Um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte tatsächlich auf die Deletion der LmxMPK5 zurückzuführen sind, wurde LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus reintegriert. Nachfolgend wurde untersucht, ob hierdurch der Phänotyp des LmxWT wiederhergestellt wurde.
Das NEO und das HYG der Doppeldeletionsmutante (LmxMPK5-/-, Klon 1 und 2) wurde mittels homologer Rekombination durch LmxMPK5 und zur Selektion durch das Phleomycinresistenzgen (PHLEO) ersetzt (Abb. 23). Das für die Rekombination eingesetzte DNA-Fragment bestand aus LmxMPK5, der intergenen Region (IR) des DHFR-TS Genlokus und PHLEO, die von den stromauf- (5’) bzw. abwärtsliegenden (3’) UTR von LmxMPK5 flankiert wurden. Über diese flankierenden Regionen wurde die homologe Rekombination vermittelt.
NEO oder HYG
Abb. 23: Reintegration von LmxMPK5 an seinen ursprünglichen Genlokus.
NEO oder HYG wurden mittels homologer Rekombination durch das LmxMPK5-Gen und PHLEO ersetzt.
Zur Herstellung des DNA-Fragments wurde das Plasmid pX63polPAC-MPK5ds verwendet (Abb. 24A). Dieses enthält LmxMPK5, seine 3’UTR und ein Puromycinresistenzgen (PAC). PAC wurde zunächst gegen PHLEO aus dem Plasmid pX63polPHLEO ersetzt (Abb. 24B). Hierzu wurden beide Plasmide mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und NsiI geschnitten und das PHLEO-tragende Fragment mit dem linearisierten pX63polPAC-MPK5ds (ohne PAC) ligiert (Abb. 24C).
Das resultierende Plasmid pX63polPHLEO-MPK5ds wurde zur Amplifikation in E.
coli XL-1 Blue transformiert. Anschließend wurde in dieses Plasmid die 5`UTR von LmxMPK5 aus pBSII-MAPKIN14-PHLEO eingebracht (Abb. 24D). Hierzu wurden beide Plasmide mit NcoI und NheI geschnitten, und das 5’UTR-tragende DNA-Fragment in den linearisierten pX63polPHLEO-MPK5ds-Vektor ligiert (Abb. 24E).
Das entstandene Plasmid, pX63upPHLEO-IR-MPK5ds wurde nach Transformation in E. coli XL-1 Blue amplifiziert. Seine Richtigkeit wurde durch Analyse der Fragmentlängen nach Inkubation mit Restriktionsendonukleasen überprüft.
A B
C D
E
A B
C D
E
Abb. 24: Vereinfachtes Klonierungschema zur Herstellung von pX3upPHLEO-IR-MPK5ds. Die Plasmide pX63polPAC-MPK5ds (A) und pX63polPHLEO (B) wurden mit XhoI und NsiI geschnitten und zu pX63polPHLEO-MPK5ds (C) ligiert. Dieses und pBSII-MAPKIN14-PHLEO (D) wurden mit NcoI und NheI geschnitten und zu pX3upPHLEO-IR-MPK5ds (E) ligiert. Das DNA-Fragment zur Rekombination wurde durch Restriktion mit Eco47III und NheI gewonnen.
Zur homologen Rekombination wurde dieses Plasmid mit Eco47III und NheI geschnitten (Abb. 24E). Das isolierte 4383 bp große Eco47III/NheI-Fragment bestand aus der 5`UTR von LmxMPK5, PHLEO, einer IR, LmxMPK5 und der 3`UTR von LmxMPK5. Durch Elektroporation wurde das Fragment in die Klone 1 und 2 der Doppeldeletionsmutanten LmxMPK5-/- eingebracht und über homologe Rekombination auf einem Allel in den ursprünglichen Genlokus von LmxMPK5 integriert. Hierbei wurde entweder NEO oder HYG durch das Fragment ersetzt (Abb.
23).
Nach der Elektroporation der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- mit dem Fragment konnten nach 12 Tagen Kultivierung mit 5 µg/ml Phleomycin aus dem Transfektionsansatz des Klons 1 vier neue Klone und aus dem des Klons 2 ein neuer Klon isoliert werden. Die Klone wurden durch ein Southern Blotting darauf getestet, ob das LmxMPK5-tragende Fragment an der richtigen Stelle in das Genom integriert worden war. Hierzu erfolgte eine Restriktionsspaltung der genomischen DNA des LmxWT sowie der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- und der fünf neu entstandenen Klone mit ClaI. Dieses Enzym besitzt eine Schnittstelle am 5`-Ende von LmxMPK5 sowie in seiner 3´UTR, sodass durch Restriktionsspaltung ein 2932 bp großes Fragment entstand. Es wurden die gleichen Mengen DNA pro Probe in einer Agarosegelelektrophorese aufgetrennt (Abb. 25A und Abb. 26A). Die Detektion erfolgte mit einer DIG-markierten, an LmxMPK5-bindenden Sonde (Abb. 25B) und in zwei weiteren Hybridisierungen mit Sonden, die HYG oder NEO (Abb. 26B, C) detektierten.
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
Standard Standard
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re LmxMPK5-/re
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxWT LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re LmxMPK5-/re
Standard Standard
Abb. 25: Kontrolle der Reintegration von LmxMPK5 durch Southern Blotting.
(A) Agarosegelelektrophoretische Auftrennung der mit ClaI geschnittenen genomischen DNA; (B) zugehöriger Southern Blot; Hybridisierung mit einer DIG-markierten, LmxMPK5-bindenden Sonde.
Die Hybridisierung mit der LmxMPK5-Sonde ergab beim LmxWT eine 2932 kb große Bande, die auch bei den fünf Klonen aus dem Reintegrationsversuch von LmxMPK5 vorhanden war (Abb. 25B). LmxMPK5 wurde also in alle fünf getestete Klone reintegriert. Wie zu erwarten, fehlte diese Bande bei dem Klon 1 von LmxMPK5-/-, der als Negativkontrolle verwendet wurde.
23,1 kb
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re
LmxMPK5-/-, Klon 1 Klon 1.1 Klon 1.2 Klon 1.3 Klon 1.4 Klon 2.1
LmxMPK5-/re LmxMPK5-/re
Standard
A B C
Abb. 26: Kontrolle der Reintegration von LmxMPK5 mittels Southern-Blot-Hybridisierung von einer NEO- oder HYG-Sonde. (A) Agarosegelelektrophoretische Auftrennung der mit ClaI geschnittenen genomischen DNA; (B) zugehöriger Southern Blot; Hybridisierung mit DIG-markierter NEO-Sonde; (C) dieselbe Blotmembran nach Stripping und Hybridisierung mit DIG-markierter HYG-Sonde.
In beiden mit der HYG- sowie NEO-Sonde hybridisierten Southern Blots zeigte der Klon 1 von LmxMPK5-/- eine HYG- bzw. NEO-Bande. Dies war zu erwarten, da auf beiden Allelen LmxMPK5 durch die Antibiotikaresistenzgene ersetzt worden war. Bei gleicher Auftragsmenge (Abb. 26A) hybridisierten die Proben der Klone 1.1 bis 1.4 von LmxMPK5-/re mit der NEO- aber nicht mit der HYG-Sonde (Abb. 26B bzw. C).
Dies zeigte, dass bei diesen Klonen HYG durch das LmxMPK5-kodierende Fragment ersetzt worden war. Im Klon 2.1 von LmxMPK5-/re wurde NEO gegen das LmxMPK5-tragende Fragment ausgetauscht, da bei diesem Klon keine Bande bei der Hybridisierung der Blotmembran mit der NEO-Sonde sichtbar war.
Für die weiteren Untersuchungen zur Reintegration wurden die Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re ausgewählt. Ob LmxMPK5 nach seiner Reintegration auf einem Allel der Doppeldeletionsmutanten wieder exprimiert wurde, wurde mittels Immunoblot untersucht. Hierzu wurde Lysat promastigoter Stadien des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re hergestellt. Je Probe wurden ein Lysat von 2 x 107 Zellen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit einem affinitätsgereinigten Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 getestet (Abb. 27). Es zeigte sich, dass nach der Reintegration von LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus, LmxMPK5 wieder im promastigoten Stadium exprimiert wurde.
Abb. 27: Kontrolle der LmxMPK5-Expression in promastigoten Stadien nach Reintegration. Immunoblot mit Ganzzell-Lysat von promastigoten Stadien. Es wurde affinitätsgereinigtes Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 verwendet. Je Probe wurden 2 x 107 Leishmanien aufgetragen.
Dasselbe wurde auch im amastigoten Stadium in vitro untersucht. Hierzu wurde der Klon 1.1 von LmxMPK5-/re vom promastigoten in das amastigote Stadium transformiert und aus der Kultur der amastigoten Stadien wurden am 1., 3., 5. und 7.
Tag nach Beginn des Versuches Proben entnommen. Lysate von 2 x 107 Leishmanien wurden je Probe mittels SDS-PAGE aufgetrennt (Abb. 28B) und im Immunoblot mit einem affinitätsgereinigten Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5 getestet. LmxMPK5 wurde nach seiner Reintegration in den ursprünglichen Genlokus auch im amastigoten Stadium in vitro exprimiert (Abb. 28A).
Abb. 28: Kontrolle der LmxMPK5-Expression in amastigoten Stadien nach Reintegration. (A) Immunoblot mit Ganzzell-Lysat von amastigoten Stadien aus einer Kultur mit affinitätsgereinigtem Antiserum aus Kaninchen gegen den COOH-Terminus von LmxMPK5. Je Probe wurden 2 x 107 Leishmanien aufgetragen; (B) mit Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel mit dem selben Probenauftrag.
4.4.1 Promastigotenwachstum von LmxMPK5-/re
Es wurde das Wachstum der promastigoten Stadien der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re mit dem des LmxWT und der doppelten Deletionsmutanten in vitro verglichen. Hierzu wurden die Kulturen jeweils in Triplikaten mit 1 x 106
promastigoten Stadien angeimpft und über 4 Tage alle 24 h gezählt. Die Abb. 29 zeigt, dass es keinen Unterschied zwischen den Klonen der Doppeldeletionsmutante und den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re im Wachstumsverlauf gab. Sie alle wuchsen langsamer und erreichten eine geringere maximale Zelldichte in der Kultur als LmxWT.
Tage nach Versuchsbeginn
0 1 2 3
Leishmanien/ml (+/- Standardabweichung)
106 107 108
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2 LmxMPK5-/re, Klon 1.1 LmxMPK5-/re, Klon 2.1
*
Abb. 29: Das Wachstum promastigoter Stadien in vitro des LmxWT sowie der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- und der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re.
Die Anzahl der Leishmanien pro ml wurde über 3 Tage gezählt und logarithmisch aufgetragen. Gezählt wurden jeweils Triplikate, deren Mittelwert mit der Standardabweichung gezeigt wird. (*) zeigt die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen LmxWT und den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- (P=0,0007 bzw. P=0,0005). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Klonen der Doppeldeletionsmutante und den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re (P=0,08 und P=0,18).
4.4.2 Wachstum amastigoter Stadien von LmxMPK5-/re in Peritonealmakrophagen
Um zu untersuchen, ob die Reintegration von LmxMPK5 an dessen ursprünglichen Genlokus das schnellere Wachstum der amastigoten Stadien des LmxWT in Makrophagen wiederherstellte, wurden murine Peritonealmakrophagen in vitro mit den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re infiziert. Der Versuch wurde drei Mal wie in 4.3.3 durchgeführt und mit dem Wachstum der amastigoten Stadien des LmxWT und den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- in Abb. 30 verglichen.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7
Leishmanien/Makrophage
0 5 10 15 20 25 30
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2 LmxMPK5-/re, Klon 1.1 LmxMPK5-/re, Klon 2.1
*
*
Abb. 30: Wachstum der amastigoten Stadien in vitro. Durchschnittliche Parasitenlast aus jeweils 300 randomisiert gezählten Makrophagen über 7 Tage; (*) Die Unterschiede an Tag 7 p. i. zwischen LmxWT und den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re (P=7,9 x 10-7 bzw. P=5,7 x 10-6) sowie zwischen den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re und den Klonen 1 bzw. 2 von LmxMPK5-/- (P=0,0028 und P=0,0027) waren statistisch signifikant.
Die Abb. 30 zeigt, dass die Anzahl der amastigoten Stadien von LmxMPK5-/re pro Makrophage wie beim LmxWT und bei den Klonen von LmxMPK5-/- stetig anstieg.
Die Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re erzeugten eine signifikant höhere Parasitenlast pro Makrophage als die Klone 1 und 2 der Doppeldeletionsmutante. Im Vergleich zum LmxWT blieb die Parasitenlast jedoch signifikant niedriger. Die Ergebnisse zeigten, dass die Reintegration von LmxMPK5 in das Leishmania-Genom das Amastigotenwachstum steigerte, jedoch nicht das Wachstumsniveau des LmxWT wiederherstellte.
Des Weiteren wurde die Verteilung der Leishmanien in den Makrophagen wie in 4.3.3 beschrieben näher untersucht. Entsprechend ihrer Parasitenlast wurden die Makrophagen in folgende Gruppen eingeteilt: 0, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Leishmanien pro Makrophage. In Abb. 31 wird beispielhaft eines der drei durchgeführten Experimente dargestellt. Die Ergebnisse der anderen beiden Experimente befinden sich im Anhang unter 9.5.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Makrophagen ohne Lmx Makrophagen mit 1-10 Lmx Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 31: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen. Die infizierten Makrophagen (n=100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Lmx pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
Die Verteilung der Makrophagen nach LmxWT-Infektion zeigte, dass der Anteil nicht infizierter Makrophagen mit 10–20 % über die Zeit konstant blieb und die Infektionsrate ca. 80 % betrug. Die meisten Makrophagen enthielten am 1. und 3.
Tag 1–10 amastigote Stadien des LmxWT (>75 % bzw. 50 %), am 5. Tag 11–20 (ca.
35 %) und am 7. Tag >30 (ca. 60%).
Die Analyse der Klone von LmxMPK5-/re ergab, dass sich Klon 1.1 und Klon 2.1 ähnlich verhielten. Die Infektionsrate lag bei ca. 90 %. Am 1. Tag p. i. enthielten 80–
90 % der gezählten Makrophagen 1–10 amastigote Stadien des Klons 1.1 von LmxMPK5-/re. Am 3. Tag wurden in ca. 70 % der Makrophagen 1–10 amastigote Stadien gezählt, während bei der Infektion mit dem Klon 2.1 von LmxMPK5-/re über 50 % der Makrophagen bereits 11–20 Leishmanien enthielten. Am 5. Tag lagen die Anteile der Makrophagen mit 11–20 Leishmanien zwischen 50–60 %. Am 7. Tag p. i.
stieg der Anteil der Makrophagen mit 21–30 amastigote Stadien des Klon 2.1 von LmxMPK5-/re auf 40–45 % an. Er war ungefähr so groß wie der Anteil der Makrophagen mit 11-20 amastigoten Stadien. Im Gegensatz zur Infektion mit LmxWT gab es keine Erhöhung der Makrophagengruppe mit mehr als 30 amastigote Stadien.
Zusammenfassend wurde beobachtet, dass die Reintegration von LmxMPK5 an dessen urspünglichen Genlokus eine signifikante Steigerung des Wachstums der amastigoten Stadien in Makrophagen verursachte (Abb. 30). Die Darstellung der Verteilung der Makrophagen gemäß ihrer Parasitenlast zeigte jedoch nur eine geringe Veränderung durch die Reintegration im Vergleich zu dem Wachstum von LmxMPK5-/- in Makrophagen (Abb. 31 und Abb. 20).
4.4.3 Infektionsverlauf von LmxMPK5-/re im Mausmodell
Um zu testen, ob durch die Reintegration von LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus die Infektiosität des LmxWT in vivo wiedererlangt wurde, wurde jeweils eine Gruppe von fünf Mäusen mit den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re infiziert.
Zwischen dem Anzüchten der Klone nach der Transfektion und der Infektion der Mäuse lagen ca. 4 Wochen. Den Mäusen wurden 1 x 107 promastigote Stadien in die Sohle des rechten Hinterfußes injiziert. Der Infektionsverlauf wurde durch die
Messung der Fußdicken des infizierten und des nicht infizierten Hinterfußes verfolgt.
In der Abb. 32 wurden zum Vergleich die selben LmxWT-Daten wie in dem Experiment unter 4.3.4 verwendet, um eine größere Zahl von Versuchstieren zu vermeiden.
Nach 8 Wochen zeigte sich eine geringe Fußdickenzunahme, die jedoch in den darauf folgenden Wochen nicht weiter zunahm. Nach 36 Wochen war wiederum eine leichte Dickenzunahme zu verzeichnen. Im Mausmodell zeigte die Reintegration von LmxMPK5 in seinen ursprünglichen Genlokus nur einen geringen Effekt. Zwar schritt die Infektion schneller fort als bei der Doppeldeletionsmutante, die nach 1,5 Jahren nur eine geringe Fußdickenzunahme zeigte, jedoch lag die Zunahme der Fußdicken weit hinter der der LmxWT-Infektion. Da die Infektion mit den Klonen 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re zu einem späteren Zeitpunkt vorgenommen wurde als die mit den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/-, bleibt abzuwarten, wie sich der Infektionsverlauf weiterentwickelt.
Wochen p. i.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Differenz der Dicken des infizierten und nicht infizierten Fußes (mm) 0 1 2 3