Aus dem Institut für Parasitologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover und
dem Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg
In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung einer LmxMPK5-Deletionsmutante
von Leishmania mexicana
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Petra Wanders
aus Hamburg
Hannover, 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Astrid M. Tenter
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Astrid M. Tenter 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Bertram Brenig
Tag der mündlichen Prüfung: 4. Juni 2004
Inhalt
1 EINLEITUNG 7
1.1 Abkürzungsverzeichnis 8
2 LITERATURÜBERSICHT 12
2.1 Taxonomie 12
2.2 Entwicklungszyklus 12
2.3 Vorkommen und Verbreitung der Leishmaniose 15 2.4 Krankheitsbilder beim Menschen 18
2.4.1 Kutane Leishmaniose (KL) 18
2.4.2 Mukokutane Leishmaniose (MKL) 19
2.4.3 Viszerale Leishmaniose (VL) 19
2.5 Krankheitsbild beim Hund 20 2.6 Überblick über die Therapie der Leishmaniose beim Menschen 21 2.7 Signalübertragungswege in der Zelle 24
2.7.1 Die MAPK-Signalkaskade 26
2.7.2 Proteinkinasen und Proteinphosphorylierungen bei Trypanosomatiden 29 2.8 Genetik der Gattung Leishmania 33
3 MATERIAL UND METHODEN 39
3.1 Verbrauchsmaterial 39
3.2 Enzyme 39
3.3 Molekularbiologische Kits 39
3.4 Plasmide 40
3.5 Oligonukleotide 41
3.6 Antikörper 42
3.7 Kulturmedien und Zusätze 43
3.7.1 Medien für Escherichia coli 43
3.7.2 Medien für Leishmanien-Kulturen 44
3.7.3 Antibiotika 45
3.8 E.-coli-Bakterienstamm 45
3.9 Leishmanien 45
3.10 Versuchstiere 46
3.11 Kultivierung und Lagerung von Zellen 46
3.11.1 Kultivierung von E.-coli-Bakterien 46
3.11.2 Auszählung von Leishmanien 46
3.11.3 Kultivierung von L. mexicana 47
3.11.4 Transformation von promastigoten zu amastigoten Stadien in vitro 47
3.11.5 Leishmanien-Stabilate zur Langzeitlagerung 47 3.12 Molekularbiologische Methoden 48
3.12.1 Agarosegelelektrophorese von DNA 48
3.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 49
3.12.3 Isolierung genomischer DNA aus promastigoten Stadien von
L. mexicana 51
3.12.4 Phenol-Chloroform-Extraktion 51
3.12.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 52 3.12.6 Reaktionen mit DNA-modifizierenden Enzymen 53 3.12.7 In-vitro-Amplifizierung von DNA-Fragmenten durch PCR 54
3.12.8 DNA-Sequenzierung 55
3.12.9 DNA-Markierung mit DIG-Desoxyuridintriphosphat (dUTP) 56
3.12.10 Southern Blotting 57
3.12.11 Herstellung und Transformation kompetenter E. coli 59
3.12.12 Transfektion von Leishmanien 60
3.13 Analyse von Proteinen aus Leishmanien 61 3.13.1 Herstellung von Leishmanien-Lysaten 61
3.13.2 Diskontinuierliche SDS-PAGE 62
3.14 Mikroskopische Techniken 64 3.14.1 Immunfluoreszenszmikroskopie mit promastigoten Stadium 64
3.14.2 Histologie 65
3.14.3 Rasterelektronenmikroskopie (SEM) 65
3.14.4 Immunelektronenmikroskopie 66
3.15 Infektionsexperimente 66
3.15.1 Makrophageninfektion mit L. mexicana 66
3.15.2 Infektion von BALB/c-Mäusen 68
3.15.3 Isolierung von amastigoten Stadien aus der Maus 68
3.16 Datenverarbeitung 69
3.17 Statistische Auswertung 69
4 ERGEBNISSE 70
4.1 LmxMPK5-Expression im promastigoten Stadium 70 4.2 LmxMPK5-Expression im amastigoten Stadium 71 4.3 Der Phänotyp von LmxMPK5-/- 75
4.3.1 Morphologie 75
4.3.2 Wachstum promastigoter Stadien in vitro 78 4.3.3 Wachstum amastigoter Stadien in murinen Peritonealmakrophagen 79 4.3.4 Leishmanien-Infektion von BALB/c-Mäusen 85 4.4 Reintegration von LmxMPK5 in den ursprünglichen Genlokus 88
4.4.1 Promastigotenwachstum von LmxMPK5-/re 95 4.4.2 Wachstum amastigoter Stadien von LmxMPK5-/re in
Peritonealmakrophagen 97 4.4.3 Infektionsverlauf von LmxMPK5-/re im Mausmodell 100
4.5 Lokalisation von LmxMPK5 102
4.5.1 Klonierungsstrategie 103
4.5.2 Herstellung des LmxMPK5-eGFP-Konstruktes 104
4.5.3 Infektionsverlauf im Mausmodell 107
4.5.4 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung 109
4.5.5 Immunfluoreszenz 111
4.5.6 Immunelektronenmikroskopie 113
5 DISKUSSION 114
5.1 Expression von LmxMPK5 115 5.2 Morphologie und Differenzierung von LmxMPK5-/- 115 5.3 Wachstumsverhalten von LmxMPK5-/- 116 5.4 Die Infektiosität von LmxMPK5-/- für murine Makrophagen in vitro 118 5.5 Verhalten von LmxMPK5-/- im Mausmodell 118 5.6 Lokalisation von LmxMPK5 119
5.7 Ausblick 121
5.7.1.1 Potenzial von LmxMPK5-/- als attenuierter Lebendimpfstoff gegen
Leishmaniose 122 5.7.2 Potenzial der Kinaseinhibitoren als Therapie gegen Leishmaniose 123
6 ZUSAMMENFASSUNG 125
7 SUMMARY 127
8 LITERATURVERZEICHNIS 129
9 ANHANG 145
9.1 Geräte 145
9.2 Chemikalien und andere Reagenzien 147
9.3 Puffer und Lösungen 150
9.4 Plasmidkarten 153
9.5 Ergänzende Daten: Infektion von murinen Peritonealmakrophagen 160
9.6 Abbildungsverzeichnis 164
9.7 Tabellenverzeichnis 167
1 Einleitung
Die Infektion mit Protozoen der Gattung Leishmania, stellt eines der wichtigsten Gesundheitsprobleme in den Tropen und Subtropen dar. Weltweit wird die Zahl infizierter Menschen auf 12 Millionen geschätzt. Je nachdem, durch welche Leishmania-Art die Infektion verursacht wird, kommt es beim Menschen zu einem breiten Spektrum von Krankheitsbildern, von einer selbst heilenden kutanen Läsion bis hin zur letalen Infektion des gesamten retikulo-endothelialen Systems (RES).
Die derzeit verfügbaren Therapeutika sind in vielen Fällen nicht effizient und zuverlässig und besitzen starke Nebenwirkungen. Die Resistenzentwicklung schreitet immer schneller voran. Auf der Suche nach neuen Therapieansätzen wird die Unterbrechung von Signaltransduktionswegen der Parasiten diskutiert, um so seine Differenzierung und Proliferation im Wirtsorganismus zu stoppen. Dieser Ansatz wurde bereits bei der Therapie entzündlicher Erkrankungen oder bei Krebs erfolgreich verfolgt. Mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPK) stellen eine für Inhibitoren geeignete Zielstruktur dar, da sie Schlüsselelemente bei der Regulation der Differenzierung, der Proliferation, der Apoptose und der Stressantworten eukaryotischer Zellen sind. So können spezifische MAPK-Inhibitoren die Signaltransduktionskaskade unterbrechen und beispielsweise die Proliferation entarteter Zellen stoppen.
In Säugerzellen ist bereits eine große Anzahl von MAPKs identifiziert und charakterisiert worden. Dagegen ist über MAPKs in Leishmanien noch sehr wenig bekannt. Die erste in Leishmania mexicana identifizierte MAPK war LmxMPK1. Diese MAPK ist essenziell für die Proliferation und das Überleben des Parasiten in murinen Makrophagen und stellt somit eine potenzielle Zielstruktur für Inhibitoren dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle einer weiteren MAPK, LmxMPK5, anhand einer Doppeldeletionsmutante studiert. Das Wachstumsverhalten dieser Deletionsmutante wurde in den unterschiedlichen Entwicklungsstadien von L. mexicana in vitro verfolgt.
Der Einfluss der Deletion auf die Infektiosität des Parasiten wurde an murinen Makrophagen und im Mausmodell getestet. Schließlich wurden mikroskopische Studien zur zellulären Lokalisation von LmxMPK5 durchgeführt.
1.1 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung
AIDS erworbenes Immunschwächesyndrom
AP alkalische Phosphatase
APS Ammoniumperoxydisulfat ATP Adenosintriphosphat
BNI Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg bp Basenpaare
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CaBPs Ca2+-bindende Proteine
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat CDK2 cyklinabhängige Kinase 2
DABCO 1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan ddH2O Zwei Mal destilliertes Wasser
ddNTP Didesoxynukleosidtriphosphat DHFR-TS Dihydrofolatreduktase-Thymidylat-Synthase DIG Digoxigenin
DMEM Dulbecco`s Modification of Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat dUTP Desoxyuridintriphosphat
EGF Epidermiswachstumsfaktor eGFP optimiertes grünfluoreszierendes Protein ERK „extracellular signal-related kinase”
G/C Guanosin/ Cytosin
GFP grünfluoreszierendes Protein
gp63 Glykoprotein 63
G-Protein guanosintriphosphatbindendes Protein GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
HE Hematoxilin-Eosin
HIV humanes Immundefizienzvirus
HPLC-H2O in der High-Performance-Liquid-Chromatography gereinigtes Wasser
HRP Meerrettichperoxidase
HYG Gen der Hygromycin-Phosphotransferase iFCS inaktiviertes fötales Kälberserum
IR intergene Region
JNK „c-Jun N-terminal kinase“
kb Kilobasen kDa Kilodalton
kDNA Kinetoplasten-DNA
KL kutane Leishmaniose
LB Luria Bertani
Lmx Leishmania mexicana
LmxMPK5 Gen der mitogenaktivierten Proteinkinase 5 von Leishmania mexicana
LmxMPK5 Mitogenaktivierte Proteinkinase 5 von Leishmania mexicana LmxMPK5-/- Leishmania-mexicana-Doppeldeletionsmutante von MPK5 LmxWT Leishmania-mexicana-Wildtyp
LPG Lipophosphoglykan M Molar
MAPK Mitogenaktivierte Proteinkinase
MAPKAPK Mitogenaktivierte proteinkinaseaktivierte Proteinkinase MAPKK Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase
MAPKKK Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase-Kinase
MAPKP Mitogenaktivierte Proteinkinase-Phosphatase Mb Megabasen
med-RNA “mini exon derived”-RNA
MES 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure
MKL mukokutane Leishmaniose
mM Millimolar mRNA “messenger”-RNA ms Millisekunde
NEO Gen der Neomycin-Phosphotransferase
OD Optische Dichte
p. i. post infectionem
PAC Gen der Puromycinacetyltransferase PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerasekettenreaktion
PDE zyklisches Adenosinmonophosphat Phosphodiesterase PHLEO Phleomycin-Resistenzgen
PIK Phosphatidylinositol Kinasen
PIPLC Phospholipase C
PKA cAMP-abhängige Proteinkinase
pmol Pikomol
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid Ptdlns Phosphatidylinositol
PV parasitophore Vakuole
PVDF- Membran
Polyvinylidendifluorid-Membran
RES retikulo-endotheliales System RNA Ribonukleinsäure
s. u. siehe unten
SAP sekretierte saure Phosphatase SAPK „stress-activated protein kinase”
SDS Natriumdodecylsulfat s Sekunde
SEM Rasterelektronenmikroskopie
SH2 Src-Homologie Region
SL-RNA Spliced-Leader-RNA
SSC Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer ssu-rRNA kleine ribosomale Untereinheit
TAP-Tag Tandem-Afinity-Purification-Tag
TBE Tris-Borat- Ethylendiaminessigsäure
TbMAPK2 mitogenaktivierte Proteinkinase 2 von Trypanosoma brucei TE Tris-EDTA
TELT Tris-EDTA-Lithiumchlorid-Triton-Puffer TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TENS Tris-EDTA-NaOH-SDS-Puffer U Unit
Upm Umdrehungen pro Minute UV ultraviolett V Volt
VL viszerale Leishmaniose
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung z. B. zum Beispiel
2 Literaturübersicht
2.1 Taxonomie
Cunningham (1885) entdeckte als erster Leishmanien. Sie wurden nach Leishman (1901) benannt, der zusammen mit Donovan (1903) die Parasiten näher beschrieb (HANDMAN 2000). Die Leishmanien gehören zur Klasse der Kinetoplastea, die zusammen mit der Klasse der Euglenoidea zum Stamm der Euglenozoa zusammengefasst werden (LEEDALE und VICKERMAN 2000, S. 1135). Diese Zuordnung beruht auf dem Besitz eines Kinetoplasten, einem Bereich dichtgepackter DNA an der Basis ihres Flagellums (VICKERMAN 2000, S. 1159). Die Kinetoplastea lassen sich in zwei Ordungen unterteilen, die Bodonida und die Trypanosomatida.
Zur Ordnung der Bodonida gehört die Familie der Bodonidae mit überwiegend frei lebenden Flagellaten, die zwei charakteristische heterodynamische Flagellen besitzen. Der Ordnung der Trypanosomatida gehört die Familie der Trypanosomatidae an. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um parasitische Kinetoplastiden, die nur ein Flagellum besitzen. Die Familie der Trypanosomatidae umfasst elf Gattungen, von denen die Gattungen Trypanosoma und Leishmania für Wirbeltiere gefährliche Parasiten darstellen (VICKERMAN 2000, S. 1159). Der Gattung Leishmania gehört eine wachsende Zahl von derzeit ca. 30 Arten an (ASHFORD 2000).
2.2 Entwicklungszyklus
Die Leishmanien werden durch Schmetterlingsmücken der Familie der Psychodidae der Gattung Phlebotomus in der Alten Welt und der Gattung Lutzomyia in der Neuen Welt auf Wirbeltiere übertragen. Die weibliche Schmetterlingsmücke nimmt während einer Blutmahlzeit an einem infizierten Menschen oder Tier Leishmanien auf. Alle Leishmania-Arten weisen einen heteroxenen Entwicklungszyklus auf (Abb. 1). So werden das amastigote, intrazellulär im Säuger lebende Stadium und die promastigoten Stadien, die sich in der Schmetterlingsmücke befinden, unterschieden.
Im Mitteldarm der Schmetterlingsmücke wird die Blutmahlzeit von einer sackähnlichen, vom Darmepithel sezernierten, peritrophen Membran umschlossen (KILLICK-KENDRICK 1990). In dieser neuen Umgebung kommt es zur
Transformation der unbeweglichen amastigoten in die bewegliche, flagellentragende promastigote Form (SACKS 1989). Diese wird auf Grund ihrer Teilungsfähigkeit als prozyklische promastigote Form bezeichnet. Die spindelförmigen promastigoten Stadien sind 8-20 µm lang und 2-3,5 µm breit. Der Kinetoplast liegt im vorderen Teil der Zelle, wo sich auch die Basis des ca. 20 µm langen Flagellums befindet. Durch Zweiteilung kommt es nun zu einer Massenvermehrung. Nach 3 Tagen wird die peritrophe Membran durch die Chitinasesekretion der promastigoten Stadien aufgelöst (SCHLEIN et al. 1991). Sie wandern in den vorderen Teil des Mitteldarms und zur Kardia (SCHLEIN 1993). Dort teilen sie sich weiterhin und heften sich mit ihrer Geißel hemidesmosomenbildend zwischen die Mikrovilli des Darmepithels.
Später befallen einige auch den Ösophagus und den Pharynx, wo sie sich ebenfalls mit ihrem Flagellum verankern (LANG et al. 1991, SCHLEIN 1993). An der Oberfläche besitzen die Promastigoten eine dicke Glykokalix aus Lipophosphoglykan (LPG), dessen Kohlenhydratmodifikationen stadienspezifisch reguliert werden. Die Glykokalix schützt vor einer Hydrolyse im Darm, ist an der Verankerung an der Darmwand beteiligt und verhindert so, dass die Parasiten ausgeschieden werden (SCHLEIN 1993, PIMENTA et al. 1994). Die angehefte, promastigote Form definierte WALTERS (1993) unabhängig von ihrem Aussehen als haptomonade Form, wohingegen er die freischwimmenden promastigoten Stadien als nectomonade Form bezeichnete. Die promastigoten Stadien sezernieren Proteophosphoglykane, welche lange Filamente bilden. Diese Filamente verkleben die große Zahl der promastigoten Stadien miteinander und verstopfen den Verdauungstrakt der Schmetterlingsmücke, was ebenfalls ein Ausscheiden der Parasiten verhindert (HANDMAN 2000). Am 5.-8.
Tag p. i. differenzieren die Parasiten zu teilungsunfähigen Promastigoten. Diese werden als metazyklische, für den Säuger infektiöse promastigote Form bezeichnet.
Die Metazyklogenese wird von ultrastrukturellen und biochemischen Veränderungen hauptsächlich an der Oberfläche der promastigoten Stadien begleitet. Die Glykokalix verdickt sich. Auf Grund des veränderten LPGs können die Leishmanien nicht mehr am Darmepithel binden und wandern in die vorderen Darmabschnitte, um wieder inokkulativ übertragen zu werden. Über den Speichel und durch Regurgitation des Mageninhaltes gelangen sie bei einer Blutmahlzeit der Schmetterlingsmücke in die Stichwunde des Wirtsorganismus. Die promastigoten Stadien werden über rezeptorvermittelte Phagozytose von den Makrophagen des Wirtes aufgenommen.
Hierbei spielen vor allem die Komplementrezeptoren 1 und 3 an der
Makrophagenoberfläche eine wichtige Rolle (ROSENTHAL et al. 1996). Die Promastigoten werden in membranständigen Phagosomen aufgenommen. Diese fusionieren mit sekundären Lysosomen zu Phagolysosomen, der so genannten parasitophoren Vakuole (PV) (CHANG 1983). Je nach Leishmania-Art unterscheiden sich die Größe und die Form der Vakuolen. Während es bei L. mexicana und Leishmania amazonensis zur Bildung großer PVs kommt, welche viele peripher dicht an die Vakuolenmembran gedrängte amastigote Stadien enthalten, werden bei Leishmania major und Leishmania donovani PVs gebildet, die nur jeweils einen Parasiten enthalten. Die PVs mit einem pH 4,7-5,2 sind reich an mikrobiziden Peptiden und hydrolytischen Enzymen (ANTOINE et al. 1998). In dieser neuen Umgebung transformieren die promastigoten zu obligat intrazellulär lebenden amastigoten Stadien. Dieser Prozess nimmt ca. 2-5 Tage in Anspruch. Die Leishmanien werden kleiner und runden sich ab. Ihr Kinetoplast wird stabförmig. Sie besitzen einen Durchmesser von 2-4 µm. Das Flagellum verkürzt sich erheblich und liegt in der Flagellartasche verborgen, sodass es lichtmikroskopisch nicht mehr sichtbar ist. Die amastigoten Stadien vermehren sich ebenfalls durch Zweiteilung. Die durch die Lysis der Makrophagen frei werdenden Parasiten befallen weitere Makrophagen. Dabei kann es zum Befall des gesamten retikulo-endothelialen Systems kommen, sodass der Erreger relativ kurzzeitig nach dem Stich nicht mehr in der Haut nachzuweisen ist.
Abb. 1: Schematische Darstellung des Lebenszyklus der Leishmanien (modifiziert nach HANDMAN 2001)
2.3 Vorkommen und Verbreitung der Leishmaniose
Bei den meisten Leishmaniosen handelt es sich um Zoonosen. Die Erreger besitzen eine große Bandbreite an Reservoir-Wirten: Reservoire für die kutane Leishmaniose (KL) sind vorwiegend Nager und andere Kleinsäuger. Für die viszerale Leishmaniose (VL) stellen Hunde das Hauptreservoir dar, aber auch andere Kaniden, wie Füchse und Schakale sind Reservoire (MILES et al. 1999). Eine wichtige Ausnahme von dem zoonotischen Charakter der Leishmaniose sind die durch Leishmania tropica
ausgelöste KL des Mittleren Ostens und die durch Angehörige des L.-donovani- Komplexes verursachte VL Indiens, bei denen infizierte Menschen das Haupterregerreservoir darstellen. Das Verbreitungsgebiet der Leishmaniose wird durch den Lebensraum ihrer Vektoren, der Schmetterlingsmücken, bestimmt.
Weltweit wird die Zahl der mit Leishmanien infizierten Menschen auf 12 Millionen geschätzt. Die Leishmaniose tritt in Gebieten mit warmem, subtropischem oder tropischem Klima auf. Mit Ausnahme von Australien und Südostasien sind 88 Länder aller Kontinente betroffen (ANKER und SCHAAF 2000, S. 121). Es sind weltweit etwa 350 Millionen Menschen gefährdet. Die Zahl der jährlichen Neuinfektionen wird auf ca. 1,5-2 Millionen geschätzt. In den Ländern Bangladesh, Brasilien, Indien, Nepal, Afghanistan und Sudan befinden sich 90 % aller VL-Fälle. In Afghanistan, Brasilien, Iran, Peru, Saudi Arabien und Syrien treten 90 % aller KL-Fälle auf. Auch 16 europäische Länder, hauptsächlich mit mediterranen Regionen, sind von Leishmania-Infektionen betroffen, u. a. Frankreich, Spanien, Italien und Griechenland. Die Verbreitung der häufigsten Leishmanioseformen des Menschen wird in Abb. 2 dargestellt.
VL KL/MKL VL + KL/MKL VL
KL/MKL VL + KL/MKL
Abb. 2: Geographische Verbreitung der VL, der KL und der mukokutanen Leishmaniose (MKL) (verändert nach HANDMAN 2001)
In den letzten 20-30 Jahren ist es zu einem starken Anstieg der Anzahl der Leishmania-Infektionen gekommen, und dieser Trend scheint nicht abzureißen. Dies
liegt auch an den verbesserten diagnostischen Möglichkeiten, dennoch scheint die Anzahl der Infektionen zuzunehmen (REITHINGER und DAVIES 2002). Seit 1993 haben sich die endemischen Regionen signifikant ausgedehnt, begleitet von einem starken Anstieg der Neuinfektionen (WHO 2000). Einige wichtige Gründe dafür sind (i) die massiven Bevölkerungswanderungen, z. B. in Form einer Abwanderung der Landbevölkerung in die Städte oder durch Agrarindustrialisierungsprojekte, die nicht immune Stadtbewohner in endemische ländliche Gebiete bringen; (ii) die Rodung der Wälder; (iii) die Adaptation des Entwicklungszyklus der Leishmanien an peridomestizierte Reservoir-Wirte; (iv) fehlende Kampagnien zur Kontrolle der Vektoren und der Reservoir-Wirte; (v) das gleichzeitige Auftreten der Leishmaniose mit einer Infektion durch das humane Immunschwächevirus (HIV) und (vi) die Resistenzentwicklung gegenüber zahlreichen Therapeutika (REITHINGER und DAVIES 2002).
Es wurde auch von VL-Epidemien in ursprünglich endemischen Gebieten wie Äthiopien, Eritrea und Sudan berichtet, wo es auf Grund von Krieg und Hungersnöten zu massiven Flüchtlingsströmen kam (MCGREGOR 1998). Ähnliches wird jetzt in Krisengebieten wie Afghanistan und Pakistan beobachtet (REITHINGER und DAVIES 2002).
Die Infektionen mit der ursprünglich ausschließlich sylvatischen Spezies Leishmania braziliensis im Nordosten Brasiliens verzehnfachte sich in einem Zeitraum von 10 Jahren, in dem gleichzeitig eine massive Rodung des Regenwaldes für Ackerbau und Siedlungen betrieben wurde. Studien zeigen, dass dieser Trend von neuen Infektionen bei (peri-)domestizierten Tieren begleitet wurde (REITHINGER und DAVIES 2002).
Co-Infektionen mit Leishmanien und HIV nahmen in den letzten 10 Jahren drastisch zu und werden laut der WHO noch weiter ansteigen (ANKER und SCHAAF 2000, S. 127). Durch das Vorrücken der Pandemie des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) in ländliche Gebiete und die gleichzeitige Ausbreitung der Leishmaniose auf urbane und suburbane Regionen werden diese Co-Infektionen nicht länger auf endemische Gebiete beschränkt sein. Es besteht das Risiko, dass co-infizierte Patienten besonders in anthroponotischen Gebieten wie
Bangladesch, Indien, Nepal und Ost-Afrika zum Haupterregerreservoir für Leishmanien werden, da sie eine besonders hohe Anzahl von Parasiten beherbergen. Hier liegt in Zukunft ein wachsendes Risiko für Epidemien (WHO 2000). Auch nach einer klinisch erfolgreichen Behandlung persistieren Parasiten in einigen Organen co-infizierter Patienten (PAREDES et al. 2003). In Südeuropa sind 70 % aller an VL erkrankten Erwachsenen auch mit HIV infiziert, und ca. 9 % aller AIDS-Patienten leiden an VL (REITHINGER und DAVIES 2002). Neben der Pneumozystikose, der Toxoplasmose und der Kryptosporidiose ist die VL die vierthäufigste opportunistische parasitäre Erkrankung bei HIV-positiven Menschen in Spanien (MONTALBAN et al. 1990, PAREDES et al. 2003).
2.4 Krankheitsbilder beim Menschen
Klinisch werden drei Hauptformen der Leishmaniose unterschieden. Ihre Ausprägung ist abhängig von der Leishmania-Art und vom Immunstatus des Patienten (ALVAR 1999).
2.4.1 Kutane Leishmaniose (KL)
Die KL, eine auch als „Orient-Beule“ bekannte Erkrankung, ist die häufigste Form der Leishmaniose. Sie wird in der Regel durch Infektionen mit L. tropica, L. major und Leishmania aethiopica hervorgerufen (ASHFORD 2000). Nach dem Stich einer infizierten Schmetterlingsmücke kommt es nach einer Inkubationszeit von 1-12 Wochen zur Bildung einer erythematösen Papel, die weiter an Größe zunimmt und ulzeriert. Das typische, nicht schmerzhafte Ulkus mit einem indurierten, wallförmigen Rand und einer nekrotischen Basis ist teilweise mit Exsudat bedeckt (LEE und HASBUN 2003). Häufig kommt es zu schmerzhaften Sekundärinfektionen. Die meisten Patienten besitzen ein bis zwei Läsionen an exponierten Stellen wie am Kopf und an den Extremitäten (HEPBURN 2003). In der Regel heilen die Läsionen spontan ab, wobei es zu einer stark entstellenden Narbenbildung kommen kann. Die meisten der durch L. mexicana und L. major verursachten Läsionen heilen nach 6 Monaten. Durch L. tropica verursachte Läsionen heilen dagegen erst nach ca. 10 Monaten. Anschließend kommt es zur Immunität gegenüber Reinfektionen mit derselben Leishmania-Art (HEPBURN 2003). In 10 % der Fälle nehmen die
Erkrankungen einen chronischen Verlauf mit einer inkompletten Abheilung. Die KL Südamerikas, auch als „Chiclero-Ulkus“ bezeichnet, wird durch Erreger des L.- mexicana-Komplexes ausgelöst. Diese Infektionen führen hauptsächlich an der Ohrmuschel und im Gesicht zu einer Ulkusbildung. Sie tritt vorwiegend bei Kautschuksammlern („Chicleros“) und Waldarbeitern auf. Die diffuse kutane Leishmaniose (DKL) kann durch L. aethiopica und von Erregern aus dem L.- mexicana-Komplex hervorgerufen werden. Sie ist eine gravierendere Form der KL, bei der es zur Bildung multipler, diffus über den Körper verteilter Ulzera kommt. Eine spontane Abheilung bleibt aus. Diese Form tritt vorwiegend bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem auf.
2.4.2 Mukokutane Leishmaniose (MKL)
Die ausschließlich in Mittel- und Südamerika auftretende MKL, dort als “Espundia”
bezeichnet, wird durch Erreger des L.-braziliensis-Komplexes hervorgerufen. Es kommt zu papulo-ulzerösen Läsionen im Gesicht mit Zerstörung der Haut, der Muskulatur und des Knorpels im Mund-Nasen-Rachen-Raum. Es besteht nur eine geringe Heilungstendenz.
2.4.3 Viszerale Leishmaniose (VL)
Erreger der VL, auch unter dem Namen “Kala-Azar” bekannt, sind die Arten des L.- donovani- und des Leishmania-infantum-Komplexes. Diese Erkrankung ist hauptsächlich in Asien (Indien), Afrika, im Mittelmeerraum und in Mittel- und Südamerika verbreitet und betrifft vorwiegend Kinder und immunsupprimierte Menschen. So können auch Infektionen mit normalerweise dermotropen Arten, wie L.
mexicana, Leishmania braziliensis und Leishmania amazonensis zu VL bei HIV- Infizierten führen (PAREDES et al. 2003). Die VL ist die schwerwiegenste Form der Leishmaniose und führt beim Ausbleiben einer Behandlung innerhalb von 6-24 Monaten zum Tode. Im Gegensatz zur lokal begrenzten KL kommt es zum Befall des gesamten RES. Die Erreger vermehren sich hauptsächlich in der Leber, der Milz, dem Knochenmark und in den Lymphknoten. Bei dieser subakut bis chronisch verlaufenden Allgemeininfektion kommt es zu unregelmäßigen Fieberschüben, Gewichtsverlust, Hepato- und Splenomegalie, schwerer hypochromer Anämie und
zur Leuko- und Thrombozytopenie. Nach einer Therapie und Genesung der VL kann sich ein dermales Leishmanoid, eine chronische KL, mit diffusen kleinknotigen oder verrukösen Hautveränderungen entwickeln (WILSON und STREIT 1996).
Die Inkubationszeit kann sich über Monate bis Jahre erstrecken und erst beim Auftreten einer Immunsuppression ausbrechen. Gleichzeitig mit HIV infizierte Patienten entwickeln sehr schnell das klinische Bild einer VL. Außerdem setzt bei einer Co-Infektion der Beginn von AIDS sehr früh ein, was die Lebenserwartung von HIV-Infizierten erheblich verkürzt (WHO 2000).
2.5 Krankheitsbild beim Hund
Die Leishmaniose des Hundes kann je nach Abwehrlage eine sehr lange Inkubationszeit von 4 Wochen bis zu 7 Jahren besitzen (MORITZ 2001). Bis zu 15 % der Hunde in den Mittelmeerländern weisen einen positiven Antikörpertiter auf, jedoch ca. 80 % dieser seropositiven Tiere zeigen keine klinischen Symptome (NOLI 1999). Diese Tatsache erschwert die Erkennung betroffener Tiere, die somit ein nicht identifizierbares Erregerreservoir darstellen, was die Kontrolle der Ausbreitung der Leishmaniose des Menschen erschwert. Darüber hinaus zeigte ein Screening mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine Prävalenz seronegativer Hunde von 80 % (24 aus 30 Tieren) in Südfrankreich (BERRAHAL et al. 1996).
Beim Hund handelt es sich immer um eine generalisierte Erkrankung (ROMMEL 1992, S. 519). Da die Erreger grundsätzlich das gesamte RES befallen, entspricht sie der VL des Menschen. Anhand der Symptomatik werden jedoch klinisch viszerale und kutane Formen unterschieden (MORITZ et al. 2001). Bei bis zu 89 % der erkrankten Hunde treten Hautveränderungen in Form einer trockenen, exfoliativen Dermatitis mit hochgradiger Schuppenbildung, aber auch als ulzerative Hautläsionen besonders an den Ohrrändern, der Nase und den Pfoten auf. Eine periorbitale Alopezie wird gelegentlich beobachtet. Dabei scheint der Schweregrad der Hautveränderungen von der Abwehrlage des infizierten Tieres abhängig zu sein (FERRER et al. 1988). Die Erkrankung kann von remittierenden Fieberschüben begleitet werden. Es kommt mit ihrem Fortschreiten zur Kachexie. Eine Hepato- und Splenomegalie sowie eine generalisierte Hyperplasie der Lymphknoten
kennzeichnen die fortgeschrittene Erkrankung. Die Veränderungen des Blutbildes entsprechen denen der VL des Menschen. Die Hyperproteinämie ist gekennzeichnet durch eine Hypergammaglobulinämie, welche Ausdruck einer überschießenden Bildung von Immunglobulinen im Zusammenhang mit einer B-Zellstimulation ist. Sie führt zu Immunkomplexablagerungen in verschiedenen Organen und in vielen Fällen zur Glomerulonephritis. Nephropathien stellen die häufigste Todesursache bei an Leishmaniose erkrankten Hunden dar (MORITZ et al. 2001).
2.6 Überblick über die Therapie der Leishmaniose beim Menschen
Zum ersten Mal wurde 1913 über die Therapie der KL und 1915 über die der VL mit trivalenten Antimon-Verbindungen berichtet (CROFT und YARDLEY 2002). Die Entwicklung weniger toxischer pentavalenter Antimon-Verbindungen führte 1945 zu der Synthese von Natrium-Stiboglukonat (Pentostam, Glaxo-Smith-Kline, USA) und wenig später zu der von N-Methylglukamin-Antimonat (Glucantime, Aventis, Frankreich). Der Wirkungsmechanismus der Antimon-Verbindungen ist bis heute nicht vollständig geklärt. So werden eine partielle Hemmung der Adenosindiphosphat-Phosphorylierung in der Glykolyse oder eine Hemmung der β- Oxidation von Fettsäuren des Parasiten vermutet (BERMAN et al. 1985, BERMAN 1989). Die Nebenwirkungen dieser Therapien sind groß. Es kommt zu Übelkeit, Anorexie, Myalgie und Gelenkschmerzen, häufig begleitet von einer transienten Panzytopenie, einer Pankreatitis und Herzrhythmusstörungen. Es kann zur chronischen Schädigung der Leber kommen (LEE et al. 2003). Die pentavalenten Antimon-Verbindungen stellten für sechs Jahrzehnte das Mittel der Wahl zur Therapie der KL und der VL dar. Über 20-28 Tage werden täglich 20 mg Antimon/kg Körpergewicht intravenös verabreicht. Häufig wird diese Therapie kombiniert mit der oralen Gabe von Allopurinol, einem Pyrazolopyrimidin, das durch die Hemmung der Purin- und Pyrimidinsynthese in die DNA-Replikation der Leishmanien eingreift (BERMAN 2003, MARTINEZ et al. 1997). Diese Kombinationstherapie ist besonders bei der Behandlung der Leishmaniose des Hundes von Interesse, wo sie signifikant bessere Ergebnisse als eine alleinige Therapie mit Antimon-Verbindungen erzielt (DENEROLLE und BOURDOISEAU 1999). Diese klassische Behandlungsmethode führt auf Grund immer weiter zunehmender Resistenzen in der Therapie der VL des Menschen nur noch bei 37 % der Patienten in Indien zur Heilung (DAVIES et al.
2003). Nach der Behandlung von mit Leishmanien und HIV co-infizierten Patienten kommt es in der Regel zum Rückfall (WHO 2000). Frühe noch nicht entzündliche Läsionen der KL können lokal behandelt werden, indem sie alle 2 Tage bis zu ihrer Abheilung unterspritzt werden, was die Nebenwirkungen minimiert (HEPBURN 2003). Die Wirksamkeit dieser Therapie der KL ist sehr unterschiedlich. Bei der KL durch L. braziliensis schwanken die Angaben über Heilungserfolge zwischen 30 und 60 % (MACHADO et al. 2002), bei Infektionen mit L. major sprachen 70-85 % der Patienten auf die Therapie an (MOMENI et al. 2002).
Amphothericin B ist sehr potent bei der Therapie der VL mit Heilungsraten von 97 %.
Durch seine Bindung von Ergosterol, dem dominierenden Plasmamembran-Sterol der Leishmanien kommt es zur Porenbildung in der Zellmembran des Parasiten.
Amphothericin B ist stark kardio- und nephrotoxisch. Die intravenöse Injektion von einer Lipid-Verbindung des Amphothericin B (AmBisome, Gilead Sciences) ist weniger toxisch und ist das Mittel der Wahl bei antimonresistenten Infektionen (SUNDAR et al. 2002). Jedoch handelt es sich um eine sehr teure Therapie und ist daher in Entwicklungsländern nur schlecht praktikabel. In der Therapie der KL zeigt Amphothericin B keinen deutlichen Effekt (BERMAN 1997).
Parenteral verabreichtes Pentamidin, ein aromatisches Diamidin, wurde seit 1952 alternativ bei antimonresistenten Fällen der VL und KL eingesetzt (THAKUR et al.
1991) und ist das Mittel der Wahl bei der Behandlung der DKL durch L. aethiopica (CROFT und YARDLEY 2002). Limitiert wird sein Einsatz durch eine Nephrotoxizität und das häufige Auftreten von Tachykardie, Hypoglykämie und Diabetes. Häufig wird es in Kombination mit Antimon oder Allopurinol verwendet. Der Heilungserfolg durch Pentamidin kombiniert mit Allopurinol liegt in Studien bei 91 % und als Monotherapie bei nur 74 % (DAS et al. 2001).
Die Heilungserfolge der VL durch die parenterale Gabe des Aminoglykosid- Antibiotikums Paromomycin liegt bei 69-89 % (THAKUR et al. 2000). Die Kombination mit Antimon-Verbindungen scheint einen synergistischen Effekt zu haben. Eine topische Anwendung von Paromomycin in Salben zur Behandlung der KL der Alten Welt führte bei 74 % der Patienten zu einer Heilung (ASILIAN et al.
2003), bei der KL Südamerikas lag die Heilungsrate bei 85 % (ARANA et al. 2001).
Aminoglykoside besitzen eine Nephro- und Ototoxizität.
Die lokale Hitzeanwendung in Form von Mikrowellen brachte in der Behandlung einzelner noch nicht ulzerierter Läsionen der KL Heilungserfolge zwischen 73 % und 90 %. Bei der Cryotherapie, z. B. mit flüssigem Stickstoff, schwanken die Heilungserfolge zwischen nur 27 % und 68 %. In Kombination mit lokalen Antimon- Injektionen lagen sie jedoch bei fast 100 % (LEE und HASBUN 2003).
Ein neues topisches Therapeutikum der KL ist der Immunmodulator Imiquimod, der ursprünglich zur Behandlung von Genitalwarzen entwickelt wurde. Er wirkt über den Toll-like-Rezeptor 7 und aktiviert unspezifisch das Immunsystem (TAKEDA et al.
2003). In Südamerika erbrachte er in Kombination mit lokalen Antimon-Injektionen Heilungserfolge von 90 % bei Patienten, die zuvor auf eine alleinige Therapie mit Antimonverbindungen nicht ansprachen (AREVALO et al. 2001).
Azole inhibieren die Sterol-Synthese des Parasiten. Die orale Gabe von Fluconazol, über 6 Wochen bei durch L. major verursachter KL führt zu einem Heilungserfolg von 59 % (ALRAJHI et al. 2002). Die Gabe von Ketokonazol hat einen ähnlichen Erfolg.
Die Wirksamkeit von Ketokonazol bei KL durch L. major liegt bei 70 % (WEINRAUCH et al.1987) und in einer neueren Studie bei 89 % (SALMANPOUR et al. 2001). Bei der durch L. mexicana verursachten KL Südamerikas sind ähnliche Erfolge zu verzeichnen (NAVIN et al. 1992), dagegen liegt der Heilungserfolg bei Infektionen mit L. tropica, L. aethiopica und L. braziliensis mit ca. 30 % weit darunter (WEINRAUCH et al.1987, NAVIN et al. 1992).
Miltefosine, ein Alkylphosphocholin, das ursprünglich zur Brustkrebstherapie entwickelt worden ist, greift in den Lipidstoffwechsel des Parasiten ein. 2002 wurde es als orales, über 3-4 Wochen zu verabreichendes Therapeutikum der VL in Indien zugelassen. In Studien zeigte es einen Heilungserfolg von 94 % (SUNDAR et al.
2002). Auch in der Therapie der KL zeigte sich derselbe Erfolg (SOTO et al. 2001).
Begleitet wird die Anwendung von Übelkeit und Diarrhöe, die wenige Tage anhält.
Jedoch gibt es Hinweise auf eine Resistenzentwicklung bei L. donovani gegen Miltefosine (PEREZ-VICTORIA et al. 2003). Die Rückfallrate bei gleichzeitig mit HIV
infizierten Patienten liegt bei 60 % (CLIVE et al. 2003). Dies entspricht auch den Erfahrungen mit anderen bei der HIV-Co-Infektion angewandten Therapien. Um einen klinischen und einen Parasiten dezimierenden Effekt zu erreichen, müssen die Behandlungen länger als gewöhnlich andauern. Die Nebenwirkungen bei den Standardtherapien sind bei mit HIV und Leishmanien co-infizierten Patienten noch gravierender. Es sprechen 60 % der Patienten klinisch auf eine Therapie an, jedoch kommt es bei 25-60 % innerhalb eines Jahres zu einem Rückfall (PARADES et al.
2003).
Dieser Überblick über die verfügbaren Therapeutika zeigt, dass bis zum heutigen Zeitpunkt keine effiziente und zuverlässige Therapie der Leishmaniose existiert. Des Weiteren kommt es zu einer zunehmenden Resistenzentwicklung gegen die bisherigen Standardtherapeutika. Fast alle bisher verwendeten Pharmaka besitzen starke Nebenwirkungen. Daraus ergibt sich ein dringender Bedarf an neuen Therapieansätzen. Das neue Therapeutikum sollte möglichst oral zu verabreichen sein, da diese Darreichungsform keinen großen Aufwand an Hygiene und speziell ausgebildetem medizinischem Personal erfordert. Des Weiteren ist eine kurze Therapiedauer wünschenswert. Es sollte eine kostengünstige Therapie sein, um sie auch in den Entwicklungsländern standardmäßig und großflächig einsetzen zu können.
2.7 Signalübertragungswege in der Zelle
Zellen können sehr empfindlich auf Signale aus ihrer Umgebung reagieren. Dies ermöglicht es Einzellern und vielzelligen Organismen, sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Ein differenziertes System zum Informationsaustausch zwischen einzelnen Zellen macht es dem vielzelligen Organismus möglich, jeder einzelnen Zelle bestimmte Funktionen zuzuweisen und ihr Verhalten aufeinander abzustimmen. Schon lange vor dem Auftreten der ersten Vielzeller hatten Einzeller Mechanismen entwickelt, die es einer einzelnen Zelle ermöglichen, das Verhalten einer anderen Zelle zu beeinflussen. So können sich einzellige Eukaryoten wie Hefen gegenseitig die Vorbereitung zur Konjugation signalisieren. Die Aufnahme und Verarbeitung von Reizen in Zellen erfolgt über Signalkaskaden. Diese molekularen Schaltkreise der Zellen werden aus Rezeptoren an der Zelloberfläche, Ionen-
Kanälen, intrazellulären Rezeptorproteinen und regulatorischen Proteinen gebildet.
Diese sind in der Lage, Umweltreize wahrzunehmen, zu verstärken und zu integrieren. In eukaryotischen Zellen wurde ein weit reichendes Netz zur Signalverarbeitung gefunden, dessen Erforschung noch andauert.
Am Anfang steht die Bindung extrazellulärer Signalmoleküle wie z. B. Hormone, Zytokine oder Neurotransmitter an intra- oder extrazelluläre Rezeptoren und deren nachfolgende Aktivierung. Hydrophobe Moleküle wie die Steroidhormone durchqueren die Zellmembran und binden im Zytoplasma an spezifische Rezeptoren.
Diese Hormon-Rezeptor-Komplexe wandern in den Zellkern, wo sie an bestimmte Nukleotid-Sequenzen, so genannte „hormone response elements“, binden und die Transkription bestimmter Gene induzieren oder reprimieren. Hydrophile Hormone wie das Adrenalin, ein von Tyrosin abgeleitetes Katecholamin, oder das Peptidhormon Glukagon können die lipophile Zellmembran nicht passieren. Sie binden an in die Zellmembran integrierte Rezeptoren, die daraufhin ihre Raumstruktur auf der Innenseite der Membran verändern, was ein neues Signal auslöst.
Es werden drei Gruppen von Zelloberflächen-Rezeptoren unterschieden: (i) ionenkanalgekoppelte Rezeptoren, (ii) 7-Helix-Rezeptoren und (iii) katalytische Rezeptoren oder enzymgekoppelte Rezeptoren.
Ionenkanalgekoppelte Rezeptoren dienen der schnellen Signalübertragung im synaptischen Spalt der Neurone. Diese Rezeptoren sind oligomere Membranproteine, die einen ligandengesteuerten Ionenkanal bilden. Durch die Bindung von Neurotransmittern kommt es zum kurzfristigen Öffnen oder Schließen von Kanälen in der synaptischen Membran. Die Folge ist eine Ionenkonzentrationsveränderung über die Membran, welche die Erregbarkeit der Zelle innerhalb kürzester Zeit verändert.
7-Helix-Rezeptoren leiten äußere hormonelle oder sensorische Signale ins Zellinnere weiter. Hierbei handelt es sich um integrale Membranproteine, wie z. B. den β- adrenergen Rezeptor des Adrenalins. Diese sind über sieben α-Helices in der Zellmembran verankert. Der Hormon-Rezeptor-Komplex stimuliert das Guanosintriphosphat (GTP)-bindende Protein (G-Protein) an der Innenseite der
Zytoplasmamembran. Dieses leitet wiederum das Signal über Second-Messenger wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) oder nachgeschaltete Effektorproteine weiter.
Bei den enzymgekoppelten Rezeptoren oder den Rezeptoren mit eigener katalytischer Aktivität handelt es sich meistens um Proteinkinasen, die in der Zielzelle spezifische membranständige und zytosolische Proteine in einer Kaskade phosphorylieren und so das Signal zum Zellkern weiterleiten. Die Rezeptor- Tyrosinkinasen, z. B. der Insulin-Rezeptor oder der des Epidermiswachstumsfaktors (EGF), gehören zu dieser Gruppe, auf die im Folgenden näher eingegangen wird.
2.7.1 Die MAPK-Signalkaskade
Ein weit verzweigtes Netz aus Proteinkinase-Kaskaden und anderen Signaltransduktionswegen sorgt für die Reaktion der Zelle auf äußere Einflüsse, den interzellulären Informationsaustausch und die Koordination der Antworten der Zelle.
MAPKs gehören zu den Schlüsselelementen bei der Regulation der Differenzierung, der Proliferation, der Apoptose und den Stressantworten eukaryotischer Zellen (KYRIAKIS et al. 2001). Weiterhin spielen MAPK-Signaltransduktionswege eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler entzündlicher Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis, der Psoriasis oder der Inflammatory Bowel Disease (HOMMES et al. 2003). Die Weiterleitung von Signalen durch die MAPK-Kaskade erfolgt durch Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen (Abb. 3). Nach der Bindung von spezifischen Liganden an Rezeptoren der Zelloberfläche kommt es zur Phosphorylierung einer MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK), die wiederum eine MAP-Kinase-Kinase (MAPKK) aktiviert. MAPKs werden durch für sie hochspezifische MAPKKs phosphoryliert und phosphorylieren anschließend wiederum unterschiedliche Ziele wie Transkriptionsfaktoren oder MAPK-aktivierte Proteinkinasen (MAPKAPKs). Die MAPKs können durch mehrere MAPK- Phosphatasen (MAPKPs) dephosphoryliert und inaktiviert werden. Jede MAPK besitzt ihre spezifischen MAPKKs, MAPKAPKs und MAPKPs. Im Gegensatz dazu können MAPKKs durch mehr als eine MAPKKK aktiviert werden, was die Komplexizität und Diversität der MAPK-Signalkaskade noch weiter erhöht. Vermutlich spricht jede MAPKKK auf einen ganz bestimmten Stimulus an.
Stimuli: z. B. Zytokine,
Wachstumsfaktoren, Stressfaktoren
Zytoplasma MAPKKK
inaktiv
MAPKKK aktiv
MAPKK inaktiv
MAPKK aktiv
MAPK inaktiv
MAPK aktiv P
P
P
P
Zellkern
Stimuli: z. B. Zytokine,
Wachstumsfaktoren, Stressfaktoren
Zytoplasma MAPKKK
inaktiv
MAPKKK aktiv
MAPKK inaktiv
MAPKK aktiv MAPKK
inaktiv
MAPKK aktiv
MAPK inaktiv
MAPK aktiv MAPK
inaktiv
MAPK aktiv P
P
P
P
Zellkern
Abb. 3: Schematische Darstellung der MAPK-Signalkaskade. Verschiedene extrazelluläre Stimuli können nach einer Rezeptor-Ligand-Interaktion die Familie der MAPKs aktivieren. Diese aktivieren sich untereinander durch das Anhängen von Phosphatgruppen an Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Reste (modifiziert nach HOMMES et al. 2003).
Es werden bisher vier Gruppen in der MAPK-Familie der Säuger unterschieden: die
„extracellular signal-related kinases“ (ERK)-1/2, p38 Proteine (p38α/β/γ/δ), „c-Jun N- terminal kinases/ stress-activated protein kinases“ (JNK/SAPK)-1/2/3 und die ERK-5 (TANOUE und NISHIDA 2003). Die ERK-1/2 werden hauptsächlich durch mitogene Stimuli aktiviert, wohingegen p38 und JNK/SAPK überwiegend durch Stressreize oder inflammatorische Zytokine aktiviert werden. Die ERK-5 wird durch EGF, den neuronalen Wachstumsfaktor und durch osmotischen oder oxidativen Stress aktiviert.
Es sind bereits 22 Proteine gefunden worden, die zur Familie der MAPKs der Säuger gehören (PEARSON et al. 2001). Sie werden durch Phosphorylierung ihrer Threonin-
und Tyrosin-Reste des gemeinsamen Threonin-X-Tyrosin-Motivs aktiviert (PEARSON et al. 2001). Typisch für MAPKs ist die Phosphorylierung ihrer Substrate an Serin- oder Threonin-Resten vor einem Prolin-Rest. Die dreidimensionale Struktur der MAPKs besteht aus zwei Domänen. Die NH2-terminale kleinere Domäne wird aus den Subdomänen I-IV gebildet, liegt hauptsächlich in einer antiparallelen β- Faltblatt-Struktur vor und ist primär an der Bindung und Orientierung der Nukleotid- Substrate in Form von Adenosintriphosphat (ATP) oder GTP beteiligt. Die größere COOH-terminale Domäne besteht aus den Subdomänen VI-XI und ist überwiegend α-helikal. Sie ist verantwortlich für die Bindung der Peptidsubstrate und veranlasst den Phosphat-Transfer. Die beiden Domänen werden durch die Subdomäne V miteinander verbunden. Die tiefe Furche zwischen beiden Domänen stellt das katalytische Zentrum dar (PEARSON et al. 2001). MAPKs besitzen charakteristische Aminosäuresequenzen, besonders Reste in den Subdomänen VIb und VIII sind hoch konserviert (KÜLTZ 1998).
Abb. 4: Unphosphorylierte Struktur von ERK-2. ATP bindet im katalytischen Zentrum im Inneren der tiefen Furche zwischen beiden Domänen. Substrate binden an der Oberfläche der Furche. Die MAPK-Aktivität wird durch die Phosphorylierung eines Tyrosin(185)- und eines Threonin(183)-Restes reguliert, die sich an der so genannten Aktivierungslippe befinden (PEARSON et al. 2001).
In den letzten 10 Jahren wurden bei höheren Eukaryoten große Fortschritte in der Aufklärung der Verbindungen einzelner Signaltransduktionsschritte untereinander erreicht. Dies wurde durch die große Anzahl schon klonierter Gene und durch spezifische Antikörper möglich. MAPK-spezifische Inhibitoren, die mit essenziellen regulatorischen Prozessen der Zellen interferieren, wurden bereits gefunden (LEE et al. 1994, WILSON et al. 1997). Sie könnten potenzielle Therapeutika gegen Krankheiten wie den durch die Dysregulation der Zelldifferenzierung und Proliferation verursachten Krebs oder gegen bereits oben erwähnte entzündliche Erkrankungen darstellen. Ein MAPK-Inhibitor gegen die erhöhte ERK-Aktivität im Kolon-Karzinom hemmt das Tumorwachstum in der Maus und befindet sich zurzeit in klinischen Studien der Phase I (SEBOLT-LEOPOLD et al. 1999). In einer Pilotstudie an Morbus- Crohn-Patienten erwies sich ein MAPK-Inhibitor als potenter Entzündungshemmer, der die Phosphorylierung sowohl von p38 als auch von JNK inhibiert (HOMMES et al.
2002).
2.7.2 Proteinkinasen und Proteinphosphorylierungen bei Trypanosomatiden Im heteroxen Entwicklungszyklus der Leishmanien sind die Parasiten einer grundlegenden Veränderung ihrer Umgebung unterworfen, auf die sie mit einem Gestaltwechsel reagieren (siehe 2.2). Des Weiteren gehen sie im Verlauf ihrer Entwicklung im promastigoten Stadium von der teilungsfähigen prozyklischen in die nicht teilungsfähige metazyklische Form über. Diese Komplexizität ihres Lebenszyklus setzt große Veränderungen in ihrer Genexpression voraus. Die Registrierung von Reizen wie Temperatur- und pH-Wert-Änderungen der Umgebung und die koordinierte Antwort darauf werden wie bei anderen Eukaryoten über Signaltransduktionswege weitergeleitet und verarbeitet. In den Trypanosomatiden wurden Gene entdeckt, die Genen in höheren Eukaryoten ähneln und die für Moleküle kodieren, die an der Signaltransduktion beteiligt sind (Abb. 5). So fand man adenylatcyclasehomologe Rezeptoren bei L. donovani (SANCHEZ et al. 1995).
Jedoch gibt es bei den Trypanosomatiden keinen Hinweis darauf, dass bei der Aktivierung der Adenylatcyclasen trimere G-Proteine wie bei den höheren Eukaryoten beteiligt sind (PARSON und RUBEN 2000). cAMP ist ein allosterischer Effektor von Proteinkinasen A. Gene, die für PKA-homologe Moleküle kodieren, wurden bereits identifiziert (PARSON und RUBEN 2000). Der Abbau des cAMPs wird
durch Phosphodiesterasen katalysiert. Weitere Moleküle wie das cAMP, die mit extrazellulären Liganden interagieren, sind bisher nicht bekannt. Trypanosomatiden besitzen wie höhere Eukaryoten Mechanismen zur Produktion und Terminierung Ca2+-Ionen-vermittelter Signale. In Trypanosoma brucei werden Ca2+-Ionen im Kern gespeichert (XIONG und RUBEN 1998). Weiterhin besitzen sie drei verschiedene Zellkompartimente, die energieabhängig Ca2+-Ionen transportieren: das Mitochondrium, die Zytoplasmamembran und die Azidokalzisomen (ZILBERSTEIN 1993). Außerdem besitzen die Trypanosomatiden eine Reihe von Ca2+-bindenden Proteinen (CaBPs), u. a. Calmodulin, welche die Ca2+-Wirkung vermitteln (FLAWIÀ et al. 1997). Des Weiteren spielen einige Inositolphosphate und Phosphatidylinositolphosphate als „second messengers“ eine wichtige Rolle (PARSONS und RUBEN 2000).
Kern 7-Helix- Rezeptoren
trimere G-Proteine
Rezeptoren
Rezeptor-Kinasen PH
Domänen PIPLC
PIK PtdIns
InsP
Adenylat- cyclase
PKA cAMP
PDE
Phosphoproteine lösliche Kinasen CaBPs
intrazellulärer Ca2+
Speicher Ca2+
Ca2+- Kanäle
Transkriptions- Faktoren
Phosphatasen katalytische
Rezeptoren
Ras
SH2-, SH3- Domänen
Kern 7-Helix- Rezeptoren
trimere G-Proteine
Rezeptoren
Rezeptor-Kinasen PH
Domänen PIPLC
PIK PtdIns
InsP
Adenylat- cyclase
PKA cAMP
PDE
Phosphoproteine lösliche Kinasen CaBPs
intrazellulärer Ca2+
Speicher Ca2+
Ca2+- Kanäle
Transkriptions- Faktoren
Phosphatasen katalytische
Rezeptoren
Ras
SH2-, SH3- Domänen
Abb. 5: Vereinfachte, schematische Übersicht der Signalwege der eukaryotischen Zelle. Viele der in Säugerzellen vorkommenden Komponenten und Verbindungen konnten bisher noch nicht bei den Trypanosomatiden identifiziert werden. PDE: cAMP-Phosphodiesterase; PIK:
Phosphatidylinositol-Kinasen; PIPLC: Phospholipase C; PKA: cAMP- abhängige Proteinkinase; Ptdlns: Phosphatidylinositol; SH2: Src-Homologie- Region 2. Unterbrochene Linien/schwarzer Hintergrund: fehlende Interaktionen/Komponenten; durchgezogene Linien/weißer Hintergrund:
bekannte Interaktionen/Komponenten. (verändert nach PARSONS und RUBEN 2000)
Es wurden zahlreiche Unterschiede in den Proteinphosphorylierungsmustern und in den Proteinkinase-Aktivitäten während der unterschiedlichen Entwicklungsstadien festgestellt (DELL und ENGEL 1994, SAAR et al. 1998). So sind bei den Trypanosomatiden cyklinabhängige-Kinase 2 (CDK2)-ähnliche Kinasen bekannt. Es gelang, fünf dieser cyclinabhängigen Kinasen in T. brucei zu identifizieren
(HAMMARTON et al. 2000). Des Weiteren wurden in T. brucei zwei funktionelle Cycline gefunden (HELLEMOND et al. 2000). In Leishmanien wurden bisher drei homologe cyclinabhängiger Kinasen entdeckt (MOTTRAM et al. 1993, GRANT et al.
1998, WIESE et al. 2003). Die Entdeckung von MAPK-homologen Proteinen macht einen solchen Signaltransduktionsmechanismus auch bei den Trypanosomatiden wahrscheinlich. Es wurde bereits ein MAPK-homologes Potein von HUA und WANG (1994) in T. brucei beschrieben. Etwas später gelang die Klonierung eines MAPK- homologen Proteins, LmxMPK1, aus L. mexicana (WIESE 1998). Die Übereinstimmung der Aminosäure-Sequenz dieser MAPK mit einer MAPK in L.
braziliensis liegt bei 94,5 % und in L. amazonensis bei 98,7 % (WIESE und GÖRCKE 2001). Mittels degenerierter Oligonukleotid-Primer, die für hochkonservierte Regionen in zwei katalytischen Domänen kodieren, wurde das L. mexicana-Genom auf weitere MAPK-homologe DNA-Sequenzen mittels PCR untersucht. So konnten die Gene acht weiterer MAPK-homologer Proteine kloniert und sequenziert werden, die jeweils als eine Kopie im haploiden Genom von L. mexicana vorliegen (WIESE et al. 2003b). Auch diese MAPKs weisen eine große Ähnlichkeit der Aminosäure- Sequenz zu anderen Leishmania-Arten auf. Zu dieser Gruppe gehört LmxMPK5. Die Länge seines offenen Leserasters beträgt 1158 bp. Das Protein besteht aus 386 Aminosäuren und besitzt ein kalkuliertes Molekulargewicht von 43,9 kDa. Für eine genauere Klassifizierung der neun MAPK-homologen Proteine in L. mexicana wurden ihre Aminosäuresequenzen mit kinasespezifischen Sequenzen verglichen (KÜLTZ 1998). Sie gehören alle der Gruppe der ERKs an (WIESE et al. 2003b). Da bereits fünf Homologe im Genom von T. brucei identifiziert wurden, ist zu erwarten, dass alle MAPK-Homologe in Leishmania auch in Trypanosoma zu finden sind. So existiert eine zur LmxMPK4 homologe MAPK2 in T. brucei (TbMAPK2), von der über Deletionsanalyse gezeigt wurde, dass sie an der Regulation der Differenzierung von der im Blutstrom des Säugers lebenden Form zur prozyklischen Form beteiligt ist (MÜLLER et al. 2002). Die Interaktionspartner der bereits gefundenen MAPKs sind bisher nicht bekannt.
Die Deletion der gefundenen MAPKs und die Identifikation kinasespezifischer Aminosäuren und Sequenzmotive ermöglicht die Herstellung von Mutanten zur Untersuchung der Funktion dieser Moleküle. So wurde eine MAPKK bei Leishmania chagasi gefunden (LI et al. 1996), deren homologes Protein bei L. mexicana einen
Einfluss auf die Flagellenlänge der promastigoten Stadien besitzt (WIESE et al.
2003a). Über die Deletionsanalyse können in Protozoen potenzielle Zielstrukturen gefunden werden, deren Hemmung durch Therapeutika die Signaltransduktionskaskade unterbricht und so die Proliferation oder die Differenzierung der Parasiten stoppt. In L. mexicana wurde auf diese Weise mit LmxMPK1 bereits eine mögliche Zielstruktur gefunden (WIESE 1998). Diese MAPK ist essenziell für die Proliferation und das Überleben der amastigoten Stadien in murinen Makrophagen. Ob auch LmxMPK5 einen Einfluss auf die Proliferation oder die Differenzierung nimmt, soll durch die Charakterisierung des Phänotyps der Doppeldeletionsmutante, LmxMPK5-/-, gezeigt werden.
2.8 Genetik der Gattung Leishmania
Das Genom umfasst je nach Leishmania-Art ungefähr 3,5-5 x 107 bp pro haploidem Genom, organisiert in 34-36 Chromosomen (GESSNER et al. 1994, S. 29) mit ca.
10000 Genen (CLAYTON 2002). Da die Leishmanien-Chromosomen während der mitotischen Zellteilung nicht kondensieren, konnten sie bisher ausschließlich in der Pulsfeldgelelektrophorese sichtbar gemacht werden. So konnten für L. infantum 36 Chromosomen mit einer Größe zwischen 0,35-3,0 x 106 bp und eine Größe des gesamten Genoms von 3,55 x 107 bp identifizert werden (WINCKER et al. 1996). Die Analyse des L.-mexicana-Komplexes ergab die Anzahl von 34 Chromosomen im Genom (BRITTO et al. 1998). Allerdings unterliegt das Leishmania-Genom einer ständigen Variabilität seiner Chromosomenanzahl und -größe (BASTIEN et al. 1992).
Obwohl homologe Chromosomen sich in der Größe beträchtlich unterscheiden können, basiert dies meistens auf der Anzahl tandemartig angeordneter, repetitiver Gene oder auf repetitiven nicht kodierenden Sequenzen (CLAYTON 2002). Unter Antibiotikaselektionsdruck, bei nutritivem Stress oder auch spontan kann es jedoch zur Entstehung von so genannten Multicopy-Minichromosomen als Resultat einer Amplifikation genomischer Sequenzen kommen (BEVERLEY 1991, SEGOVIA 1994).
Diese extrachromosomale DNA kann ca. 5-10 % der gesamten zellulären DNA umfassen. Es werden zirkuläre und lineare Minichromosomen unterschieden. Ihr molekularer Entstehungsmechanismus ist bis heute nicht geklärt. Da amplifizierte Genloki häufig flankierende repetitive direkte oder invertierte Sequenzen aufweisen, kann daraus geschlossen werden, dass die Amplifikation möglicherweise durch
homologe intramolekulare Rekombination erzielt wird. Unter experimentellen Bedingungen kann durch Antibiotikaselektionsdruck die Entstehung linearer Minichromosomen provoziert werden. Wird die Antibiotikakonzentration erhöht, kommt es zur Bildung zirkulärer Minichromosomen. Daher wird angenommen, dass die linearen Minichromosomen die Vorstufen extrachromosomaler DNA-Circles sind (OLMO et al. 1995 und GRONDIN et al. 1998).
Es gibt Hinweise darauf, dass Leishmanien zwei Chromosomensätze, also ein diploides Genom, besitzen. Man konnte jedoch im Gegensatz zum gut dokumentierten sexuellen Genaustausch von T. brucei bis heute nicht klären, ob Mechanismen hierzu auch bei den Leishmanien existieren. Genetische Rekombination (TAYLOR et al. 1994) und die Tatsache, dass für die Herstellung einer Null-Mutante (Gen-Knock-out) einiger Gene in Leishmanien zwei Transfektionsschritte zur Inaktivierung beider Allele notwendig sind (CRUZ et al.
1991, DESCOTEAUX et al. 1995, WIESE et al. 1995), stützen die Hypothese, dass es sich um ein diploides Genom handelt.
Außer der chromosomalen DNA des Nukleus besitzen die Kinetoplastiden die dicht gepackte Kinetoplasten-DNA (kDNA). Dabei handelt es sich um die DNA des einzigen Mitochondriums der Zelle. Ihr Anteil an der Gesamt-DNA beträgt 10-15 %.
Sie besteht aus so genannten Mini- und Maxi-Circles, welche im Gegensatz zur chromosomalen DNA weder Histone besitzen noch eine Supercoiling-Struktur aufweisen. Jede Zelle besitzt ca. 25-50 Maxi-Circles mit einer Größe von 20-40 kb.
Diese kodieren für mitochondriale Gene sowie für die Guide-RNA (s. u.). Den 5000- 10000 Mini-Circles mit einer Größe von 0,5-2,8 kb konnte neben der Kodierung für die Guide-RNA bisher keine weitere Funktion zugeordnet werden.
Die Organisation und Expression der Gene von Leishmania sind sehr heterogen im Vergleich zu höheren Eukaryoten. Gene können einzeln, gepaart oder in Gruppen, so genannten Genklustern, angeordnet sein. Sie können sich auch vielfach tandemartig wiederholen. Das Genom ist mit einem Anteil von 58-60 % sehr Guanosin/Cytosin (G/C)-reich im Gegensatz zu T. brucei mit einem G/C-Gehalt von 51 %, wobei die kodierenden Regionen einen höheren G/C-Gehalt haben als die nicht kodierenden (ALONSO et al. 1992). Das Genom enthält kurze, repetitive DNA-
Sequenzmotive, wie sie bei den meisten Eukaryoten üblich sind. Diese sind tandemartig angeordnet und überall in den nicht proteinkodierenden Sequenzen verstreut oder charakterisieren die Chromosomenenden in telomerassoziierten Sequenzen. Es wurde eine hoch repetitive Komponente, die 12 % des L.-donovani- Genoms einnimmt, identifiziert (LEON et al. 1978). Zusätzlich zu intergenen repetitiven Sequenzen besitzen Protozoen viele Proteine mit repetitiven Aminosäure- Domänen, welche starke Antikörper-Antworten auslösen können. Ein Unterbrechen der proteinkodierenden Sequenzen durch Introns und der Mechanismus des Cis- Spleißens wurde bis jetzt nicht in Leishmania-Genen beobachtet. Allerdings konnten Introns im Gen der Poly-A-Polymerase von T. brucei und Trypanosoma cruzi nachgeweisen werden (MAIR et al. 2000).
Auch bei der Regulation der Genexpression bestehen erhebliche Unterschiede zu höheren Eukaryoten. Die Regulation scheint posttranskriptional auf der Ebene der RNA-Prozessierung oder der Ebene der Translation und der Proteinstabilität zu liegen (PARSONS und RUBEN 2000). Bei der Transkription der proteinkodierenden Gene wird polycistronische „messenger“-RNA (mRNA) synthetisiert, wobei die Gene verschieden stark exprimiert werden können. Eine Regulation der Expression auf der Ebene der Transkription spielt anscheinend bei den Leishmanien eine untergeordnete Rolle. Es konnten bisher nur wenige potenzielle Transkriptionsfaktoren und wenige von Eukaryonten bekannte Promotoren identifiziert werden (CLAYTON 2002). So wurden Promotoren der RNA-Polymerasen I und III bei T. brucei identifiziert (LAUFER und GÜNZL 2001, NAKAAR et al. 1997).
Für die RNA-Polymerase II konnte bisher noch keine entsprechende Promotorregion in den Kinetoplastiden nachgewiesen werden.
Posttranskriptionale Mechanismen wie das Trans-Spleißen und die Polyadenylierung der Primärtranskripte zur reifen mRNA regulieren im Wesentlichen die Genexpression bei den Leishmanien. Eine wichtige Rolle spielen außerdem die Stabilität und der Abbau der prä-mRNA und mRNA. Beim Trans-Spleißen werden zwei unabhängig voneinander transkribierte RNA-Stränge miteinander verknüpft (Abb. 6). Die prä-mRNA-Moleküle werden an ihrem 5`-Ende mit einer 39 bp langen Miniexonsequenz versehen (NILSEN 1995). Diese besitzt an ihrem 5`-Ende eine cap-Struktur in Form eines 7-Methylguanosin-Restes, sowie weitere methylierte
Nukleotide an Position 1-4 und 6 (STURM et al. 1999). Diese Miniexonsequenz, auch Spliced-Leader-RNA (SL-RNA) genannt, stammt von dem 5`-Ende einer 140 bp umfassenden „mini exon derived“-RNA (med-RNA). Die SL-RNA wird an einem separaten Genlokus kodiert, wo sie in ca. 150 Kopien tandemartig angeordnet ist und sequenzabhängig in drei Klassen eingeteilt wird (MILLER et al. 1986). Ihre Sequenzen sind in allen Leishmania-Arten hoch konserviert. Gleichzeitig ist an den Vorgang des Trans-Spleißens die Polyadenylierung des 3`-Terminus der prä-mRNA gekoppelt, wodurch eine monocistronische mRNA entsteht.
3‘ med-RNA 140 bp
Primärtranskript AAA ..
AAA .. prä-mRNA 5‘ cap 5‘
AAA .. 3‘
mRNA Miniexon
DNA
Transkription Transkription
proteinkodierendes Gen
SL-RNA
5‘ cap
3‘ med-RNA 140 bp
Primärtranskript AAA ..
AAA .. prä-mRNA 5‘ cap 5‘
AAA .. 3‘
mRNA Miniexon
DNA
Transkription Transkription
proteinkodierendes Gen proteinkodierendes Gen
SL-RNA
5‘ cap
Abb. 6: RNA-Prozessierung durch das Trans-Spleißen und die Polyadenylierung bei Leishmanien
Die Guide-RNA hat beim RNA-Editing der Transkripte der mitochondrialen DNA eine entscheidende Funktion (BENNE 1994). Durch Deletion oder Insertion von Uridinbasen an definierten Stellen im Transkript wird die ursprüngliche Sequenz posttranskriptional modifiziert, sodass erst hierdurch das funktionelle offene Leseraster zur Translation entsteht. Die Guide-RNA dient dabei als Vorlage für das in 3`-5`-Richtung ablaufende Editing. Sie besteht aus einer zur prä-mRNA komplementären 4-18 bp langen Ankersequenz, einem die neue Sequenzinformation enthaltenden Bereich aus mindestens 40 bp und einer abschließenden 5-24 bp langen Oligouridin-Region.
Zur funktionellen Untersuchung von bestimmten Genen in Kinetoplastiden stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung (CLAYTON 1999). So ist es seit einiger Zeit möglich, eine stabile Transfektion durchzuführen, wobei das zu untersuchende Gen gezielt in zwei Transfektionsschritten durch homologe Rekombination mit zwei verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen deletiert werden kann. Für eine erfolgreiche homologe Rekombination muss ein lineares Konstrukt aus der stromaufwärts (5’)-
„untranslated region“ (UTR), dem Resistenzgen und der stromabwärts (3’)-UTR erstellt werden, wobei die UTRs die flankierenden Regionen des zu deletierenden Gens sind. Dieses Konstrukt wird dann durch Elektroporation in die promastigoten Stadien eingeschleust. So gelang die erste komplette Deletion des Gens der Dihydrofolatreduktase-Thymidylat-Synthase (DHFR-TS) in L. major (CRUZ et al.
1991). Durch die Deletion von MAPKs und der damit verbundenen Unterbrechung ihrer Signalkaskade kann Aufschluss über ihre Funktion gewonnen und untersucht werden, ob sie eine potenzielle Zielstruktur für Therapieansätze darstellen (WIESE 1998). Mit dieser Methode wurde auch LmxMPK5 in L. mexicana auf beiden Allelen durch die homologe Rekombination mit dem Gen der Hygromycin- Phosphotransferase (HYG) und mit dem der Neomycin-Phosphotransferase (NEO) deletiert (Abb. 7).
MPK5Allel 2 MPK5Allel 1
NEO Wildtyp (+/+)
NEO
HYG MPK5Allel 2 Einzelallel-Deletion (+/-)
NEO HYG Doppelallel-Deletion (-/-)
MPK5Allel 2 MPK5Allel 1
NEO Wildtyp (+/+)
NEO
HYG MPK5Allel 2 Einzelallel-Deletion (+/-)
NEO HYG Doppelallel-Deletion (-/-)
Abb. 7: Deletion von LmxMPK5. Durch homologe Rekombination mit dem Gen der Hygromycin-Phosphotransferase (HYG) oder mit dem der Neomycin- Phosphotransferase (NEO) wurde LmxMPK5 deletiert.
3 Material und Methoden
Die Herstellerangaben und Bezugsquellen der verwendeten Geräte, Chemikalien und Reagenzien sowie die Zusammensetzungen der eingesetzten Lösungen und Puffer befinden sich im Anhang unter 9.2 bzw. 9.3.
3.1 Verbrauchsmaterial
Verbrauchsmaterial wie sterile Plastikmaterialien wurden von den Firmen Greiner- Bio-One GmbH, Frickenhausen, und Eppendorf AG, Hamburg, bezogen. Für die Zellkultur wurden Zellkulturflaschen der Firma Nunc, Wiesbaden, verwendet.
Hersteller von speziellen Materialien, die in den verschiedenen Methoden verwendet wurden, werden bei ihrer ersten Erwähnung in den einzelnen Abschnitten genannt.
3.2 Enzyme
Alle verwendeten Restriktionsendonukleasen stammten von New England Biolabs GmbH, Frankfurt. Sie wurden mit den vom Hersteller mitgelieferten Puffern eingesetzt. Ligationen wurden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Roche Diagnostics, Mannheim) im entsprechenden Puffer durchgeführt. Für die PCR wurde das Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics, Mannheim) mit dem dazugehörigen 10x PCR-Puffer mit MgCl2 verwendet.
3.3 Molekularbiologische Kits
Die verwendeten molekularbiologischen Kits und ihre Hersteller befinden sich in der Tabelle 1.
Tabelle 1: Molekularbiologische Kits und ihre Hersteller.
Kitbezeichnung Hersteller PCR DIG Probe Synthesis Kit Roche Diagnostics, Mannheim
ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Qiagen Plasmid Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen GmbH, Hilden QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit PE Biosystems, USA
3.4 Plasmide
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die in der Tabelle 2 aufgeführten Plasmidkonstrukte verwendet: Die Plasmidkarten wurden mit dem Plasmid Artist von Gensystems Computersoftware, Solana Beach, USA, erstellt und befinden sich im Anhang unter 9.4 (siehe S. 155-161).
Tabelle 2: Eingesetzte Plasmide und ihre Referenzen.
Plasmid Referenz Plasmidkarte
pX63HYG CRUZ et al. 1991 Abb. 42
pX63polPACmpk5ds M. Wiese, BNI1 Abb. 43
pX63polPHLEO WIESE 1998 Abb. 44
pBSIImapkin14phleo M. Wiese, BNI Abb. 45
pBNXlmpkegfp M. Wiese, BNI Abb. 46
pSSU-int-lmpk-egfp-lmcpbds-pac M. Wiese, BNI Abb. 47 pBSIImapkin14SI M. Wiese, BNI Abb. 48
1 Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, Hamburg
3.5 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen in Karlsruhe hergestellt.
Tabelle 3: Oligonukleotide und ihre Sequenz.
Oligonukleotid Sequenz
px63-HYG05 5`- CTAGTCATGAAAAAGCCTG –3`
px63-HYG06 5`- CGGCAGCTAGCCTATTCCTTTGCCC –3`
vmpk5XhoI.for 5`- CCGCTCGAGAATATGACGTCCAAAGCA –3`
mpk5NcoI.rev 5`- CATGCCATGGCCTTTTTGTAGTACTGCAC –3`
mpk5_1.for 5`- ATGCCATGCAGAGACCATT –3`
