3.12.1 Agarosegelelektrophorese von DNA
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten für analytische Zwecke wurden 0,9 %-, für Southern Blots 0,8 %-Agarosegele aus „electrophoresis grade“-Agarose und für präparative Gele 0,7 %-Agarosegele aus „low melting point“-Agarose verwendet.
Nach dem Aufkochen der Agarose in 0,5x Tris-Borat-Ethylendiaminessigsäure (TBE)-Puffer wurde die Lösung auf ca. 50 °C abgekühlt, mit 100 ng/ml Ethidiumbromid vermischt und in den Laufschlitten der Gelkammer gegossen. Dieser wurde nach dem Erkalten des Gels in die mit 0,5x TBE-Laufpuffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Die Geltaschen wurden nun mit der DNA-Lösung beladen, die mit 1/10 Volumenanteil 10x DNA-Auftragspuffer gemischt worden war.
Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte bei analytischen Gelen 40 min mit 150 V bei 18 °C. Genomische DNA wurde bei 70 V und 18 °C über 4 h aufgetrennt.
Bei präparativen Gelen erfolgte die Elektrophorese über Nacht bei 4 °C und 25 V.
Nach der Trennung konnten die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar gemacht und mittels eines Dokumentationssystems fotografiert werden. Die Größen und Mengen der aufgetrennten DNA-Fragmente konnten anhand eines mitgelaufenen Größenstandards abgeschätzt werden (siehe Tabelle 7). Von dieser mit HindIII geschnittenen λ-Phagen-DNA wurden bei jeder elektrophoretischen Auftrennung 300 ng in DNA-Auftragspuffer aufgetragen.
Tabelle 7: DNA-Größenstandard λ-DNA∆HindIII.
DNA-Größe (bp) DNA-Menge in 500 ng Standard (ng) 23130 239,0
9416 97,5 6557 67,5 4361 45,5 2332 24,0 2027 20,5 564 6,0 125 1,5
3.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli
Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurden zwei unterschiedliche Protokolle verwendet. Die Plasmid-DNA-Präparation nach ZHOU (1990) ist kostengünstig und wurde für das Screening von Klonen nach einer Transformation durchgeführt. Die Verwendung des Qiagen Plasmid Mini Kits erfolgte, wenn die Plasmid-DNA für nachfolgende enzymatische Reaktionen besonders rein sein sollte.
Zunächst wurden von 1,5 ml einer 3-ml-Über-Nacht-Kultur in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und anschließend 30 s bei 10000 x g zentrifugiert. Bis auf 50-100 µl wurde der Überstand dekantiert und der Zellniederschlag durch Schütteln in dem verbleibenden Volumen resuspendiert.
Plasmid-DNA-Minipräparation nach ZHOU (1990)
Für diese Plasmidpräparation wurden 300 µl Tris-EDTA-NaOH-SDS-Puffer (TENS) zugegeben, die Suspension 4 s mit dem Vortex auf mittlerer Stufe gemischt und das Lysat bei Verarbeitung mehrerer Ansätze bis zum nächsten Schritt auf Eis gehalten.
Nach Zugabe von 150 µl 3 M Natriumazetat-Lösung, pH 5,2, und erneutem Vermischen für 3 s wurden die Ansätze auf Eis gekühlt. Anschließend wurde das Lysat 10 min bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und unter den selben Bedingungen 5 min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand wiederum in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Plasmid-DNA durch Zugabe von 900 µl eiskaltem 100%igem
Ethanol gefällt. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 10000 x g wurde der Überstand abgesogen und der Niederschlag mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Die Plasmid-DNA wurde 5 min im Vakuum in der Vakuumzentrifuge bei 45 °C getrocknet und in 40 µl ddH2O aufgenommen.
Plasmid-DNA-Minipräparation mit dem Qiagen Plasmid Mini Kit
Für die Präparation geringer Mengen Plasmid-DNA (20 µg) mit dem Qiagen Plasmid Mini Kit wurden die kitspezifischen Puffer verwendet. Die Bakteriensuspension wurde mit 250 µl kalten Puffer P1 gut vermischt. Anschließend wurden 250 µl Puffer P2 zugegeben und durch Invertieren des Reaktionsgefäßes gemischt. Nach der Zugabe von 350 µl des Neutralisationspuffers N3 und vorsichtigem Invertieren sollte ein weißer Niederschlag auftreten. Der plasmidhaltige Überstand wurde vollständig auf die Qiagen-Säule gegeben. Zur Bindung der Plasmid-DNA wurde diese 1 min bei 10000 x g und 18 °C zentrifugiert. Danach wurde die Säule mit 750 µl Puffer PE gewaschen und wie im vorangegangenen Schritt zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen. Um den Waschpuffer vollständig aus der Säule zu entfernen, wurde sie ein weiteres Mal unter den gleichen Bedingungen 1 min zentrifugiert. Für die Elution wurde die Säule in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß gesteckt. Es wurden 50 µl ddH2O auf die Mitte der Membran gegeben, 1 min stehen gelassen und danach 1 min zentrifugiert.
Plasmid-DNA-Midipräparation mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen Tip-100) Zur Isolation größerer Mengen Plasmid-DNA (100 µg) wurden Anionenaus-tauschersäulen, Qiagen Tip-100, und die kitspezifischen Puffer verwendet. Eine 50 ml-Über-Nacht-Kultur wurde in 50-ml-Röhrchen überführt und 15 min bei 4000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der Zellniederschlag wurde in 4 ml kaltem Puffer P1 resuspendiert. Nach der Zugabe von 4 ml Puffer P2 wurde die Suspension vorsichtig mehrmals invertiert und 5 min bei 18 °C inkubiert.
Anschließend wurden 4 ml kalter Neutralisationspuffer P3 zugegeben. Das 50-ml-Röhrchen wurde wieder mehrmals vorsichtig invertiert und danach für 15 min auf Eis gekühlt. Nun wurde das Lysat in zwei Zentrifugenröhrchen überführt und für 30 min bei 4 °C und 14000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in zwei neue Röhrchen dekantiert und erneut 10 min unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert.
Währendessen wurde eine Qiagen Tip-100-Säule mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert.
Der partikelfreie Überstand der zweiten Zentrifugation wurde auf die Säule gegeben und diese mit 10 ml Puffer QC gewaschen. Hierauf folgte die Elution der Plasmid-DNA mit 5 ml Puffer QF in ein neues 50-ml-Röhrchen. Das Eluat wurde auf sechs 1,5-ml-Reaktionsgefäße mit je 833 µl verteilt, in die zuvor 583 µl Isopropanol (0,7 Volumenanteile) zur Fällung der DNA gegeben worden waren. Nach gutem Durchmischen wurde für 30 min bei 10000 x g und 4 °C zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes erfolgte ein Waschschritt mit eiskaltem 70%igem Ethanol. Im Anschluss wurde die Plasmid–DNA bei 18 °C für 10 min an der Luft getrocknet und dann in 120 µl ddH2O aufgenommen.
3.12.3 Isolierung genomischer DNA aus promastigoten Stadien von L. mexicana Aus einer 10-ml-Kultur promastigoter Stadien (Zelldichte 107-108 Zellen/ml) wurden 2 ml in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt und für 30 s bei 18 °C und 1500 x g zentrifugiert. Der Zellniederschlag wurde in 450 µl frischem Tris-EDTA-Lithiumchlorid-Triton (TELT)-Puffer resuspendiert, 5 min bei 18 °C inkubiert und mit 400 µl kaltem (4 °C) Tris-EDTA (TE)-äquilibriertem Phenol versetzt. Der Ansatz wurde 5 min bei 4 °C durch End-über-End-Rotation vermischt und die Phasen durch Zentrifugieren für 10 min bei 4 °C und 10000 x g getrennt. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 400 µl Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24:1) zugegeben. Der Ansatz wurde wie zuvor invertiert, zentrifugiert und die obere Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur DNA-Fällung wurde zu der Lösung 1 ml eiskaltes 100%iges Ethanol (2,5 Volumenanteile) zugegeben, wiederum für 5 min bei 4 °C invertiert und für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Niederschlag wurde einmal mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen bei 18 °C in 250 µl T10E0,1-Puffer aufgenommen.
3.12.4 Phenol-Chloroform-Extraktion
Die Phenol-Chloroform-Extraktion ermöglicht die Entfernung kontaminierender Proteinbestandteile aus wässrigen DNA-Lösungen. Dies wurde notwendig, wenn nach einer präparativen Restriktionsspaltung eine Hitzeinaktivierung der Enzyme nicht möglich war oder wenn die DNA mit weiteren DNA-modifizierenden Enzymen behandelt werden sollte. Es wurden 100 µl DNA-Lösung mit 100 µl TE-äquilibriertem
Phenol versetzt, 5 min bei 4 °C durch Invertieren gemischt und die Phasen durch Zentrifugieren für 10 min bei 4 °C und 10000 x g getrennt. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt, der gleiche Volumenanteil Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zur Phenolentfernung hinzugegeben und erneut wie zuvor gemischt und zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde wiederum separiert, mit 2,5 Volumenanteilen 100%igem eiskaltem Ethanol versetzt und die DNA für 30 min auf Trockeneis gefällt. Durch Zentrifugation unter den obigen Bedingungen wurde die DNA sedimentiert, einmal mit 70%igem eiskaltem Ethanol gewaschen und für 10 min bei 18 °C an der Luft getrocknet.
3.12.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die Fragmente wurden unter schwachem ultraviolettem (UV)-Licht (365 nm) visualisiert und die gewünschten mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten zur Elektroporation von Leishmanien erfolgte unter Verwendung der Elutip-d-Säule (Schleicher & Schuell, Dassel). Für die Aufreinigung von DNA-Fragmenten für anschließende Klonierungen wurde das QIAquick Gel Extraction Kit verwendet.
Elutip-d
Das aus dem „low melting point“-Agarosegel ausgeschnittene Stück wurde gewogen und im 10fachen Volumen des Niedrigsalzpuffers bei 65 °C im Wasserbad für 30 min bis zum vollständigen Schmelzen inkubiert. Währenddessen wurden 2 ml Hochsalzpuffer und anschließend 5 ml 65 °C warmer Niedrigsalzpuffer mittels Druck über eine Spritze durch eine Elutip-d-Säule gegeben. Die warme DNA-Lösung wurde gleich im Anschluss langsam mit 2 Tropfen/s mit einer Spritze durch die Säule gedrückt. Diese wurde mit 3 ml warmem Niedrigsalzpuffer gewaschen und die DNA mit zwei Mal 400 µl Hochsalzpuffer in zwei 1,5-ml-Reaktionsgefäße eluiert. Zur DNA-Fällung wurde je 1 ml eiskaltes 100%iges Ethanol zugegeben, für 30 min auf Trockeneis inkubiert und anschließend für 15 min bei 10000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die DNA wurde einmal mit eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, bei 18 °C für 10 min getrocknet und in insgesamt 20 µl sterilem ddH2O aufgenommen.
QIAquick Gel Extraction Kit
Das aus dem „electrophoresis grade“-Agarosegel ausgeschnittene Stück wurde gewogen und im 3fachen Volumen des Puffers QG für 10 min unter mehrmaligem Mischen bei 50 °C im Heizblock geschmolzen. Danach wurde ein Gelvolumen Isopropanol hinzugegeben, gemischt und die DNA-Lösung auf die QIAquick-Säule gegeben. Die Säule wurde in das zugehörige Sammelgefäß gestellt und für 1 min bei 10000 x g und 18 °C zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es wurden 750 µl Puffer PE auf die Säule gegeben, für 2-5 min inkubiert und im Anschluss unter den selben Bedingungen zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wiederum verworfen. Zur vollständigen Entfernung des Puffers wurde erneut für 1 min zentrifugiert. Zur Elution der DNA wurde die Säule in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß gestellt, 50 µl ddH2O auf die Säule gegeben und erneut wie oben zentrifugiert.
3.12.6 Reaktionen mit DNA-modifizierenden Enzymen Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Es wurden Restriktionsendonukleasen vom Typ II verwendet, die spezifisch palindromische Basensequenzen doppelsträngiger DNA erkennen und schneiden.
Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA
Zur Restriktionsanalyse von Plasmiden wurde in einem Gesamtvolumen von 15 µl gearbeitet. 0,2-1,0 µg Plasmid-DNA wurden in dem entsprechenden Puffer mit 5–
10 U6 des Enzyms eingesetzt. Das Volumen der hinzugegebenen Enzymlösung durfte nicht 10 % des Gesamtvolumens überschreiten, um eine Hemmung der Enzymaktivität auf Grund einer zu hohen Glyzerinkonzentration zu vermeiden. Je nach Enzym wurden dem Ansatz noch 2 µg BSA sowie 10 µg RNase A hinzugefügt.
Der Ansatz wurde 3 h bei dem entsprechenden Temperaturoptimum des Enzyms, in der Regel bei 37 °C, inkubiert. Für präparative Restriktionsspaltungen wurden Ansätze in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit 20 µg Plasmid-DNA verwendet. Die Menge an eingesetzter Endonuklease und die Volumina der übrigen Komponenten wurden entsprechend angepasst.
6 1 U (Unit) ist definiert als die Enzymmenge, die 1 µg λ-Phagen-DNA in 1 h vollständig schneidet.
Restriktionsspaltung genomischer DNA
Die Restriktionsspaltung genomischer L.-mexicana-DNA erfolgte in einem Gesamtvolumen von 400 µl. Dabei wurden 3–5 µg genomischer DNA mit 50 U Restriktionsendonuklease, 50 µg RNase A und 10 µg BSA unter ständigem Invertieren über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die DNA mit 100%igem Ethanol gefällt. Es wurden 44 µl 3 M Natriumazetat-Lösung, pH 5,2, (1/9 Volumenanteil) und 1100 µl eiskaltes 100%iges Ethanol (2,5 Volumenanteile) hinzugefügt, gemischt und auf Trockeneis für 30 min inkubiert. Die DNA wurde anschließend durch 20-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 10000 x g präzipitiert, bei 18 °C für 10 min getrocknet und in 15 µl T10E0,1-Puffer aufgenommen.
Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten und linearisierten Plasmiden erfolgte mit Hilfe der T4-DNA-Ligase, die unter ATP-Verbrauch die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 3`-Hydroxyl- und 5`-Phosphatgruppen doppelsträngiger DNA-Moleküle katalysiert. Dabei können glatte und kohäsive Enden miteinander verknüpft werden.
Es wurden für die Ligation in einem 15-µl-Gesamtvolumen 10 µg linearisierte Plasmid-DNA mit glatten Enden und eine bis zu dreifache Menge Insert-DNA eingesetzt. Dem Ansatz wurden 1,5 µl 10x Ligase-Puffer und 1 µl T4-DNA-Ligase zugesetzt. Er wurde über Nacht bei 13 °C inkubiert.
3.12.7 In-vitro-Amplifizierung von DNA-Fragmenten durch PCR
Die PCR dient der In-vitro-Amplifizierung von DNA-Abschnitten, die durch die Auswahl geeigneter Oligonukleotide als Primer festgelegt werden. Dabei werden eine doppelsträngige DNA-Vorlage (Template), eine ausreichende Menge der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate und eine hitzestabile DNA-Polymerase sich wiederholenden Zyklen von Temperaturveränderungen ausgesetzt. Ein Reaktionszyklus besteht aus der Denaturierung der doppelsträngigen DNA zu Einzelsträngen, der Hybridisierung der Primer mit jeweils einem der Stränge, die als Matrize dienen, und der DNA-Synthese (Elongation). Die PCR wurde mit dem Expand High Fidelity PCR System durchgeführt. Dabei handelt es sich um ein Enzym-Gemisch aus einer N-terminalen Deletionsmutante der thermostabilen Taq-
und der Pwo-Polymerase. Letztere kann durch ihre
3`-5`-Exonuklease-„proofreading“-Aktivität die Fehlerquote bei der Verknüpfung der Nukleotide um ein Drittel senken. Mit High-Performance-Liquid-Chromatography gereinigtes Wasser (HPLC-H2O) wurde das Reaktionsvolumen auf 20 µl aufgefüllt.
PCR-Protokoll
1. Denaturierung 94 °C 300 s 2. Denaturierung 94 °C 60 s
3. Hybridisierung 48 °C 30 s 25 Mal
4. Elongation 72 °C 120 s 5. Elongation 72 °C 600 s
Im Anschluss wurde das PCR-Produkt einer Phenol-Chloroform-Extraktion (siehe 3.12.4) unterzogen.
3.12.8 DNA-Sequenzierung
Für die Sequenzierung von Plasmid-DNA nach der Kettenabbruchsmethode (SANGER et al. 1977) wurde das BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet. Hierbei handelt es sich um die basenspezifische Termination der von der Taq-Polymerase katalysierten DNA-Synthese an einem Matrizen-Strang.
Neben den vier Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) liegen im Reaktionsgemisch 2`-, 3`-Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP) in geringen Mengen vor. Durch den zufälligen Einbau der vier unterschiedlich markierten ddNTPs zu verschiedenen Zeitpunkten in die neu synthetisierte DNA kommt es zum Abbruch der Synthese. Am Ende erhält man DNA-Fragmente, die alle das gleiche 5`-Ende aufweisen, jedoch unterschiedlich lang sind. Auf Grund der Länge und der unterschiedlichen Markierung der Fragmente können diese in der Sequenzier-Apparatur detektiert werden. Diese Detektion wurde zentral im BNI durchgeführt.
Ein Reaktionsansatz für die Sequenzierung in einem 200 µl-PCR-Reaktionsgefäß enthielt 1 µg Template-DNA, 10 pmol Primer und 4 µl Ready Reaktion Mix. Mit HPLC-H2O wurde das Reaktionsvolumen auf 20 µl aufgefüllt.
PCR-Protokoll
1. Denaturierung 96 °C 10 s
2. Hybridisierung 50 °C 5 s 25 Mal
3. Elongation 60 °C 600 s
Im Anschluss wurde der Ansatz in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden für die DNA-Fällung 80 µl HPLC-H2O, 10 µl 3 M Natriumazetatlösung (pH 4,6) und 250 µl 100%iges Ethanol (18 °C ) hinzugegeben. Der Ansatz wurde gut gemischt und 15 min mit 10000 x g bei 18 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Die sedimentierte DNA wurde einmal mit 70%igem Ethanol (18 °C) gewaschen und anschließend 10 min im Heizblock bei 37 °C getrocknet. Bis zur weiteren Bearbeitung wurde die DNA bei -20 °C gelagert.
3.12.9 DNA-Markierung mit DIG-Desoxyuridintriphosphat (dUTP)
Zur Markierung eines DNA-Fragments durch den Einbau von Digoxigenin-markiertem dUTP für den Einsatz als Sonde in Southern-Blot-Hybridisierungen wurde das PCR DIG Probe Synthesis Kit verwendet. Zu 0,5 µl DNA-Lösung wurden 5 µl 10x PCR-Puffer (mit 15 mM MgCl2), 5 µl PCR DIG Labeling Mix, je 10 µM Primer und 0,75 µl (3,5 U/µl) Expand High Fidelity PCR System-Enzymmix zugegeben. Mit ddH2O wurde auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. Für die Herstellung einer Sonde zur Detektion des Hygromycinresistenzgens (HYG) wurde HYG durch BamHI und NcoI aus dem Plasmid pX63HYG geschnitten und mit den Primern px63-HYG05 und px63-HYG06 zur DIG-Markierung amplifiziert. Hierzu wurde folgendes Protokoll verwendet:
PCR-Protokoll zur Inkorporation von DIG-markiertem dUTP 1. Denaturierung 94 °C 300 s
2. Denaturierung 94 °C 60 s
3. Hybridisierung 50 °C 60 s 30 Mal 4. Elongation 72 °C 120 s
5. Elongation 72 °C 600 s
Die markierte DNA wurde für 10 min bei 95 °C denaturiert und anschließend für 5 min auf Eis inkubiert. Die DIG-markierten DNA-Einzelstränge wurden nachfolgend als Sonde in der Hybridisierungslösung beim Southern Blotting verwendet.
3.12.10 Southern Blotting
Restriktionsspaltung der genomischen DNA und Agarosegelelektrophorese
Die genomische DNA von L. mexicana wurde wie unter 3.12.6 beschrieben gespalten, gefällt und in 15 µl T10E0,1-Puffer aufgenommen. Nach Zugabe von 1,5 µl DNA-Auftragspuffer erfolgte die Auftrennung der Fragmente in einem 0,7%igen-Agarosegel mit 70 V bei 18 °C bis die Bromphenolblau-Bande etwa zwei Drittel des Gels durchlaufen hatte. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit einem seitlich angelegten Lineal zur Kontrolle der Laufstrecke unter UV-Licht fotografiert und 2-3 min der Strahlung ausgesetzt.
Southern Blotting
Zur DNA-Fragmentierung über Depurinierung wurde das Gel bei 18 °C für 20 min in 0,25 N HCl und anschließend zur Denaturierung für 30 min in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl leicht geschwenkt. Die einzelsträngigen DNA-Fragmente wurden aus dem Gel über Nacht bei 4 °C mit 20x Natriumchlorid-Natriumcitrat (SSC)-Transferpuffer durch Kapillarwirkung auf eine Biodyne-A-Transfer-Membran (PAA Laboratories, Linz) übertragen. Die genaue Blotting-Apparatur zeigt die Abb. 8. Die über der Membran liegenden Schichten dürfen nicht mit dem Gel in Berührung kommen, um ein Aufsaugen der DNA an der Membran vorbei zu vermeiden.
Gewicht
Glas-Petrieschale Wanne mit 20 x SSC Parafilm
Glas-Petrieschale Wanne mit 20 x SSC Parafilm
Abb. 8: Aufbau der Southern-Blotting-Apparatur
Nach ca. 12 h wurde die Blotting-Apparatur abgebaut, die Positionen der Geltaschen auf der Membran markiert und die DNA durch Quervernetzung an der Membran mittels UV-Licht im UV-Stratalinker mit der Autocrosslinking-Funktion fixiert.
Blockierung
Die Membran wurde mit 50 ml Prähybridisierungslösung in Plastikfolie eingeschweißt und für 3 h bei 42 °C im Wasserbad leicht geschüttelt. Die in der Prähybridisierungslösung enthaltene Fischspermien-DNA diente zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen.
Hybridisierung mit einer DIG-markierten DNA-Sonde
Zur Denaturierung der DIG-markierten DNA-Sonde, die in 30 ml Hybridisierungslösung eingefroren war, wurde diese 10 min in einem Wasserbad gekocht und danach sofort für 5 min auf Eis gestellt. Die Prähybridisierungslösung wurde durch eine die DIG-markierte DNA-Sonde enthaltende Hybridisierungslösung ersetzt. Darin wurde die Membran über Nacht bei 42 °C im Wasserbad geschwenkt.
Nach Gebrauch konnte die Hybridisierungslösung zur mehrmaligen Verwendung wieder bei –20 °C eingefroren werden. Am nächsten Tag wurde die Membran vorsichtig aus der Folie genommen, zwei Mal 5 min bei 18 °C in je 200 ml 2x SSC/0,1 % SDS und anschließend zwei Mal 10 min bei 68 °C in 0,1x SSC/0,1 % SDS unter leichtem Schütteln gewaschen. Mit diesen Waschschritten wurden
unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Sonde und der membrangebundenen DNA gelöst.
Detektion der DIG-Markierung
Die DIG-markierte Sonde wurde durch einen AP-gekoppelten Antikörper mit anschließender Lumineszenzdetektion über CSPD nachgewiesen. Die AP katalysiert die Dephosphorylierung von CSPD und führt zur Bildung eines metastabilen Intermediates, welches unter Lichtemission von einer maximalen Wellenlänge von 477 nm zerfällt und so zur Schwärzung eines Röntgenfilmes führt.
Die Membran wurde bei 18 °C für 5 min in DIG-Waschpuffer geschwenkt und dann mit 50 ml DIG-Puffer II in Folie eingeschweißt und 2 h bei 37 °C im Wasserbad leicht geschüttelt. Der DIG-Puffer II wurde gegen 50 ml DIG-Puffer II mit einem an AP-gekoppelten α−DIG-Antikörper (1:10000) ausgetauscht und der Blot wurde darin erneut bei 37 °C für 45 min geschwenkt. Anschließend wurde die Membran zwei Mal 10 min bei 18 °C in je 200 ml Waschpuffer gewaschen und für 5 min in DIG-Puffer III äquilibriert. Dann wurde jede Seite der Membran für jeweils 2,5 min in die Substratlösung, CSPD 1:100 in DIG-Puffer III, gelegt, kurz auf Whatman-Papier (3 mm, Schleicher & Schuell, Dassel) abgetropft. Danach wurde der Blot in Frischhaltefolie eingepackt, um ein Austrocknen zu vermeiden, und in einer Filmkassette 10 min bei 37 °C vorinkubiert. Anschießend wurde ein Röntgenfilm für ca. 15-60 min aufgelegt und bei 37 °C inkubiert.
Stripping der gebundenen Sonde
Die Membran wurde für 10 min bei 18 °C in H2O geschwenkt und anschließend zwei Mal für 15 min in je 200 ml 0,2 M NaOH/1 % SDS bei 37 °C leicht geschüttelt. Dann wurde zwei Mal 5 min mit 20x SSC-Puffer bei 37 °C gewaschen und die Membran bis zur nächsten Verwendung in DIG-Puffer I bei 4 °C gelagert oder sofort erneut blockiert und mit einer weiteren Sonde hybridisiert.
3.12.11 Herstellung und Transformation kompetenter E. coli
Die Herstellung und Transformation kompetenter E. coli erfolgte mit der Methode nach HANAHAN (1983). Aus einer Glyzerinkultur wurden Bakterien des E.
coli-Stammes XL1-Blue auf LB-Agarplatten mit 40 µg/ml Tetrazyklin ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Mit einer Einzelkolonie wurden 3 ml SOB-Medium (40 µg/ml Tetrazyklin) angeimpft und diese über Nacht im Schüttler mit 225 Upm bei 37 °C inkubiert. Es wurden 100 µl dieser Über-Nacht-Kultur in 100 ml SOB-Medium überführt und bis zu einer Optischen Dichte bei 550 nm (OD550nm) von etwa 0,2 bei 225 Upm und 37 °C geschüttelt. Es folgte eine Inkubation auf Eis für 15 min.
Anschießend wurde die Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen für 15 min bei 4 °C und 2100 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 16 ml RF1-Puffer durch leichtes Schütteln resuspendiert und 90 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren unter obigen Bedingungen wurde der Zellniederschlag in 8 ml RF2-Puffer resuspendiert, weitere 15 min auf Eis gekühlt und in einem Volumen von je 200 µl in gekühlte 1,5-ml-Reaktionsgefäße portioniert. Die kompetenten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -70 °C gelagert.
Anschießend wurde die Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen für 15 min bei 4 °C und 2100 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 16 ml RF1-Puffer durch leichtes Schütteln resuspendiert und 90 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren unter obigen Bedingungen wurde der Zellniederschlag in 8 ml RF2-Puffer resuspendiert, weitere 15 min auf Eis gekühlt und in einem Volumen von je 200 µl in gekühlte 1,5-ml-Reaktionsgefäße portioniert. Die kompetenten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -70 °C gelagert.