5
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2 LmxMPK5-/re, Klon 1.1 LmxMPK5-/re, Klon 2.1
*
Abb. 32: Verlauf der Fußsohleninfektion von BALB/c-Mäusen mit LmxWT sowie mit den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- und mit den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re. Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte von fünf Tieren, die Balken stellen die Standardabweichung dar. (*) zeigt die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen LmxWT und den Klonen 1.1 (P=0,00048) und 2.1 (P=0,0005) von LmxMPK5-/re.
4.5 Lokalisation von LmxMPK5
Um LmxMPK5 im Parasiten direkt sichtbar zu machen und zu lokalisieren wurde es an das GFP gekoppelt. Dieses Protein wurde in Aequorea victoria entdeckt (SHIMOMURA et al. 1962) und hat sich als ein guter Marker für Genexpression und Proteinlokalisation etabliert. Das hier verwendete eGFP gehört mit seinen phenolattragenden Chromophoren in die Klasse 2 der GFP-Varianten. Diese Klasse wird auf Grund ihrer starken Leuchtkraft und ihres Anregungsspektrums ähnlich dem
Fluoreszein am häufigsten benutzt (TSIEN 1998). Die Herstellung des chimären LmxMPK5-eGFP-Proteins erlaubte es, die Expression und Lokalisation im amastigoten und promastigoten Stadium mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.
4.5.1 Klonierungsstrategie
Es wurde ein LmxMPK5-eGFP-Konstrukt hergestellt und durch homologe Rekombination in den rRNA-Genlokus des LmxWT und der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- integriert. Mit der Integration von DNA-Kassetten in Genomregionen, die durch die RNA-Polymerase II transkribiert werden, wird kein sehr hohes Transkriptionsniveau erreicht. So sind bisher keine starken RNA-Polymerase II-Promotoren in den Trypanosomatiden bekannt (CLAYTON 1999). Im Gegensatz dazu gibt es RNA-Polymerase I-Promotoren, die einer starken Expression von den dahinterliegenden Genen führen (RUDENKO et al. 1991, LODES et. al. 1995). Um ein hohes und gleichmäßiges Expressionsniveau von LmxMPK5-eGFP sicherzustellen, wurden deshalb für die Expressions-Kassette flankierende Regionen gewählt, die eine Integration stromabwärts eines genomischen rRNA-Promotors in die Sequenz des für die kleine Untereinheit der rRNA (ssu-rRNA) kodierenden Gens ermöglichte. Diese ssu-rRNA ist universell und wird daher in allen Parasitenstadien exprimiert. Der RNA-Polymerase I-Promotor sorgt für hohe transgene Expressionsniveaus in den Trypanosomatiden. Bei diesen Organismen ist eine Steuerung der Expression von proteinkodierenden Genen über den Polymerase I-Promotor möglich, da ein SL-Transkript (oder Miniexon) an das 5`-Ende der prä-mRNAs post-transkriptional durch Trans-Spleißen gehängt wird (AGABIAN 1990). In den verschiedenen Stadien des Lebenszyklus werden die Expressionsniveaus über post-transkriptionale Modulation reguliert. Diese Modulation ist abhängig von der IR, die sich 3` der kodierenden Sequenz befindet. Daher sollten in dieser DNA-Kassette die Reportergene von der IR des gut charakterisierten Cystein-Protease B 2.8-Genklusters gefolgt werden, von dem bekannt ist, dass es im amastigoten Stadium in L. mexicana stark exprimiert wird (MOTTRAM 1997).
4.5.2 Herstellung des LmxMPK5-eGFP-Konstruktes
Das Plasmid pBNX-LMPK-eGFP wurde mittels XhoI und NcoI geschnitten und das 3629 bp große eGFP-tragende Fragment isoliert (Abb. 33A). In einem LmxMPK5-Fragment wurden eine NcoI- und eine XhoI-Schnittstelle mittels PCR unter der Verwendung der Oligonukleotide mpk5xhoI.for und mpk5ncoI.rev eingefügt. Das Amplifikat wurde aufgereinigt und anschließend mit XhoI und NcoI geschnitten (Abb.
33B). Dieses Fragment wurde mit dem eGFP-Fragment ligiert und das entstandene Plasmid, pBNX-MPK5-eGFP-1, in E. coli XL-1 Blue eingebracht und amplifiziert (Abb. 33C). Um die korrekte Sequenz nach der Ligation zu kontrollieren, wurde das 3`-Ende von LmxMPK5 in diesem Plasmid mit dem Oligonukleotid mpk5_1.for sequenziert. Die Plasmide pBNX-MPK5-eGFP-1 und pBSII-MAPKIN14SI wurden mit AatII und MscI geschnitten (Abb. 33C und D). Das den Anfang von LmxMPK5-tragende Fragment aus pBNX-MPK5-eGFP-1 wurde gegen das aus pBSII-MAPKIN14SI ersetzt, weil dieses vollständig sequenziert und mutationsfrei war. Das in der Ligation neu entstandene pBNX-MPK5-eGFP-2 (Abb. 33E) wurde mit XhoI und XbaI geschnitten und das LmxMPK5-eGFP-tragende XhoI/XbaI-Fragment isoliert.
Das Plasmid pSSU-int-LMPK-eGFP-lmpbds-pac, welches die ssu-Sequenzen zur Integration in den rRNA-Lokus und die IR des Cystein-Protease B 2.8-Genklusters trug, wurde ebenfalls mit XhoI und XbaI geschnitten (Abb. 33F) und mit dem LmxMPK5-eGFP-Fragment ligiert.
Das hieraus entstandene Plasmid pSSU-int-MPK5-eGFP-lmpbds-pac (G) wurde mit PacI und PmeI geschnitten. Das erzeugte Fragment bestand aus LmxMPK5-eGFP, der IR des Cystein-Protease B 2.8-Genclusters und dem Gen der Puromycin-Acetyltransferase. Diese DNA-Kassette wurde von den ssu-rRNA kodierenden Gensequenzen flankiert. Das Fragment wurde mittels Elektroporation in den LmxWT und in die Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- eingeschleust.
A B
C
D
E
F
G
MPK5 XhoI NcoI
A B
C
D
E
F
G
MPK5 XhoI NcoI
Abb. 33: Vereinfachtes Klonierungschema zur Herstellung von pSSU-int-MPK5-eGFP-lmcpbds-pac. Die Plasmide pBNX-LMPK-eGFP (A) und das LmxMPK5-PCR-Produkt (B) wurden mit XhoI und NcoI geschnitten und zu pBNX-MPK5-eGFP-1 (C) ligiert. Dieses und pBSIIMPKIN14SI (D) wurden mit AatII und MscI geschnitten und zu pBNX-MPK5-eGFP-2 (E) ligiert. Dieses Plasmid und pSSU-int-LMPK-eGFP-lmcpbds-pac (F) wurden mit XhoI und XbaI geschnitten und zu pSSU-int-MPK5-eGFP-lmcpbds-pac (G) ligiert. Das DNA-Fragment zur homologen Rekombination wurde durch Restriktion von pSSU-int-MPK5-eGFP-lmcpbds-pac mit PmeI und PacI gewonnen.
Nach 10 Tagen unter Selektionsdruck mit 40 µM Puromycin konnten vom LmxWT sechs Klone, von dem Klon 1 der Doppeldeletionsmutante acht neue Klone und vom Klon 2 sechs neue Klone isoliert werden. In einer SDS-PAGE wurde das Lysat von jeweils 2 x 107 Leishmanien aufgetrennt und mittels Immunoblot mit einem affinitätsgereinigten Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 getestet.
Klon 2.G1 Klon 2.G2 Klon 2.G3
Klon 1.G1 Klon 1.G2
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
47,5 kDa
Klon 2.G1 Klon 2.G2 Klon 2.G3
Klon 1.G1 Klon 1.G2
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
Abb. 34: Kontrolle der Expression von LmxMPK5-eGFP. Immunoblot mit Ganzzell-Lysat aus promastigoten Stadien aus einer Kultur mit affinitätsgereinigtem Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5. Je Probe wurden 2 x 107 Leishmanien aufgetragen.
LmxWT und die Klone G1–G3 LmxWT+MPK5-eGFP wiesen eine deutliche 43,9 kDa schwere LmxMPK5-Bande auf (Abb. 34). Außerdem zeigt sich eine schwächere Bande von ca. 55 kDa bei den Klonen G1–G3 von LmxWT+MPK5-eGFP. Hierbei handelte es um das LmxMPK5-eGFP-Konstrukt. Die Schwäche dieser Bande lässt sich dadurch erklären, dass das verwendete Antiserum gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 gerichtet ist, der allerdings mit dem eGFP verbunden und auf Grund der Proteinfaltungsstruktur für das Antiserum nicht so gut zugänglich ist. Bei den Klonen 1.G1 und 1.G2 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP sowie den Klonen 2.G1–2.G3 war wie zu erwarten nur die schwache LmxMPK5-eGFP-Bande zu erkennen. Mit gleichem Probenauftrag wurde der Immunoblot mit einem monoklonalen Antikörper gegen GFP wiederholt (Abb. 35). Es zeigte sich bei den Klonen G1–G3 von
LmxWT+MPK5-eGFP und bei Klonen 1.G1, 1.G3 und 2.G1–2.G3 von +MPK5-eGFP die deutliche, ca. 55 kDa schwere MPK5-GFP-Bande.
Zusammenfassend zeigten beide Immunoblots, dass LmxMPK5-eGFP in acht der getesteten Klone exprimiert wurde.
LmxWT
LmxMPK5-/-+ MPK5-eGFP
Klon 2.G1 Klon 2.G2 Klon 2.G3
Klon 1.G1 Klon 1.G2
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
47,5 kDa
Klon 2.G1 Klon 2.G2 Klon 2.G3
Klon 1.G1 Klon 1.G2
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
LmxWT + MPK5-eGFP
Klon G1 Klon G2 Klon G3
47,5 kDa
Abb. 35: Immunoblot mit Ganzzell-Lysat aus promastigoten Stadien einer Kultur mit einem monoklonalen Antikörper gegen GFP aus der Maus. Je Probe wurden 2 x 107 Leishmanien aufgetragen.
4.5.3 Infektionsverlauf im Mausmodell
Mit dem vom Klon 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP sowie mit dem Klon 2.G2 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP wurde jeweils eine Gruppe von fünf Mäusen infiziert.
Es wurden jeder Maus 1 x 107 promastigote Stadien in die Fußsohle des rechten Hinterlaufs injiziert. Im Abstand von 4 Wochen wurde die Differenz der Fußdicken der Hinterläufe wiederholt gemessen.
Wochen p. i.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Differenz der Dicken des infizierten und nicht infizierten Fußes (mm) 0 1 2 3 4 5 6
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2
LmxMPK5-/- + MPK5-eGFP, Klon 1.G1
*
*
Abb. 36: Verlauf der Fußsohleninfektion von BALB/c-Mäusen mit LmxWT, mit dem Klon 1 von sowie dem Klon 1.G1 von +LmxMPK5-eGFP. Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte von 5 Tieren, die Balken stellen die Standardabweichung dar. (*) zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen LmxWT und LmxMPK5-/- +LmxMPK5-eGFP (P=0,0023, Woche 26) und zwischen LmxMPK5-/- +LmxMPK5-eGFP und den Klonen von LmxMPK5-/- (P<0,0005, Woche 45)
Durch die Integration von LmxMPK5-eGFP in den rRNA-Genlokus der Doppeldeletionsmutante wurde die Infektiosität des LmxWT nicht vollständig wiedererlangt. Dennoch war eine deutliche Fußdickenzunahme über die Zeit zu verzeichnen, sodass nach 46 Wochen auf Grund hochgradiger Ulzeration der infizierten Füße und Anzeichen einer Viszeralisation der Leishmaniose die Tiere getötet wurden. Mittels eines Immunoblots wurde in den aus den Mäusen isolierten amastigoten Stadien mit einem polyklonalen Antiserum gegen GFP die Expression von LmxMPK5-eGFP nachgewiesen.
4.5.4 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung
Mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden Nativpräparate von Promastigotenstadien betrachtet. Sie zeigten eine deutliche grüne Fluoreszenz des Zellkörpers und der Geißel. Jedoch war bei allen eine runde Fläche im Zellkörper ausgespart, bei der es sich vermutlich um den Zellkern handelte (Abb. 37). Dieselbe Beobachtung wurde sowohl nach der In-vitro-Transformation bei amastigoten Stadien gemacht als auch bei in vitro makrophageninfizierenden amastigoten Stadien (Abb. 39) und bei frisch aus der Maus isolierten Parasiten (Abb. 38). Unterschiede in der Fluoreszenzintensität der einzelnen Entwicklungsstadien wurden nicht festgestellt.
Abb. 37: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme promastigoter Stadien.
Nativpräparat von promastigoten Stadien aus einer Kultur des Klons 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP. Die Länge der Balken entspricht 10 µm.
Abb. 38: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme amastigoter Stadien.
Nativpräparat von frisch aus der Maus isolierten amastigoten Stadien des Klons 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP. Die Länge des Balkens entspricht 10 µm.
Abb. 39: Infizierter muriner Peritonealmakrophage. (A) Phasen-kontrastmikroskopische und (B) fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme eines Nativpräparates von einem mit dem Klon 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP infizierten murinen Peritonealmakrophagen. Die Länge des Balkens entspricht 10 µm.
4.5.5 Immunfluoreszenz
Um sicher zu gehen, dass es sich bei der nicht fluoreszierenden Fläche im Zellkörper um den Zellkern der Leishmanien handelte, wurde eine Immunfluoreszenz mit promastigoten Stadien kombiniert mit einer DAPI-Färbung vorgenommen. Das affinitätsgereinigte Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 erwies sich für eine Immunfluoreszenz mit dem LmxWT wegen starker unspezifischer Bindungen als ungeeignet. Die Negativkontrollen, die Klone 1 und 2 der Doppeldeletionsmutante, zeigten eine ebenso starke Immunfluoreszenz wie der LmxWT. Daher wurde als erster Antikörper ein polyklonales Antiserum aus Kaninchen gegen GFP verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde ein Cy3-gekoppelter Antikörper gewählt. Im selben Schritt wurden die Leishmanien mit DAPI gefärbt. Als Negativkontrolle wurden die Klone 1.G1 und 2.G1 von +MPK5-eGFP nur mit dem sekundären Antikörper und DAPI behandelt. Als eine weitere Negativkontrolle diente LmxWT, der sowohl mit dem primären als auch mit dem sekundären Antikörper getestet wurde. Im Fluoreszenzmikroskop wurde mit einer Anregungswellenlänge von 573 nm die Immunfluoreszenz und bei 461 nm die DAPI–Färbung betrachtet. Die Immunfluoreszenz zeigte wie schon das Nativpräparat, dass die Klone 1.G1 und 2.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP eine runde nicht fluoreszierende Fläche im Zentrum des Zellkörpers besaßen (Abb. 40C).
Auch die Geißeln wiesen eine Fluoreszenz auf. Wurden im so genannten „overlayer“
die beiden Fluoreszenzbilder übereinander gelegt, so war eindeutig zu sehen, dass es sich hierbei um den Zellkern handelte (Abb. 40D). Die Negativkontrollen wiesen keine Immunfluoreszenz auf.
Abb. 40: Mikroskopische Aufnahmen von fixierten promastigoten Stadien des Klons 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP nach Anfärbung mit DAPI sowie einem GFP-spezifischen Primärantikörper und Cy-3-gekoppelten Sekundärantikörper. (A) Phasenkontrastmikroskopie; (B) Fluoreszenz-mikroskopie bei 461 nm (DAPI) und (C) bei 573 nm (Cy-3); (D) „over layer“
von (B) und (C). Die Länge des Balkens entspricht 10 µm.
4.5.6 Immunelektronenmikroskopie
In der Immunelektronenmikroskopie mit einem polyklonalen Antiserum aus Kaninchen gegen GFP wurde LmxMPK5-eGFP im Klon 1.G1 von LmxMPK5-/-+MPK5-GFP lokalisiert. Die Abb. 41 zeigt einen repräsentativen Parasiten im promastigoten Stadium mit im gesamten Zytosol verteilten Signalen, die auffallend häufig Aggregate bildeten. Eine genauere Zuordnung zu bestimmten Zellkompartimenten war nicht möglich.
Abb. 41: Immunelektronenmikroskopische Aufnahme eines promastigoten Stadiums des Klons 1.G1 von LmxMPK5-/-+MPK5+eGFP mit einem polyklonalen Antiserum aus Kaninchen gegen GFP. Die Länge des Balkens entspricht 1 µm.
5 Diskussion
MAPKs sind Schlüsselelemente bei der Differenzierung, der Proliferation, der Apoptose und den Stressantworten eukaryotischer Zellen (CHANG und KARIN 2001). Sie spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen oder bei Krebs (siehe 2.7.1). Deshalb stellen sie viel versprechende Zielstrukturen für Therapeutika dar. So können spezifische MAPK-Inhibitoren die Signaltransduktionskaskade unterbrechen und beispielsweise die Proliferation entarteter Zellen stoppen. Auch bei parasitären Infektionen wie z. B. bei der Leishmaniose werden Kinaseinhibitoren als potenzielle Wirkstoffe diskutiert (DÖRIG et al. 2002, HAMMARTON et al. 2003). Durch die spezifische Hemmung von MAPKs des Parasiten könnten seine Differenzierung und Proliferation verhindert werden.
Obwohl bereits eine große Anzahl von MAPKs in Säugerzellen identifiziert wurde (PEARSON et al. 2001), ist über MAPKs bei Leishmania nur sehr wenig bekannt. Die erste in L. mexicana identifizierte MAPK ist LmxMPK1 (WIESE 1998). Diese MAPK ist essenziell für die Proliferation und das Überleben der amastigoten Stadien in murinen Makrophagen. Mittels degenerierter Oligonukleotid-Primer, die für hochkonservierte Regionen in zwei katalytischen Domänen kodierten, wurde das L.
mexicana-Genom auf weitere MAPK-Homologe in der PCR untersucht. So stieß man auf acht weitere Gene in L. mexicana (WIESE et al. 2003b). Zu dieser Gruppe gehörte auch LmxMPK5. LmxMPK5 weist eine Aminosäure-Übereinstimmung von 59 % zu einer MAPK (Genbank-Registrierungsnummer 007863) von T. brucei auf, jedoch ist deren Funktion unbekannt (WIESE et al. 2003b). Die Sequenzähnlichkeiten der Proteinkinasen zu anderen Eukaryoten liegen in der Regel zwischen 40 und 50 % und nur sehr selten bei fast 60 % (DÖRIG et al. 2002). Dies macht es schwierig, durch den Sequenzvergleich Aussagen über die Funktion der Kinasen zu treffen. Vielmehr ist es notwendig, die Rolle jeder einzelnen Proteinkinase im Parasiten zu untersuchen.
Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob LmxMPK5 eine Rolle bei der Zellteilung und Differenzierung in den unterschiedlichen Entwicklungsstadien von L. mexicana spielt. Hierzu sollte der Phänotyp der Doppeldeletionsmutanten von LmxMPK5 charakterisiert werden. Des Weiteren sollte versucht werden, LmxMPK5 zu
lokalisieren. Hierzu wurde ein DNA-Konstrukt hergestellt, das für ein Fusionsprotein aus LmxMPK5 und dem grünfluoreszierenden Protein (eGFP) kodiert, und in den rRNA-Lokus von L. mexicana integriert.