3.14.1 Immunfluoreszenszmikroskopie mit promastigoten Stadium
Ein Objektträger mit zehn Vertiefungen (Carl Roth GmbH, Karsruhe) wurde mit 70%igem Ethanol entfettet. Auf jede Vertiefung wurden 40 µl Poly-L-Lysin (0,1 mg/ml) in PBS aufgetragen und für 15 min bei 18 °C inkubiert. Anschließend wurde jeweils zwei Mal mit 50 µl PBS gewaschen. Es wurden 500 µl aus einer Leishmanien-Kultur mit einer Dichte von ca. 1–2 x 107 Zellen/ml entnommen, für 30 s bei 18 °C und 1500 x g zentrifugiert, einmal mit PBS gewaschen, erneut in 500 µl PBS aufgenommen und auf Eis gehalten. Pro Vertiefung wurden 20 µl der Zellsuspension aufgetragen. Es wurden jeweils weitere 20 µl 3%iges Paraformaldehyd zur Fixierung hinzugegeben und für 15 min inkubiert. Danach wurde jede Vertiefung wiederum zwei Mal mit PBS gewaschen. Mit je 50 µl Permeabilisierungs-Lösung über 15 min wurden die Zellwände durchlässig gemacht.
Die Lösung wurde abgesogen und für 15 min durch 50 µl Blockierungslösung ersetzt.
Es wurde 15 min inkubiert. Mit 20 µl des Primärantikörpers in Blockierungslösung wurde 1 h bei 18 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurde jede Vertiefung vier Mal mit PBS/0,1 % Saponin gewaschen und 30 min mit je 20 µl des in Blockierungslösung und einer 1:500-Verdünnung der 6-Diamidino-2-phenylindoldilactat (DAPI)-Stammlösung verdünnten CY3-gekoppelten Sekundärantikörpers inkubiert. Dann wurde drei Mal mit PBS/0,1 % Saponin und zwei Mal nur mit PBS gewaschen. Der Objektträger wurde 5 min an der Luft im
Dunkeln getrocknet und mit Mowiol/DABCO eingedeckt. Nach einstündigem Trocknen bei 4 °C konnte das Präparat unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 573 nm oder 461 nm angeschaut werden.
3.14.2 Histologie
Die Proben wurden zunächst in 10%iger Formaldehydlösung fixiert und dann in Parafin gebettet. Es wurden Semidünn-Schnitte (2-4 µm) angefertigt und mit Hematoxilin-Eosin (HE) gefärbt.
3.14.3 Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Es wurden Leishmanien aus einer Kultur promastigoter Stadien mit einer Dichte von ca. 1 x 107 Zellen/ml entnommen, einmal mit PBS gewaschen und anschließend in 2%igem Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer aufgenommen und fixiert.
Mit 70%igem Ethanol gereinigte Glasplättchen (Cellolate 5254, Durchmesser 12 mm, Eppendorf, Hamburg) wurden mit 0,1%igem Poly-L-Lysin beschichtet und mit der zu untersuchenden Zellsuspension beschickt. Die Probe wurde in einer feuchten Kammer für 30-60 min inkubiert und danach mit 2%igem Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer bedeckt und nachfixiert. Zunächst wurde drei Mal mit Natrium-Cacodylat-Puffer, dann drei Mal mit 1%igem Osmium-Tetraoxid in 0,1 M Natrium-Cacodylat-Puffer gewaschen. Es folgte erneut für 30 min eine Inkubation in der feuchten Kammer. Anschließend wurde fünf Mal mit kaltem (4 °C) Natrium-Cacodylat-Puffer gewaschen und bei 4 °C in einer in 10 %-Schritten aufsteigenden Ethanol-Reihe (30-90%iges Ethanol) und zuletzt mit 96%igem Ethanol für je 10 min entwässert. Bei 18 °C wurde die Probe zwei Mal in 100%igem Ethanol für jeweils 15 min inkubiert. Danach erfolgte die Trocknung mit CO2 im Critical-Point-Dryer (CPD 7501VG, Microtech, Duisburg). Die getrocknete Probe wurde mit einem 8 nm dicken Gold-Paladium-Mantel versehen und konnte nun bei 20 kV im Rasterelektronenmikroskop betrachtet werden.
3.14.4 Immunelektronenmikroskopie
Es wurden 1 x 107 Leishmanien aus einer Kultur promastigoter Stadien mit PBS gewaschen und für eine Stunde in 2%igem Paraformaldehyd fixiert. Die Entwässerung für jeweils 10 min erfolgte in einer in 10 %-Schritten aufsteigenden Ethanol-Reihe (30-99,8%iges Ethanol). Es erfolgte anschließend eine jeweils einstündige Inkubation in den Verdünnungen Kona LR White/Ethanol 1:3, 1:2, 1:1, 2:1. Über Nacht in 1x Kona LR White unter Zugabe des Härters bei 4 °C auspolymerisiert. Auf dem Ultramikrotom (Leica, Braunschweig) wurden mit einem Diamantmesser Ultradünnschnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf Nickelgitter (Plano, Marburg) aufgebracht. Die Inkubation mit dem Primärantikörper in einer 1:50-Verdünnung mit 3 % BSA in PBS, pH 7,2, erfolgte über Nacht bei 4 °C. Es wurde am nächsten Tag drei Mal mit PBS/0,01 % Tween 20 gewaschen und dann für 1 h mit dem Sekundärantikörper, Protein A und 10 nm Gold bei 18 °C inkubiert. Danach wurde einmal mit PBS und drei Mal mit ddH2O gewaschen und anschließend bei 18 °C getrocknet. Nach der Kontrastierung in Uranylazetat und dreimaligem Waschen mit ddH2O wurden die Schnitte in einem Philips 201 Elektronenmikroskop (Philips, Hamburg) betrachtet.
3.15 Infektionsexperimente
In dieser Arbeit wurden Infektionsexperimente mit frisch aus BALB/c-Mäusen isolierten Peritonealmakrophagen und mit BALB/c-Mäusen durchgeführt.
3.15.1 Makrophageninfektion mit L. mexicana
Der durch Genickbruch getöteten Maus wurde die Haut über der Bauchdecke abpräpariert. Die Bauchdecke wurde mit 70%igem Ethanol abgespritzt und mit einer Pinzette angehoben, um 5 ml auf Eis vorgekühltes DMEM-Medium (komplett) per Spritze (Kanüle 0,6 x 30 mM, Braun AG, Melsungen) in die Bauchhöhle zu injizieren.
Anschließend wurde die Bauchdecke erneut mit 70%igem Ethanol abgespritzt. Der mit Medium gefüllte Bauch wurde 2-3 min massiert. Erneut wurde mit der Kanüle durch die Bauchdecke eingestochen, das Medium möglichst vollständig zurückgewonnen und in ein auf Eis gekühltes 50 ml-Reaktionsgefäß überführt. Das aus mehreren Mäusen zurückgewonnene Medium wurde vereinigt. Die Zellzahl der
Makrophagen wurde in der Neubauer-Zählkammer bestimmt und 3 x 105 Makrophagen in 300 µl Medium pro Kammer auf ein 8-Kammer-Objektträger (NUNC GmbH & Co KG, Wiesbaden) gegeben. Zur Anheftung der Makrophagen am Boden der Kammern wurde über Nacht bei 34 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Makrophagen mit promastigoten Stadien aus einer sich in der spätlogarithmischen Wachstumsphase befindlichen Kultur in einem Verhältnis von 1:2 (Makrophagen/Leishmanien) infiziert. Hierzu wurde die Dichte der Leishmanien-Kultur mittels Zählung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt und die entsprechende Menge Leishmanien bei 1500 x g und 18 °C 20 s zentrifugiert, einmal mit eiskaltem DMEM-Medium (komplett) gewaschen, in Medium resuspendiert und in die Kammern gegeben. Die 8-Kammer-Objektträger wurden dann über Nacht bei 27 °C und 5 % CO2 inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die 8-Kammer-Objektträger für 4 h bei 34 °C und 5 % CO2
bebrütet. Frisches DMEM-Medium wurde im Wasserbad auf 34 °C erwärmt. Hiermit wurden die Kammern jeweils zwei Mal mit 300 µl gewaschen und erneut mit 300 µl warmem Medium gefüllt, um die noch freien Leishmanien zu entfernen, die noch keine Makrophagen infiziert hatten. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 34 °C und 5 % CO2. Am 1., 3., 5. und 7. Tag p. i. wurde jeweils ein 8-Kammer-Objektträger pro Probe genommen. Hierzu wurde das Medium mit einer Pipette abgesogen und sofort durch 300 µl Fixierungslösung pro Kammer ersetzt und für weitere 15 min inkubiert. Danach wurden die Kammern zwei Mal mit PBS gewaschen. Die Färbung erfolgte für 20 min mit 300 µl Färbelösung (1:500-Verdünnung der DAPI-Stammlösung in PBS) je Kammer. Nach anschließendem Waschen mit PBS wurden die Kammeraufsätze abgehoben und die Objektträger an der Luft im Dunkeln für 5 min getrocknet. Es wurden ca. 100 µl Mowiol/1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan (DABCO)-Lösung auf den Objektträgern verteilt, um diese mit einem Deckglas einzudecken. Über Nacht wurden sie dann bei 4 °C getrocknet und am nächsten Tag unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 461 nm betrachtet.
3.15.2 Infektion von BALB/c-Mäusen
Das etablierte Tiermodell für die Leishmaniose ist die experimentelle Infektion der Maus, insbesondere ist die BALB/c-Maus gegenüber Leishmanien empfindlich (PRESTON und DUMONDE 1976, SCOTT und FARRELL 1998). Zu jeder zu untersuchenden Leishmanien-Kultur wurden jeweils fünf weibliche BALB/c-Mäuse infiziert. Dazu wurde die Zellzahl einer sich in der stationären Phase befindenden Kultur promastigoter Stadien bestimmt (siehe 3.11.2) und das entsprechende Volumen für 10 min bei 4 °C und 2050 x g zentrifugiert, einmal mit PBS gewaschen und in PBS aufgenommen. Jeder Maus wurden in die Fußsohle des rechten Hinterlaufs 1 x 107 promastigote Stadien in 30 µl PBS injiziert. Die Dicke des infizierten Fußes wurde über mehrere Wochen mit einer Schubleere gemessen. Die Ergebnisse wurden als die Differenz der Fußdicken des infizierten und des nicht infizierten Hinterlaufs dargestellt.
3.15.3 Isolierung von amastigoten Stadien aus der Maus
Je nach Größe der Fußläsion können mit der Methode nach HART et al. (1981) 1–10 x 108 amastigote Stadien isoliert werden. Die Maus wurde durch Genickbruch getötet. Der rechte Hinterfuß wurde zunächst mit 70%igem Ethanol abgespült, dann mit einem sterilen Skalpell abgetrennt und in kleinere Stücke geschnitten. Diese wurden mit dem Stempel einer Spritze durch ein Metallsieb unter Zugabe von insgesamt 5 ml kalter Proteinaseinhibitoren-Lösung in eine sterile Petrischale gerieben. Mit 5 ml der Lösung wurde nachgespült. Die gewonnene Zellsuspension wurde in ein steriles 30-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 min bei 4 °C und 150 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und für 10 min bei 4 °C und 1500 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml Proteaseinhibitoren-Lösung auf genommen. Die Zellzahl wurde in der Neubauer-Zählkammer (siehe 3.11.2) bestimmt. Anschließend konnten die Zellen zur Herstellung von Lysat aus amastigoten Stadien (siehe 3.13.1) oder zur Rückdifferenzierung zu promastigoten Stadien nach einmaligem Waschen mit SDM-Medium (komplett) verwendet werden.
3.16 Datenverarbeitung
Für Tabellenkalkulationen und Textverarbeitungen wurden Microsoft® Excel 2000 und Word 2000 verwendet. Die Diagramme wurden mit SigmaPlot 7.1 erstellt.