Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 49: Wachstumsverhalten des LmxWT, des Klons 1 von LmxMPK5-/- in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 1. Die infizierten Makrophagen (n=100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Lmx pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Makrophagen ohne Lmx Makrophagen mit 1-10 Lmx Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 50: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 2. Die infizierten Makrophagen (n=100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Lmx pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Makrophagen ohne Lmx Makrophagen mit 1-10 Lmx Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 51: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 2. Die infizierten Makrophagen (n=100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >21-30 Lmx pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Makrophagen ohne Lmx Makrophagen mit 1-10 Lmx Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 52: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 3. Die infizierten Makrophagen (n=100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >21-30 Lmx pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
9.6 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung des Lebenszyklus der Leishmanien. 15 Abb. 2: Geographische Verbreitung der VL, der KL und der mukokutanen
Leishmaniose. 16 Abb. 3: Schematische Darstellung der MAPK-Signalkaskade. 27
Abb. 4: Unphosphorylierte Struktur von ERK-2. 28 Abb. 5: Vereinfachte, schematische Übersicht der Signalwege der eukaryotischen
Zelle. 31 Abb. 6: RNA-Prozessierung durch das Trans-Spleißen und die Polyadenylierung
bei Leishmanien. 36
Abb. 7: Deletion von LmxMPK5. 38
Abb. 8: Aufbau der Southern-Blotting-Apparatur 58 Abb. 9: Schematischer Aufbau eines Immunoblottings. 63
Abb. 10: LmxMPK5-Expression in promastigoten Stadien in vitro. 71 Abb. 11: Expression von GP63 als Kontrolle der Transformation vom
promastigoten zum amastigoten Stadium. 73 Abb. 12: Expression von SAP als Kontrolle der Transformation vom promastigoten
und zum amastigoten Stadium. 74
Abb. 13: LmxMPK5-Expression nach Transformation. 75 Abb. 14: Vergleichende Phasenkontrastmikroskopie promastigoter Stadien. 76 Abb. 15: Vergleichende SEM von promastigoten Stadien. 77 Abb. 16: Das Promastigotenwachstum in vitro von LmxWT und LmxMPK5-/-. 78 Abb. 17: Murine Peritonealmakrophagen 24 h p. i.. 80 Abb. 18: Murine Peritonealmakrophagen 7 Tage p. i.. 81 Abb. 19: Wachstum amastigoter Stadien in vitro. 82 Abb. 20: Wachstumsverhalten von LmxWT sowie den Klonen 1 und 2 von
LmxMPK5-/- in murinen Peritonealmakrophagen. 84 Abb. 21: Verlauf der Infektion der Fußsohlen von BALB/c-Mäusen mit LmxWT
sowie den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/-. 86 Abb. 22: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Semidünn-Schnittes aus einem
Fuß einer mit dem Klon 1 von LmxMPK5-/- infizierten Maus. 87 Abb. 23: Reintegration von LmxMPK5 an seinen ursprünglichen Genlokus. 88
Abb. 24: Vereinfachtes Klonierungschema zur Herstellung von
pX3upPHLEO-IR-MPK5ds. 90 Abb. 25: Kontrolle der Reintegration von LmxMPK5 durch Southern Blotting. 92
Abb. 26: Kontrolle der Reintegration von LmxMPK5 mittels
Southern-Blot-Hybridisierung von einer NEO- oder HYG-Sonde. 93 Abb. 27: Kontrolle der LmxMPK5-Expression in promastigoten Stadien nach
Reintegration. 94 Abb. 28: Kontrolle der LmxMPK5-Expression in amastigoten Stadien nach
Reintegration. 95 Abb. 29: Das Wachstum promastigoter Stadien in vitro des LmxWT sowie der
Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- und der Klone 1.1 und 2.1 von
LmxMPK5-/re. 96 Abb. 30: Wachstum der amastigoten Stadien in vitro. 97
Abb. 31: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von
LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen. 99 Abb. 32: Verlauf der Fußsohleninfektion von BALB/c-Mäusen mit LmxWT sowie
mit den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- und mit den Klonen 1.1 und
2.1 von LmxMPK5-/re. 102
Abb. 33: Vereinfachtes Klonierungschema zur Herstellung von
pSSU-int-MPK5-eGFP-lmcpbds-pac. 105 Abb. 34: Kontrolle der Expression von LmxMPK5-eGFP. 106
Abb. 35: Immunoblot mit Ganzzell-Lysat aus promastigoten Stadien einer Kultur mit einem monoklonalen Antikörper gegen GFP aus der Maus. 107 Abb. 36: Verlauf der Fußsohleninfektion von BALB/c-Mäusen mit LmxWT, mit dem
Klon 1 von sowie dem Klon 1.G1 von
+LmxMPK5-eGFP. 108 Abb. 37: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme promastigoter Stadien. 109
Abb. 38: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme amastigoter Stadien 110 Abb. 39: Infizierter muriner Peritonealmakrophage. 110 Abb. 40: Mikroskopische Aufnahmen von fixierten promastigoten Stadien des
Klons 1.G1 von LmxMPK5-/- +MPK5-eGFP 112
Abb. 41: Immunelektronenmikroskopische Aufnahme eines promastigoten
Stadiums des Klons 1.G1 von LmxMPK5-/-+MPK5+eGFP. 113
Abb. 42: Plasmidkarte von pX63HYG. 153
Abb. 43: Plasmidkarte von pX63polPACmpk5ds. 154
Abb. 44: Plasmidkarte von pX63polPHLEO. 155
Abb. 45: Plasmidkarte von pBSIImapkin14phleo. 156
Abb. 46: Plasmidkarte von pBNXlmpkegfp. 157
Abb. 47: Plasmidkarte von pSSU-int-lmpk-egfp-lmcpbds-pac. 158 Abb. 48: Plasmidkarte von pBSIImapkin14SI. 159
Abb. 49: Wachstumsverhalten des LmxWT, des Klons 1 von LmxMPK5-/- in
murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 1. 160 Abb. 50: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1 und 2 von
LmxMPK5-/- in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 2. . 161 Abb. 51: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von
LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 2. 162 Abb. 52: Wachstumsverhalten des LmxWT sowie der Klone 1.1 und 2.1 von
LmxMPK5-/re in murinen Peritonealmakrophagen, Experiment 3. 163
9.7 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Molekularbiologische Kits und ihre Hersteller. 40 Tabelle 2: Eingesetzte Plasmide und ihre Referenzen. 40 Tabelle 3: Oligonukleotide und ihre Sequenz. 41
Tabelle 4: Primärantikörper. 42
Tabelle 5: Sekundärantikörper. 43
Tabelle 6: Antibiotika für Leishmanien-Kulturen. 45
Tabelle 7: DNA-Größenstandard λ-DNA∆HindIII. 49 Tabelle 8: Bestandteile des Prestained Protein Markers, Broad Range. 62
Tabelle 9: Geräte. 145
Tabelle 10: Chemikalien und Reagenzien. 147
Tabelle 11: Puffer und Lösungen. 150
Danksagung
Meiner Mentorin Frau Prof. Dr. Astrid Tenter danke ich für ihren Rat bei der Anfertigung dieser Arbeit und für die Übernahme des Referats.
Ich danke Herrn Dr. Martin Wiese, dem Ideengeber für diese Arbeit, für seine engagierte Betreuung und Förderung.
Daniela Kuhn möchte ich für ihre hilfreichen Ratschläge, ihre Diskussionsbereitschaft und ihre gute Laune auch an schlechten Tagen danken sowie für die gelegentliche Pflege meiner Kulturen. Es war eine sehr gute Zusammenarbeit. Ebenso danke ich Stephani Tenbreuel für ihre unerschütterliche gute Laune und so manches aufmunternde Wort.
Weiterhin gilt mein Dank Anke Rüsbüldt und Frau Dr. Monika Bockholt-Homann für ihr Verständnis und ihre Unterstützung in den letzten Jahren.
Insbesondere danke ich Dr. Stefan Borsutzky für seine Geduld und sein Verständnis dafür, dass ich in den letzten Jahren so wenig freie Zeit hatte. Seine liebevolle Unterstützung hat wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.