Zur Lokalsation von LmxMPK5 wurde ein chimäres Expressionskonstrukt aus LmxMPK5-eGFP hergestellt. Dieses Konstrukt wurde durch Transfektion in die Doppeldeletionsmutante und durch homologe Rekombination in deren rRNA-Genlokus integriert. LmxMPK5-eGFP wurde sowohl im promastigoten als auch im amastigoten Stadium exprimiert, unabhängig davon, ob mit Puromycin ein Selektionsdruck ausgeübt wurde oder nicht. So konnten grünfluoreszierende amastigote Stadien auch aus der Maus isoliert werden. Zunächst wurde der Phänotyp im Infektionsexperiment untersucht. Es zeigte sich, dass die Integration von LmxMPK5-eGFP in den rRNA-Genlokus im Vergleich zur Doppeldeletionsmutante die Zunahme der Fußdicken infizierter Mäuse beschleunigte. Allerdings gab es weiter signifikante Unterschiede zum Infektionsverlauf beim LmxWT. Interessanterweise bewirkte die Integration von LmxMPK5-eGFP in den rRNA-Lokus eine schnellere Dickenzunahme infizierter Füße
als die einfache Reintegration an den ursprünglichen Genlokus. Dies kann damit erklärt werden, dass Gene am rRNA-Lokus stärker exprimiert werden (RODENKO et al. 1991, LODES et al. 1995) und es deshalb zu unterschiedlichen Mengen funktioneller LmxMPK5 kam. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die Ausprägung des Phänotyps mit der Proteinmenge von LmxMPK5 (LmxWT im Vergleich zur Reintegrationsmutante) korrelierte.
Die fluoreszenzmikroskopischen und immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen von Leishmanien im pro- und amastigoten Stadium zeigten, dass LmxMPK5-eGFP im Zytosol und im Flagellum beider Stadien vorlag. Dagegen wurde im Nukleus der Leishmanien kein eGFP-spezifisches Signal detektiert. LmxMPK5 schien nicht membranassoziiert zu sein und konnte nicht einem bestimmten Zellkompartiment zugeordnet werden. Weitere elektronenmikroskopische Studien stimmten mit diesem Befund überein und demonstrierten darüber hinaus, dass LmxMPK5-eGFP teilweise in Aggregaten vorlag. Diese Beobachtung stimmt auch mit dem Ergebnis eines Versuchs einer Proteinaufreinigung von LmxMPK5 aus Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf9-Zellen) in einer Fast-Protein-Liquid-Chromatography überein (LANGHORST 2003). Hier eluierte LmxMPK5 bei sehr hohen Molekulargewichten. Dies könnte auch ein Hinweis darauf sein, dass LmxMPK5 als Oligo- oder Multimer vorliegt. Die MAPK-Kaskade wird sowohl in Hefe- als auch in Säugerzellen von so genannten Gerüstproteinen reguliert (GARRINGTON et al.
1999). Neben spezifischen Gerüstproteinen wird die Lokalisation und Aktivität der MAPKs auch durch Strukturen geringerer Spezifität wie z. B. dem Mikrotubuli-Zytoskelett oder über Membrandomänen reguliert, an die sie gebunden sind (RESZKA et al. 1995, PENA et al. 2000, FURUCHI und ANDERSON 1998). Dies könnte ebenfalls eine Erklärung für die lokale Häufung der Goldmarkierungen in der Immunelektronenmikroskopie sein.
Eine Umverteilung der Fluoreszenz oder eine Veränderung in der Fluoreszenzintensität wurde in den verschiedenen Entwicklungsstadien oder auch während der Transformation nicht beobachtet. Bisher wurde keine der in Trypanosoma oder Leishmania gefundenen MAPKs genauer lokalisiert.
Ähnlichkeiten lassen sich bei Lokalisationsstudien von MAPKs in anderen eukaryotischen Zellen nicht finden. Hier kann es stimulusabhängig zu einer
Translokation der MAPK vom Zytoplasma in den Nukleus kommen. Durch den Stimulus von Angiotensin II, eines der Hauptregulatoren der Zelldifferenzierung in der Nebennierenrinde, nimmt die Kinaseaktivität einer MAPK in den Glomerulosa-Zellen der Ratte im Zytoplasma ab und im Nukleus dagegen zu (MCNEILL et al. 1998). Eine ähnliche Umverteilung wurde auch durch den Stimulus von Wachstumsfaktoren in Fibroblasten beobachtet (LENORMAND et al. 1998). Während der Reifung der Oozyste des Schweins konnten MAPKs an den Spindelpolen der mitotischen Zellen über konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie lokalisiert werden (LEE et al. 2000).
Obwohl zu erwarten ist, dass eine phosphorylierungsabhängige Regulation der Transkription eine Lokalisation der hierfür relevanten Kinasen im Zellkern voraussetzt, befinden sich zahlreiche Transkriptionsfaktoren der Säuger vor ihrer Aktivierung durch MAPKs im Zytoplasma (MACFARLANE et al. 1999). Auch die Aktivierung der MAPK durch eine MAPKK scheint im Zytoplasma stattzufinden. So wurde beim Säuger MAPK1, ein Aktivator von ERK-2, im Zytoplasma lokalisiert (ZHENG und GUAN 1994). Die MAPK-Kaskade stellt ein Bindeglied zwischen Rezeptoren der Zelloberfläche und dem Zellkern dar. Über welche Strukturen direkt auf die Transkription Einfluss genommen wird, ist für die Trypanosomatiden nicht geklärt. Transkriptionsfaktoren wurden bisher nicht gefunden (PARSON und RUBEN 2000). Außerdem wurde im Säuger gezeigt, dass ERK-1 und -2 auch eine Anzahl von zytoplasmatischen Proteinen phosphorylieren können, wie z. B. die zytosolische Phospholipase A2 und die zytosolische Domäne des EGF-Rezeptors (WASKIEWICZ und COOPER 1995).
5.7 Ausblick
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass LmxMPK5 eine wichtige Rolle in der Regulation der Proliferation der pro- und amastigoten Stadien besitzt. Aufbauend auf diesen Ergebnissen kann nun eine weitere Aufklärung ihrer Funktion in der Signaltransduktion und die Suche nach ihren Interaktionspartnern erfolgen. Hierzu müsste die aktive rekombinante Form der Kinase in Expressionssystemen, z. B. in Insektenzellen wie den Sf9-Zellen, exprimiert werden, um sie in größeren Mengen isolieren zu können. Die aufgereinigte Kinase könnte dann in vitro verwendet werden, um physiologische Substrate der Kinase zu ermitteln. Sie könnte durch die Phosphorylierung von Ganzzell-Lysaten von L. mexicana mit anschließender Analyse
des spezifischen Fragmentierungsmusters der phosphorylierten Proteine im Massenspektrometer, „Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time-of-flight“
(MALDI-TOF), eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit wäre, die Phosphorylierungseffizienz der Kinase an Peptiden zufälliger Sequenz zu vergleichen. Bibliotheken solcher Peptide sind seit kurzem kommerziell erhältlich (RUSSELLO 2003). Der Abgleich der so identifizierten Phosphorylierungs-Konsensus-Sequenz mit dem zumindest schon teilweise vorliegenden Leishmania-Proteom könnte mögliche Substrate identifizieren. Genauso wichtig ist auch die Identifikation der LmxMPK5-aktivierenden Interaktionspartner. Eine mögliche Methode wäre hierzu die Verwendung des TAP-Tag (Tandem-Affinity-Purification-Tag), welches eine Aufreinigung großer, nativer Multiprotein-Komplexe über zwei Affinitätschromatographien ermöglicht (GAVIN 2002). Die kopräzipitierten Bindungspartner können dann im Massenspektrometer analysiert werden.
Eine weitere Möglichkeit, die molekularen Auswirkungen der Deletion von LmxMPK5-/- zu studieren, ist die Proteomanalyse des LmxWT und der Deletionsmutante in einer zweidimensionalen SDS-PAGE. Hieraus können weiterführende Rückschlüsse hinsichtlich der Rolle und Funktion der Kinase gezogen werden.
5.7.1.1 Potenzial von LmxMPK5-/- als attenuierter Lebendimpfstoff gegen Leishmaniose
Eine Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Ergebnisse wäre die Verwendung der LmxMPK5-Doppeldeletionsmutante als attenuierter Lebendimpfstoff.
Lebendimpfstoffe besitzen in der Immunprophylaxe den Vorteil, dass sie genau die Immunantwort auslösen, die für ihre Bekämpfung notwendig ist. Wegen der Sicherheitsaspekte ist die Administration von Wildtypstämmen inakzeptabel, weshalb Attenuierungen eingeführt werden, um die Vermehrung und die Virulenz abzuschwächen. Diese Technologie hat sich insbesondere bei bakteriellen Impfstoffen, wie z. B. gegen Salmonellen, bewährt und wird sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin verwendet (GRUND et al. 1997). Es gibt darüber hinaus Entwicklungen, Salmonellen durch Deletion der Kinase phoQ zu attenuieren.
Diese ist ein Regulator, der die Expression für die Virulenz essenzieller Gene steuert (GALAN und CURTISS 1989).
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die vollständige Deletion von LmxMPK5 zu einer Attenuierung der Leishmanien führt. Zwar blieben die Leishmanien invasiv und konnten Makrophagen infizieren und in ihnen proliferieren, doch zeigen die Ergebnisse der Mausinfektion, dass die Tiere diese Infektion kontrollieren konnten. Allerdings demonstrierte die histologische Untersuchung der infizierten Füße 45 Wochen p. i., dass sich in der gesamten Dermis persistierende Leishmanien befanden. Da diese nach ihrer Reisolierung in Kultur proliferierten, wird deutlich, dass die Deletion von LmxMPK5 keine hinreichende Attenuierung für einen Impfstoff darstellt. Vielmehr müsste die Deletion von LmxMPK5 mit anderen Mutationen kombiniert werden, um einen sicheren attenuierten Lebendimpfstoff zu generieren.
5.7.2 Potenzial der Kinaseinhibitoren als Therapie gegen Leishmaniose
Mit der fortschreitenden Aufklärung von Signaltransduktionsmechanismen und der Funktion einzelner MAPKs im Säuger fanden sich einige Zielstrukturen für Inhibitoren. Ihre Hemmung kann der Therapie von z. B. entzündlichen Erkrankungen oder Krebs, deren Ursache teilweise eine Dysregulation von MAPK-Kaskaden ist (siehe 2.7.1), dienen. Die Entwicklung von Pharmaka, die mit Signaltransduktionswegen und der Genexpression interferieren und so z. B. eine proinflammatorische Antwort abschwächen können, ist ein sehr viel versprechender Weg. Die meisten Proteinkinaseinhibitoren sind kleine Moleküle, die entweder mit der Phosphorylierung interferieren oder (kompetitiv) an der ATP-Bindungsstelle der MAPK binden (HOMMES et al. 2003). Diese kleinen Moleküle haben den Vorteil, dass sie oral verabreicht werden können. Außerdem ist die Produktion von MAPK-Inhibitoren weitaus kostengünstiger als z. B. eine autologe Tumorvakzine.
Die Deletion der in Leishmania gefundenen MAPKs und die Identifikation kinasespezifischer Aminosäuren und Sequenzmotive ermöglicht die Erstellung von Mutanten zur Untersuchung der Funktion dieser Moleküle. So können auch in den Protozoen potenzielle Zielstrukturen für Inhibitoren gefunden werden, deren Hemmung die Signaltransduktionskaskade unterbricht und so die Proliferation oder
die Differenzierung der Parasiten stoppt. Auf Grund nur geringer Sequenzähnlichkeiten der MAPKs zu denen höherer Eukaryoten sind Nebenwirkungen durch die gleichzeitige Hemmung humaner Kinasen nicht zu befürchten (HAMMARTON et al. 2003). Wirkstoffbibliotheken, die auf spezifischen Faltungsstrukturen von Proteinkinasen basieren, stehen mittlerweile zur Verfügung (GRAY et al. 1998). Es wurden umfangreiche Screenings durchgeführt auf der Suche nach Komponenten, die Proteinkinasen hemmen, welche an der Entstehung von Krebs, Entzündungen oder neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind (HOMMES et al. 2003). Der molekulare Mechanismus der Inhibitor-Proteinkinase-Interaktion kann über klassische enzymatische Methoden weiter untersucht oder die Proteinkinase kann kristallisiert werden, um einen detaillierten Aufschluss über die Interaktionen jeder Domäne des Enzyms mit dem Inhibitor zu gewinnen (z. B.
Staurosporin mit den humanen CDK2, LAWRIE et al. 1997). Diese Informationen können für die Synthese eines noch potenteren Inhibitors genutzt werden. Jedoch wurde bis jetzt nur ein geringes Interesse am Screening für Inhibitoren von Proteinkinasen parasitischer Protozoen gezeigt (DÖRIG et .al. 2002).
Eine mögliche Zielstruktur, LmxMPK1, wurde in L. mexicana bereits gefunden (WIESE 1998). Auch die Hemmung von LmxMPK5 würde sich für die Therapie der KL eignen. Sie verlangsamt die Proliferation der amastigoten Stadien in murinen Makrophagen und verhindert die Läsionsbildung in infizierten Mäusen. Da das Überleben der amastigoten Stadien in der Maus nicht vollständig verhindert wurde, wäre es sinnvoll einen LmxMPK5-Inhibitor in Kombination mit einem weiteren Hemmer einer anderen Kinase, wie z. B. der LmxMPK1, einzusetzen, um so den Erfolg dieser Therapie zu erhöhen. Eine Kombination aus mehreren Inhibitoren ist auch im Hinblick auf eine mögliche Resistenzentwicklung gegen einzelne Komponenten sinnvoll. Außerdem lassen die großen Sequenzähnlichkeiten der bereits in L. mexicana gefundenen MAPKs zu den MAPKs anderer Leishmania-Arten (WIESE und GÖRCKE 2001) auch Ähnlichkeiten in der Funktion der jeweiligen homologen Kinasen erwarten. Damit ist es wahrscheinlich, dass diese gegebenenfalls auch durch denselben Inhibitor gehemmt werden könnten. So würde sich die Möglichkeit eines Therapieansatzes auf andere Leishmaniose-Formen ausdehnen. Das gleiche gilt für die Homologien zu MAPKs in Trypanosoma (MÜLLER et al. 2002, WIESE et al. 2003b).
6 Zusammenfassung
In-vitro- und in-vivo-Charakterisierung einer LmxMPK5-Deletionsmutante von Leishmania mexicana
Petra Wanders
Die Leishmaniose ist eine weltweit verbreitete Infektion, die durch Schmetterlingsmücken übertragen wird. Mit geschätzten 12 Millionen infizierten Menschen stellt sie ein großes Gesundheitsproblem insbesondere in den tropischen und subtropischen Regionen dar. Je nach der Leishmania-Art und dem Immunstatus des Wirtsorganismus gibt es bei der Leishmaniose ein breites Spektrum von Krankheitsbildern. Sie kann zu einer selbst heilenden kutanen Läsion bis hin zu einer letalen Infektion des gesamten retikulo-endothelialen Systems führen. Die derzeit verfügbaren Therapeutika sind in vielen Fällen nicht effizient und zuverlässig genug und besitzen oftmals starke Nebenwirkungen. Außerdem werden zunehmend Resistenzentwicklungen gegenüber diesen Wirkstoffen beobachtet. Auf der Suche nach neuen Therapieansätzen wird die Unterbrechung von Signaltransduktionswegen des Parasiten diskutiert, um dessen Differenzierung und Proliferation im Wirtsorganismus zu stoppen. Mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPKs) stellen eine für Inhibitoren geeignete Zielstruktur dar. In Säugerzellen ist bereits eine große Anzahl von MAPKs identifiziert und charakterisiert worden.
Dagegen sind in Leishmania mexicana bisher erst neun MAPK-homologe DNA-Sequenzen bekannt, deren Funktionen noch weitestgehend unklar sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle einer weiteren MAPK, LmxMPK5, untersucht. Es wurde gezeigt, dass LmxMPK5 im amastigoten Stadium stärker als im promastigoten Stadium exprimiert wird. Anhand der Charakterisierung des Phänotyps einer Doppeldeletionsmutante von LmxMPK5 wurde die Funktion der Kinase untersucht. LmxMPK5 beeinflusste weder die Differenzierung im promastigoten oder amastigoten Stadium noch die Morphologie der Parasiten, wie Untersuchungen mittels Immunoblot sowie Phasenkontrast- und Rasterelektronenmikroskopie zeigten. Im Gegensatz dazu verminderte die Deletion von LmxMPK5 signifikant die Proliferation der promastigoten und amastigoten
Stadien in vitro. Die Reintegration von LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus auf einem Allel der Doppeldeletionsmutante erhöhte wiederum die Proliferation der amastigoten Stadien in Makrophagen in vitro. Die Infektiosität für murine Makrophagen in vitro wurde durch die Doppeldeletion nicht beeinflusst. Im Infektionsexperiment mit BALB/c-Mäusen wurde jedoch gezeigt, dass LmxMPK5 essenziell für die Entwicklung einer klinischen Leishmaniose ist. Zehn Wochen nach der Infektion mit der Doppeldeletionsmutante zeigten die Mäuse nur eine geringgradige Schwellung des infizierten Fußes, die sich über 1,5 Jahre nicht veränderte. Nach dieser Zeit konnten sowohl histologisch als auch über Anzüchtung in der Kultur im Fuß persistierende Leishmanien nachgewiesen werden. Um LmxMPK5 zu lokalisieren, wurde ein DNA-Konstrukt hergestellt, das für ein Fusionsprotein aus LmxMPK5 und dem grünfluoreszierenden Protein kodiert. Nach Integration in den rRNA-Lokus von L. mexicana zeigte diese Mutante eine im Vergleich zur Doppeldeletion gesteigerte Proliferation und Infektiosität.
Fluoreszenzmikroskopisch wurde das Fusionsprotein sowohl im pro- als auch im amastigoten Stadium im Zytosol jedoch nicht im Nukleus lokalisiert. Dieses wurde mittels Immunelektronenmikroskopie bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LmxMPK5 eine wichtige Rolle für die Proliferation von L. mexicana und für den Verlauf der Leishmaniose im Mausmodell besitzt. Somit erscheint LmxMPK5 als ein geeigneter Kandidat, dessen therapeutische Hemmung durch Kinaseinhibitoren eine Verbesserung der klinischen Leishmaniose ermöglichen könnte.
7 Summary
In vitro and in vivo characterization of LmxMPK5 knock out mutant of Leishmania mexicana
Petra Wanders
Leishmaniases constitute a globally widespread group of parasitic infections transmitted through the phlebotomine sandfly. With 12 million infected people they represent a major health problem especially in subtropical and tropical regions.
Depending on the Leishmania species and on the immune status of the infected host leishmaniases can cause clinical manifestations ranging from self-healing cutane lesions to lethal visceral infections characterized by fever, weight loss, swelling of the spleen and liver as well as anaemia. Most of the drugs available are insufficient and lead to toxic side effects and, importantly, become less efficient because of durg resistance. Thus, there is an urgent need of novel therapeutics to treat Leishmania infections. One possible approach is the interruption of the signalling cascade of the parasite thereby stopping its proliferation and differentiation in the host. In this connection, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) represent potential targets for kinase inhibitiors. While many MAPKs are already known in mammals, there are only nine genes encoding MAPK homologues identified in Leishmania mexicana.
Here, the role of the recently identified MAPK, LmxMPK5, has been studied.
Immunoblotting revealed, that LmxMPK5 is always present in L. mexicana in vitro.
However, it seems to be more expressed in amastigotes than in promastigotes. The characterization of the LmxMPK5 knock out mutant showed that the defect neither affects the differentiation nor the morphology of the parasites. In contrast, the knock out of LmxMPK5 was leading to significantly decreased proliferation of both promastigotes and amastigotes. Moreover, the reintegration of LmxMPK5 into its original gene locus restored the proliferative capacity of Leishmania amastigotes in macrophages in vitro thereby demonstrating the specificity of this phenotype.
Although the virulence of the parasites in vitro was similar to the wildtype, the development of clinical leishmaniasis in mice infected with the knockout mutant was highly impaired. In fact, infected mice showed no clinical symptoms even after 1.5
years, when animals were sacrificed for further examination. On the other hand, the preparation and histological analysis of these samples revealed the presence of cultivatable persisting parasites. Finally, in the attempt to study the intracellular localization of LmxMPK5 the chimeric LmxMPK5-eGFP construct has been generated and integrated into the rRNA locus of the knockout mutant. The proliferative capacity as well as virulence in mice was partially restored demonstrating the biological activity of the fusion protein. Fluorescence microscopy revealed that LmxMPK5-eGFP is localized in the cytosol but not in the nucleus of the parasites. These observations were in accord with additional results obtained from immune electron microscopy.
In conclusion, the present study firstly demonstrates that LmxMPK5 plays an important role in proliferation of Leishmania and the development of leishmaniasis in mice. Therefore, LmxMPK5 constitutes a potential candidate as target for kinase inhibitors to stop disease progression and to lead to a better prognosis of infected patients.
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