4.3.1 Morphologie
Es wurde untersucht, ob die Deletion von LmxMPK5 die Morphologie der Leishmanien im promastigoten Stadium beeinflusst. Hierzu wurden Leishmanien aus der logarithmischen Wachstumsphase einer Kultur promastigoter Stadien entnommen und im Phasenkontrastmikroskop und Rasterelektronenmikroskop betrachtet. Die promastigoten Stadien von LmxWT und LmxMPK5-/- unterschieden sich in der Phasenkontrastmikroskopie und in der SEM morphologisch nicht.
Abb. 14: Vergleichende Phasenkontrastmikroskopie promastigoter Stadien.
LmxWT (A) und der Klon 1 von LmxMPK5-/- (B). Die Länge des Balkens entspricht 10 µm.
Abb. 15: Vergleichende SEM von promastigoten Stadien. LmxWT (A) und der Klon 1 von LmxMPK5-/- (B). Die Länge des Balkens entspricht 10 µm.
4.3.2 Wachstum promastigoter Stadien in vitro
Um die Auswirkungen der LmxMPK5-Deletion auf das Wachstumsverhalten zu untersuchen, wurden Kulturen mit promastigoten Stadien angeimpft und über 3 Tage alle 24 h gezählt. Das Wachstum in vitro von zwei LmxMPK5-/- Klonen wurde mit dem Wachstum von LmxWT verglichen (Abb. 16).
Tage nach Versuchsbeginn
0 1 2 3
Leishmanien/ml (+/- Standardabweichung)
106 107 108
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1
LmxMPK5-/-, Klon 2
*
Abb. 16: Das Promastigotenwachstum in vitro von LmxWT und LmxMPK5-/-.
Promastigotenkulturen wurden mit 106 Leishmanien/ml angeimpft (Triplikate).
Dargestellt sind die Mittelwerte mit deren Standardabweichungen über die Zeit; (*) zeigt die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen LmxWT und den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- (P=0,0007 bzw. P=0,0005).
Die Zählung ergab einen signifikanten Unterschied zwischen dem LmxWT und den Deletionsmutanten von LmxMPK5. Der LmxWT teilte sich schneller und erreichte eine höhere Kulturdichte von ca. 6 x 107 Leishmanien/ml am 3. Tag. Dagegen wurde in den Kulturen der Deletionsmutanten eine maximale Dichte von 3 x 107 Leishmanien/ml am 3. Tag gemessen. Daraus kann geschlossen werden, dass die
vollständige Deletion von LmxMPK5 die Teilung promastigoter Stadien in vitro verlangsamte und damit ihr Wachstum beeinflusste.
4.3.3 Wachstum amastigoter Stadien in murinen Peritonealmakrophagen
Um das Wachstum amastigoter Stadien in vitro zu untersuchen, wurden Peritonealmakrophagen aus BALB/c-Mäusen isoliert und im Verhältnis von 1:2 (Makrophagen/Leishmanien) mit LmxWT oder den Klonen 1 und 2 der Doppeldeletionsmutante infiziert. Am 1., 3., 5. und 7. Tag p. i. wurde jeweils eine Probe genommen, fixiert und mit DAPI gefärbt. Bei der DAPI-Färbung handelt es sich um einen DNA-Farbstoff, der sowohl die Makrophagen-DNA (großer Pfeil) als auch die Leishmanien-DNA des Zellkerns und des Kinetoplasten (kleine Pfeile) anfärbt (siehe Abb. 17). Mit dieser Methode konnte die Parasitenlast einzelner Makrophagen bestimmt werden.
Abb. 17: Murine Peritonealmakrophagen 24 h p. i.. (A) fluoreszenz-mikroskopische (461 nm) und (B) phasenkontrastfluoreszenz-mikroskopische Aufnahme 24 h p. i. muriner Peritonealmakrophagen mit LmxWT. Fixierung mit 2%igem Paraformaldehyd in PBS und anschließende DAPI-Färbung. Der große Pfeil zeigt den Nukleus eines Makrophagen, während die kleinen Pfeile auf die Kerne der amastigoten Stadien hinweisen. Der Balken entspricht 10 µm.
Abb. 18: Murine Peritonealmakrophagen 7 Tage p. i.. (A) fluores-zenzmikroskopische (461 nm) und (B) phasenkontrastmikroskopische Aufnahme 7 Tage nach Infektion muriner Peritonealmakrophagen mit LmxWT. Fixierung mit 2%igem Paraformaldehyd in PBS und anschließende DAPI-Färbung. Der Balken entspricht 10 µm.
In Abb. 17A und Abb. 18A wird die DAPI-Färbung von Peritonealmakrophagen am 1. bzw. 7. Tagen nach Infektion mit LmxWT gezeigt. Beim Vergleich zwischen dem 1. und 7. Tag p. i. wurde die Vermehrung der Leishmanien in den Makrophagen deutlich. Um dieses Wachstumsverhalten zu quantifizieren, wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie die Anzahl der Leishmanien in jeweils 100 Makrophagen bestimmt. Der Versuch wurde drei Mal durchgeführt.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7
Leishmanien/Makrophage
0 5 10 15 20 25 30
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2
*
Abb. 19: Wachstum amastigoter Stadien in vitro. Durchschnittliche Parasitenlast aus 200-300 randomisiert gezählten Makrophagen über 7 Tage;
(*) der Unterschied zwischen LmxWT und dem Klon 1 bzw. 2 von LmxMPK5-/- ist statistisch signifikant nach dem Studenten-t-Test (P=1,7 x 10-7 bzw. P=3,5 x 10-12).
Wie in Abb. 19 dargestellt, stieg die Anzahl der Leishmanien in den infizierten Makrophagen in allen Proben stetig an. Während sich in Makrophagen nach 7 Tagen p. i. durchschnittlich 25 amastigote Stadien des LmxWT befanden, wurden nach der gleichen Zeit ca. 12 des Klon 1 der Doppeldeletionsmutante und 13 des Klons 2
gezählt. Die signifikante Reduktion der Parasitenlast durch die Doppeldeletion von LmxMPK5 demonstrierte, dass LmxMPK5 das Wachstum amastigoter Stadien in Makrophagen in vitro beeinflusste.
Im Folgenden wurde die Verteilung der Leishmanien in den Makrophagen näher untersucht. Entsprechend ihrer Parasitenlast wurden die Makrophagen in folgende Gruppen eingeteilt: 1-10, 11-20, 21-30 und >30 Leishmanien pro Makrophage. In Abb. 20 wird beispielhaft eines der drei durchgeführten Experimente dargestellt. Die Ergebnisse der beiden anderen Experimente werden im Anhang unter 9.5 gezeigt.
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Tage p. i.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Anteil (%) der Makrophagen mit unterschiedlicher Parasitenlast 0 Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Makrophagen ohne Lmx Makrophagen mit 1-10 Lmx Makrophagen mit 11- 20 Lmx Makrophagen mit 21- 30 Lmx Makrophagen mit > 30 Lmx
Abb. 20: Wachstumsverhalten von LmxWT sowie den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- in murinen Peritonealmakrophagen. Die infizierten Makrophagen (n = 100) wurden entsprechend der Anzahl der Leishmanien in folgende Gruppen zusammengefasst: keine, 1-10, 11-20, 21-30 und >30 L. mexicana (Lmx) pro Makrophage. Die Diagramme zeigen, wie viele Makrophagen (%) zur jeweiligen Gruppe im Verlauf der Infektion gehörten.
Die Verteilung der Makrophagen nach LmxWT-Infektion zeigte, dass der Anteil nicht infizierter Makrophagen (10–15 %) in der Kultur über die Zeit konstant blieb. Die Infektionsrate betrug ca. 85 %. In den meisten Makrophagen (>80 %) befanden sich am 1. Tag 1–10 amastigote Stadien des LmxWT, am 3. Tag 11–20 (ca. 50 %), am 5.
Tag 21–30 (ca. 50 %) und am 7. Tag >30 (ca. 40%).
Die Analyse der Klone von LmxMPK5-/- ergab, dass sich Klon 1 und Klon 2 gleich verhielten. Die Infektionsrate lag bei ca. 75 %. Am 1. Tag p. i. enthielten ca. 70 % der gezählten Makrophagen 1–10 amastigote Stadien von LmxMPK5-/-. Am 3. Tag lagen die Anteile der Makrophagen mit 1–11 und 11–20 Leishmanien zwischen 40–50 %, während sich am 5. Tag in der Mehrheit der Makrophagen 11–20 amastigote Stadien von LmxMPK5-/- befanden (50–60 %). Am 7. Tag p. i. stieg der Anteil der mit 21–30 amastigoten Stadien von LmxMPK5-/- infizierten Makrophagen auf 40–45 % an. Er war ungefähr so groß wie der Anteil der Makrophagen mit 11-20 amastigoten Stadien. Im Gegensatz zur Infektion mit LmxWT gab es keine Erhöhung der Makrophagengruppe mit mehr als 30 amastigote Stadien.
Zusammenfassend wurde eine verlangsamte Teilung der Klone 1 und 2 von LmxMPK5-/- im Vergleich zum LmxWT in Makrophagen beobachtet.
4.3.4 Leishmanien-Infektion von BALB/c-Mäusen
Um den Einfluss der LmxMPK5-Deletion auf den Infektionsverlauf in vivo zu untersuchen, wurden Gruppen von je fünf BALB/c-Mäusen im Alter von 8-10 Wochen mit dem LmxWT oder den Klonen 1 oder 2 von LmxMPK5-/- infiziert. Hierzu wurden promastigote Stadien aus einer Kultur in der stationären Phase entnommen und in die Fußsohle des rechten Hinterlaufes injiziert (107 pro Tier). Der Infektionsverlauf wurde durch die Messung der Fußdicken des infizierten und des nicht infizierten Hinterlaufes verfolgt (Abb. 21). Nach Infektion mit LmxWT nahm die Dicke der infizierten Füße rasch zu. Nach 19 Wochen hatte sie im Vergleich zu den nicht infizierten Füßen um 2,3 mm zugenommen und sich damit mehr als verdoppelt. Nach 27 Wochen betrug die durchschnittliche Differenz der Fußdicken 3,7 mm. Das Infektionsexperiment mit LmxWT wurde nun abgebrochen, da alle Mäuse eine generalisierte Leishmaniose, d. h. neben der erheblichen Dickenzunahme des
infizierten Hinterfußes auch typische Läsionen am Maul und an den Vorderläufen zeigten. Im Gegensatz hierzu zeigte sich nach der Infektion mit den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- auch nach 45 Wochen nur eine geringe Dickenzunahme von 0,2 bzw. 0,3 mm. Nach dieser Zeit wurde die regelmäßige Messung abgebrochen, da sich keine Veränderungen mehr zeigten.
Wochen p. i.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Differenz der Dicken des infizierten und nicht infizierten Fußes (mm) 0 1 2 3 4 5
LmxWT
LmxMPK5-/-, Klon 1 LmxMPK5-/-, Klon 2
*
Abb. 21: Verlauf der Infektion der Fußsohlen von BALB/c-Mäusen mit LmxWT sowie den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/-. Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte von 5 Tieren, die Balken stellen die Standardabweichung dar. (*) zeigt den signifikanten Unterschied zwischen LmxWT (Woche 26) und den Klonen 1 und 2 von LmxMPK5-/- (Woche 28) (P<0,001).
Die weitere Beobachtung der mit LmxMPK5-/- infizierten Mäuse ergab, dass die geringen Unterschiede zwischen dem infizierten und dem nicht infizierten Fuß über die Zeit gleich blieben. Um diese geringgradige Schwellung zu erklären, wurden die Tiere nach 1,5 Jahren getötet und Gewebeproben von den infizierten Füßen entnommen. Ein Teil der Proben wurde zur histologischen Untersuchung in Parafin
eingebettet, HE-gefärbt und unter dem Lichtmikroskop betrachtet. In der gesamten Dermis befanden sich viele Makrophagen mit amastigoten Stadien sowie auch freie Parasiten (Abb. 22).
Abb. 22: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Semidünn-Schnittes aus einem Fuß einer mit dem Klon 1 von LmxMPK5-/- infizierten Maus. Mit 4 %igem Formaldehyd fixiert und HE-gefärbt. Die Pfeile zeigen amastigote Stadien. 1200fache Vergrösserung.
Ein weiterer Teil wurde steril präpariert, in 2 ml SDM-Medium (komplett) gegeben und bei 26 °C inkubiert. Schon nach 24 h konnten sich im Medium frei bewegende Leishmanien im Promastigotenstadium beobachtet werden.
Zusammenfassend verursachte die Infektion mit beiden Klonen der LmxMPK5-Doppeldeletionsmutante im Gegensatz zum Wildtyp auch nach 1,5 Jahren keine Symptome einer klinischen Leishmaniose in den Mäusen. Allerdings konnten
persistierende, teilungsfähige Leishmanien in den Makrophagen der Dermis der infizierten Füße beobachtet werden.