRCKE 2001). Mittels degenerierter Oligonukleotid-Primer, die für hochkonservierte Regionen in zwei katalytischen Domänen kodieren, wurde das L. mexicana-Genom auf weitere MAPK-homologe DNA-Sequenzen mittels PCR untersucht. So konnten die Gene acht weiterer MAPK-homologer Proteine kloniert und sequenziert werden, die jeweils als eine Kopie im haploiden Genom von L. mexicana vorliegen (WIESE et al. 2003b). Auch diese MAPKs weisen eine große Ähnlichkeit der Aminosäure-Sequenz zu anderen Leishmania-Arten auf. Zu dieser Gruppe gehört LmxMPK5. Die Länge seines offenen Leserasters beträgt 1158 bp. Das Protein besteht aus 386 Aminosäuren und besitzt ein kalkuliertes Molekulargewicht von 43,9 kDa. Für eine genauere Klassifizierung der neun MAPK-homologen Proteine in L. mexicana wurden ihre Aminosäuresequenzen mit kinasespezifischen Sequenzen verglichen (KÜLTZ 1998). Sie gehören alle der Gruppe der ERKs an (WIESE et al. 2003b). Da bereits fünf Homologe im Genom von T. brucei identifiziert wurden, ist zu erwarten, dass alle MAPK-Homologe in Leishmania auch in Trypanosoma zu finden sind. So existiert eine zur LmxMPK4 homologe MAPK2 in T. brucei (TbMAPK2), von der über Deletionsanalyse gezeigt wurde, dass sie an der Regulation der Differenzierung von der im Blutstrom des Säugers lebenden Form zur prozyklischen Form beteiligt ist (MÜLLER et al. 2002). Die Interaktionspartner der bereits gefundenen MAPKs sind bisher nicht bekannt.
Die Deletion der gefundenen MAPKs und die Identifikation kinasespezifischer Aminosäuren und Sequenzmotive ermöglicht die Herstellung von Mutanten zur Untersuchung der Funktion dieser Moleküle. So wurde eine MAPKK bei Leishmania chagasi gefunden (LI et al. 1996), deren homologes Protein bei L. mexicana einen
Einfluss auf die Flagellenlänge der promastigoten Stadien besitzt (WIESE et al.
2003a). Über die Deletionsanalyse können in Protozoen potenzielle Zielstrukturen gefunden werden, deren Hemmung durch Therapeutika die Signaltransduktionskaskade unterbricht und so die Proliferation oder die Differenzierung der Parasiten stoppt. In L. mexicana wurde auf diese Weise mit LmxMPK1 bereits eine mögliche Zielstruktur gefunden (WIESE 1998). Diese MAPK ist essenziell für die Proliferation und das Überleben der amastigoten Stadien in murinen Makrophagen. Ob auch LmxMPK5 einen Einfluss auf die Proliferation oder die Differenzierung nimmt, soll durch die Charakterisierung des Phänotyps der Doppeldeletionsmutante, LmxMPK5-/-, gezeigt werden.