Das Genom umfasst je nach Leishmania-Art ungefähr 3,5-5 x 107 bp pro haploidem Genom, organisiert in 34-36 Chromosomen (GESSNER et al. 1994, S. 29) mit ca.
10000 Genen (CLAYTON 2002). Da die Leishmanien-Chromosomen während der mitotischen Zellteilung nicht kondensieren, konnten sie bisher ausschließlich in der Pulsfeldgelelektrophorese sichtbar gemacht werden. So konnten für L. infantum 36 Chromosomen mit einer Größe zwischen 0,35-3,0 x 106 bp und eine Größe des gesamten Genoms von 3,55 x 107 bp identifizert werden (WINCKER et al. 1996). Die Analyse des L.-mexicana-Komplexes ergab die Anzahl von 34 Chromosomen im Genom (BRITTO et al. 1998). Allerdings unterliegt das Leishmania-Genom einer ständigen Variabilität seiner Chromosomenanzahl und -größe (BASTIEN et al. 1992).
Obwohl homologe Chromosomen sich in der Größe beträchtlich unterscheiden können, basiert dies meistens auf der Anzahl tandemartig angeordneter, repetitiver Gene oder auf repetitiven nicht kodierenden Sequenzen (CLAYTON 2002). Unter Antibiotikaselektionsdruck, bei nutritivem Stress oder auch spontan kann es jedoch zur Entstehung von so genannten Multicopy-Minichromosomen als Resultat einer Amplifikation genomischer Sequenzen kommen (BEVERLEY 1991, SEGOVIA 1994).
Diese extrachromosomale DNA kann ca. 5-10 % der gesamten zellulären DNA umfassen. Es werden zirkuläre und lineare Minichromosomen unterschieden. Ihr molekularer Entstehungsmechanismus ist bis heute nicht geklärt. Da amplifizierte Genloki häufig flankierende repetitive direkte oder invertierte Sequenzen aufweisen, kann daraus geschlossen werden, dass die Amplifikation möglicherweise durch
homologe intramolekulare Rekombination erzielt wird. Unter experimentellen Bedingungen kann durch Antibiotikaselektionsdruck die Entstehung linearer Minichromosomen provoziert werden. Wird die Antibiotikakonzentration erhöht, kommt es zur Bildung zirkulärer Minichromosomen. Daher wird angenommen, dass die linearen Minichromosomen die Vorstufen extrachromosomaler DNA-Circles sind (OLMO et al. 1995 und GRONDIN et al. 1998).
Es gibt Hinweise darauf, dass Leishmanien zwei Chromosomensätze, also ein diploides Genom, besitzen. Man konnte jedoch im Gegensatz zum gut dokumentierten sexuellen Genaustausch von T. brucei bis heute nicht klären, ob Mechanismen hierzu auch bei den Leishmanien existieren. Genetische Rekombination (TAYLOR et al. 1994) und die Tatsache, dass für die Herstellung einer Null-Mutante (Gen-Knock-out) einiger Gene in Leishmanien zwei Transfektionsschritte zur Inaktivierung beider Allele notwendig sind (CRUZ et al.
1991, DESCOTEAUX et al. 1995, WIESE et al. 1995), stützen die Hypothese, dass es sich um ein diploides Genom handelt.
Außer der chromosomalen DNA des Nukleus besitzen die Kinetoplastiden die dicht gepackte Kinetoplasten-DNA (kDNA). Dabei handelt es sich um die DNA des einzigen Mitochondriums der Zelle. Ihr Anteil an der Gesamt-DNA beträgt 10-15 %.
Sie besteht aus so genannten Mini- und Maxi-Circles, welche im Gegensatz zur chromosomalen DNA weder Histone besitzen noch eine Supercoiling-Struktur aufweisen. Jede Zelle besitzt ca. 25-50 Maxi-Circles mit einer Größe von 20-40 kb.
Diese kodieren für mitochondriale Gene sowie für die Guide-RNA (s. u.). Den 5000-10000 Mini-Circles mit einer Größe von 0,5-2,8 kb konnte neben der Kodierung für die Guide-RNA bisher keine weitere Funktion zugeordnet werden.
Die Organisation und Expression der Gene von Leishmania sind sehr heterogen im Vergleich zu höheren Eukaryoten. Gene können einzeln, gepaart oder in Gruppen, so genannten Genklustern, angeordnet sein. Sie können sich auch vielfach tandemartig wiederholen. Das Genom ist mit einem Anteil von 58-60 % sehr Guanosin/Cytosin (G/C)-reich im Gegensatz zu T. brucei mit einem G/C-Gehalt von 51 %, wobei die kodierenden Regionen einen höheren G/C-Gehalt haben als die nicht kodierenden (ALONSO et al. 1992). Das Genom enthält kurze, repetitive
DNA-Sequenzmotive, wie sie bei den meisten Eukaryoten üblich sind. Diese sind tandemartig angeordnet und überall in den nicht proteinkodierenden Sequenzen verstreut oder charakterisieren die Chromosomenenden in telomerassoziierten Sequenzen. Es wurde eine hoch repetitive Komponente, die 12 % des L.-donovani-Genoms einnimmt, identifiziert (LEON et al. 1978). Zusätzlich zu intergenen repetitiven Sequenzen besitzen Protozoen viele Proteine mit repetitiven Aminosäure-Domänen, welche starke Antikörper-Antworten auslösen können. Ein Unterbrechen der proteinkodierenden Sequenzen durch Introns und der Mechanismus des Cis-Spleißens wurde bis jetzt nicht in Leishmania-Genen beobachtet. Allerdings konnten Introns im Gen der Poly-A-Polymerase von T. brucei und Trypanosoma cruzi nachgeweisen werden (MAIR et al. 2000).
Auch bei der Regulation der Genexpression bestehen erhebliche Unterschiede zu höheren Eukaryoten. Die Regulation scheint posttranskriptional auf der Ebene der RNA-Prozessierung oder der Ebene der Translation und der Proteinstabilität zu liegen (PARSONS und RUBEN 2000). Bei der Transkription der proteinkodierenden Gene wird polycistronische „messenger“-RNA (mRNA) synthetisiert, wobei die Gene verschieden stark exprimiert werden können. Eine Regulation der Expression auf der Ebene der Transkription spielt anscheinend bei den Leishmanien eine untergeordnete Rolle. Es konnten bisher nur wenige potenzielle Transkriptionsfaktoren und wenige von Eukaryonten bekannte Promotoren identifiziert werden (CLAYTON 2002). So wurden Promotoren der RNA-Polymerasen I und III bei T. brucei identifiziert (LAUFER und GÜNZL 2001, NAKAAR et al. 1997).
Für die RNA-Polymerase II konnte bisher noch keine entsprechende Promotorregion in den Kinetoplastiden nachgewiesen werden.
Posttranskriptionale Mechanismen wie das Trans-Spleißen und die Polyadenylierung der Primärtranskripte zur reifen mRNA regulieren im Wesentlichen die Genexpression bei den Leishmanien. Eine wichtige Rolle spielen außerdem die Stabilität und der Abbau der prä-mRNA und mRNA. Beim Trans-Spleißen werden zwei unabhängig voneinander transkribierte RNA-Stränge miteinander verknüpft (Abb. 6). Die prä-mRNA-Moleküle werden an ihrem 5`-Ende mit einer 39 bp langen Miniexonsequenz versehen (NILSEN 1995). Diese besitzt an ihrem 5`-Ende eine cap-Struktur in Form eines 7-Methylguanosin-Restes, sowie weitere methylierte
Nukleotide an Position 1-4 und 6 (STURM et al. 1999). Diese Miniexonsequenz, auch Spliced-Leader-RNA (SL-RNA) genannt, stammt von dem 5`-Ende einer 140 bp umfassenden „mini exon derived“-RNA (med-RNA). Die SL-RNA wird an einem separaten Genlokus kodiert, wo sie in ca. 150 Kopien tandemartig angeordnet ist und sequenzabhängig in drei Klassen eingeteilt wird (MILLER et al. 1986). Ihre Sequenzen sind in allen Leishmania-Arten hoch konserviert. Gleichzeitig ist an den Vorgang des Trans-Spleißens die Polyadenylierung des 3`-Terminus der prä-mRNA gekoppelt, wodurch eine monocistronische mRNA entsteht.
3‘ med-RNA
Abb. 6: RNA-Prozessierung durch das Trans-Spleißen und die Polyadenylierung bei Leishmanien
Die Guide-RNA hat beim RNA-Editing der Transkripte der mitochondrialen DNA eine entscheidende Funktion (BENNE 1994). Durch Deletion oder Insertion von Uridinbasen an definierten Stellen im Transkript wird die ursprüngliche Sequenz posttranskriptional modifiziert, sodass erst hierdurch das funktionelle offene Leseraster zur Translation entsteht. Die Guide-RNA dient dabei als Vorlage für das in 3`-5`-Richtung ablaufende Editing. Sie besteht aus einer zur prä-mRNA komplementären 4-18 bp langen Ankersequenz, einem die neue Sequenzinformation enthaltenden Bereich aus mindestens 40 bp und einer abschließenden 5-24 bp langen Oligouridin-Region.
Zur funktionellen Untersuchung von bestimmten Genen in Kinetoplastiden stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung (CLAYTON 1999). So ist es seit einiger Zeit möglich, eine stabile Transfektion durchzuführen, wobei das zu untersuchende Gen gezielt in zwei Transfektionsschritten durch homologe Rekombination mit zwei verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen deletiert werden kann. Für eine erfolgreiche homologe Rekombination muss ein lineares Konstrukt aus der stromaufwärts
(5’)-„untranslated region“ (UTR), dem Resistenzgen und der stromabwärts (3’)-UTR erstellt werden, wobei die UTRs die flankierenden Regionen des zu deletierenden Gens sind. Dieses Konstrukt wird dann durch Elektroporation in die promastigoten Stadien eingeschleust. So gelang die erste komplette Deletion des Gens der Dihydrofolatreduktase-Thymidylat-Synthase (DHFR-TS) in L. major (CRUZ et al.
1991). Durch die Deletion von MAPKs und der damit verbundenen Unterbrechung ihrer Signalkaskade kann Aufschluss über ihre Funktion gewonnen und untersucht werden, ob sie eine potenzielle Zielstruktur für Therapieansätze darstellen (WIESE 1998). Mit dieser Methode wurde auch LmxMPK5 in L. mexicana auf beiden Allelen durch die homologe Rekombination mit dem Gen der Hygromycin-Phosphotransferase (HYG) und mit dem der Neomycin-Hygromycin-Phosphotransferase (NEO) deletiert (Abb. 7).
MPK5Allel 2 MPK5Allel 1
NEO Wildtyp (+/+)
NEO
HYG MPK5Allel 2 Einzelallel-Deletion (+/-)
NEO HYG Doppelallel-Deletion (-/-)
MPK5Allel 2 MPK5Allel 1
NEO Wildtyp (+/+)
NEO
HYG MPK5Allel 2 Einzelallel-Deletion (+/-)
NEO HYG Doppelallel-Deletion (-/-)
Abb. 7: Deletion von LmxMPK5. Durch homologe Rekombination mit dem Gen der Hygromycin-Phosphotransferase (HYG) oder mit dem der Neomycin-Phosphotransferase (NEO) wurde LmxMPK5 deletiert.
3 Material und Methoden
Die Herstellerangaben und Bezugsquellen der verwendeten Geräte, Chemikalien und Reagenzien sowie die Zusammensetzungen der eingesetzten Lösungen und Puffer befinden sich im Anhang unter 9.2 bzw. 9.3.
3.1 Verbrauchsmaterial
Verbrauchsmaterial wie sterile Plastikmaterialien wurden von den Firmen Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, und Eppendorf AG, Hamburg, bezogen. Für die Zellkultur wurden Zellkulturflaschen der Firma Nunc, Wiesbaden, verwendet.
Hersteller von speziellen Materialien, die in den verschiedenen Methoden verwendet wurden, werden bei ihrer ersten Erwähnung in den einzelnen Abschnitten genannt.
3.2 Enzyme
Alle verwendeten Restriktionsendonukleasen stammten von New England Biolabs GmbH, Frankfurt. Sie wurden mit den vom Hersteller mitgelieferten Puffern eingesetzt. Ligationen wurden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics, Mannheim) im entsprechenden Puffer durchgeführt. Für die PCR wurde das Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics, Mannheim) mit dem dazugehörigen 10x PCR-Puffer mit MgCl2 verwendet.