Quantifizierung der Inhaltsstoffe

Während die Retentionszeit einen qualitativen Parameter darstellt, dient die Peakfläche als quantitativer Informationsparameter. Die Peakfläche wurde mit Hilfe des Programms Knauer Eurochrom 2000 bestimmt. Anschließend wurde die Peakfläche umgerechnet in die Probenkonzentration bzw. Menge.

Um die einzelnen Peaks auf diese Weise zu quantifizieren, sind von jeder Vergleichssubstanz jeweils mindestens drei verschiedene Konzentrationen verwendet worden (Kap. 3.4.).

Die Substanzmenge wird unter Berücksichtigung der Wiederfindung berechnet (Tab.

4.16., entsprechend Tab. 4.17., 4.18.). Die Gehalte der Verbindungen, für die keine eindeutige Identifikation möglich war, sind in Anlehnung an Vergleichssubstanzen mit ähnlicher Retentionszeit und ähnlichem chromatographischen Verhalten berechnet worden. Die der Berechung zu Grunde liegenden Kalibrationsgeraden und Wiederfindungsraten sind in Kapitel 3.4. und Kapitel 4.4.1. aufgeführt.

Die Gehalte der über die Retentionszeiten, das UV-Spektrum und über das Additionsverfahren identifizierten Peaks wurden unter Berücksichtigung der Probenaufarbeitung (Kap. 3.3.1.) auf die ursprünglichen Eichelproben zurückgerechnet.

Die folgenden Tabellen zeigen die flüssigchromatographisch ermittelten Substanzen und deren Gehalte der drei Eichelfutterproben (bezogen auf die Trockenmasse). In allen Futterproben konnten so unterschiedliche Mengen an Polyphenolen nachgewiesen werden.

Das Spektrum der Polyphenole in unbehandelten, normalen Eicheln ist groß. Die HPLC-Analyse ermöglichte es, von den 23 darstellbaren Peaks 14 Verbindungen anhand ihres chromatographischen Verhaltens (Retentionszeit/UV-Spektrum) zu identifizieren (Tab. 4.16.). Die Auswertung der Chromatogramme und der Identifikation führte zu dem Ergebnis, dass in den verarbeiteten Eichelproben (thermische Trocknung, Silage) nicht nur weniger UV-aktive Einzelsubstanzen nachweisbar sind, sondern auch die meisten Substanzen zusätzlich geringere Mengen aufweisen. Auffallend ist aber, dass einige Substanzen erst in den verarbeiteten Eichelproben als freie Verbindung nachweisbar waren (Kaffeesäure, Epicatechin). Diese Stoffe waren in den unbehandelten Eicheln aufgrund von Bindungen (glycosidisch, o. a.) nicht mit dieser Analysenmethodik per HPLC nachweisbar. Darauf wird in Kapitel 5.3. näher eingegangen.

Tabelle 4.16. Gehalte der Polyphenole (mg/g) in normalen Eicheln, nach externer Kalibration, vgl. Tab. 4.8. und Anhang 8.7.;

Rel. Ret.Zeit = Berechnete Retentionszeit ab Einspritzpeak; n.i. = nicht identifizierte Substanz; uS = ursprüngliche Substanz (Feuchtgehalt);

TM = Trockenmasse (67 % der uS) Rel. Ret.Zeit Gehalt unabhängig voneinander durchgeführten Probenläufen anzusehen. Gleiches gilt für die Gehalte in den Tabellen 4.17. und 4.18.. Die Summe aller mit dieser Methodik nachweisbaren Polyphenole in normalen, unbehandelten Eicheln beträgt 10,1 mg/ kg TM. Siehe dazu auch Tabelle 5.1. in Kapitel 5.1.2..

Tabelle 4.17.

Rel. Ret.Zeit = Berechnete Retentionszeit ab Einspritzpeak; n.i. = nicht identifizierte Substanz; uS = ursprüngliche Substanz (Feuchtgehalt);

TM = Trockenmasse (86,5 % der uS).

Rel. Ret.Zeit Gehalt

Rel. Ret.Zeit = Berechnete Retentionszeit ab Einspritzpeak; n.i. = nicht identifizierte Substanz; uS = ursprüngliche Substanz (Feuchtgehalt);

TM = Trockenmasse (72,4 % der uS) Rel. Ret.Zeit Gehalt Betrachtung der Abbildung 4.5., dass die Konzentrationen der nachgewiesenen Substanzen in den verarbeiteten Eichelextrakten signifikant niedriger waren als in den unbehandelten Eicheln.

Kaffeesäure war in unbehandelten Eicheln nicht als freie Substanz identifizierbar, hatte aber in der Eichelsilage einen Gehalt von 0,5 mg/kg TM. Chlorogensäure hingegen war auch in unbehandelten Eicheln (1,2 mg/kg TM) nachweisbar. Der Gehalt war in der Eichelsilage nur geringfügig höher (1,3 mg/kg TM), aber im Verhältnis zu den anderen Substanzen traten besonders Chlorogensäure, Kaffeesäure und Ellagsäure in der Probe der Eichelsilage hervor.

Mit dieser Methodik wurde in unbehandelten Eicheln zum ersten Mal Salicylsäure nachgewiesen. Dies konnte durch den Einsatz der HPLC-MS/MS nicht bestätigt werden. Möglicherweise co-eluiert Salicylsäure mit einer in den Eicheln enthaltenen Verbindung zur selben Retentionszeit.

Das Epicatechin, das laut Literatur enthalten ist, konnte mit dem verwendeten Analysenablauf in unbehandelten Eicheln nicht nachgewiesen werden. Es wurde dagegen in der Eichelsilage gefunden, was das grundsätzliche Vorkommen in Eicheln damit bestätigt.

Das Vorhandensein von Kaffeesäure und Zimtsäure in den behandelten Eichelproben lässt darauf schließen, dass diese auch in unbehandelten Eicheln vorliegen, hier jedoch gebunden und daher nicht als freie Substanzen detektierbar waren (vgl. Abb. 2.9., Kap. 2.1.3.).

Die Unterschiede der einzelnen Gehalte wurden besonders deutlich im Vergleich der verarbeiteten Eicheln (Abb. 4.6.). Die Veränderungen sind erwartungsgemäß groß bei thermisch getrockneten Eicheln. Während des Trocknungsvorgangs wurden die Eicheln auf 85 °C erhitzt, bei dieser Temperaturerhöhung wurden die wesentlichen phenolischen Eichelinhaltsstoffe zerstört und waren dadurch mit der gleichen Methodik nicht mehr darstellbar.

Aus Abbildung 4.6. geht hervor, dass bei gleicher Probenaufarbeitung die zu analysierenden Polyphenole im Vergleich zu dem Gehalt aus normalen, reifen Eicheln bei thermischer Trocknung und durch den Siliervorgang signifikant gesenkt wurden.

-100 0 100 200 300 400 500 600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

(3)

(2)

(1)

Abbildung 4.6. Gegenüberstellung der Chromatogramme von unbehandelten Eicheln (1), nach thermischer Trocknung (2) und von Eichelsilage (3)

vergleichend sind Gallussäure (GA) und Ellagsäure (EA) dargestellt, Retentionszeiten sind verschoben, abhängig vom Einspritzpeak

Verglichen mit den Gesamtphenolgehalten (Kap. 4.2.) zeigten diese Daten eine große Diskrepanz. Die Summe der analysierten und chromatographisch aufgetrennten Polyphenole betrug bei normalen, unbehandelten Eicheln 10,1 mg/kg TM Eicheln. Die Mengen für thermisch getrocknete Eicheln sowie Eichelsilage betrugen 1,6 mg/kg TM bzw. 4,5 mg/kg TM Eichelprobe. Sie waren somit erwartungsgemäß signifikant niedriger. Die prozentualen Veränderungen bei verarbeiteten Eichelproben waren bei den analysierten Polyphenolen ähnlich denen des Gesamtphenolgehaltes, siehe dafür auch Tabelle 5.1. in Kapitel 5.1.2..

GA

GA GA

EA EA

EA Absorbance

(mV)

Zeit (min)

Beim Gegenüberstellen der Chromatogramme (Abb. 4.5.) und der Tabellen (Tab.

4.5., 4.16., 4.17. und 4.18.) fallen vereinzelt Diskrepanzen auf, die durch Bildung von Mittelwerten zustande kommen. Außerdem sind bei der Berechnung der Gehalte die individuellen Wiederfindungsraten berücksichtigt worden. Aufgrund der unterschiedlichen UV-Aktivität der Verbindungen sind besonders bei der Ellagsäure (Wiederfindung 43,6 %) die Gehalte in der Tabelle wesentlich höher als z. B. bei der Gallussäure, obwohl deren Peakhöhe und Peakfläche sich im Chromatogramm größer darstellen. Der direkte Vergleich ist daher nicht als optimal anzusehen, spiegelt aber das Verhältnis der Eichelproben zueinander.

Die Gehalte von Gallussäure und Ellagsäure konnten in allen Eichelproben flüssigchromatographisch (Kap. 3.3.4.) ermittelt werden. Die folgende Tabelle zeigt die Veränderung speziell dieser beiden Substanzen im Vergleich der drei Eichelfutterproben.

Tabelle 4.19. Veränderungen der Gehalte der Gallussäure und der Ellagsäure in unbehandelten Eicheln, Eicheln nach thermischer Trocknung und in Eichelsilage

unbehandelte Eicheln therm. getr. Eicheln Eichelsilage Gallussäure

Ellagsäure

Da in allen Eichelproben Gallussäure und Ellagsäure über den Vergleich von UV-Maxima und über Additionsverfahren (bestätigt über HPLC-MS/MS) zuverlässig identifiziert werden konnten, sind in Tabelle 4.19. die Gehalte dieser beiden Polyphenole aufgeführt.

Die meisten Polyphenole sind auf diese beiden zurückzuführen. Viele stellen Verbindungen mit Gallussäure oder Ellagsäure dar. Die Verarbeitung von Eichelproben führt immer auch zu Veränderung der einzelnen Verbindungen, was wiederum bei Aufspaltung von Makromolekülen die Zunahme der kleineren Polyphenole, besonders der Ellagsäure, erklärt.

Der Einfluss durch das Herstellungsverfahren wurde anhand des Spektrums der enthaltenen Polyphenole sowie der Gehalte an Gallussäure und Ellagsäure von unbehandelten Eicheln, thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage überprüft.

Für Untersuchungen der Veränderung der Polyphenole in Eicheln wurden zusätzlich grüne, unreife Eicheln vom Baum gepflückt und im Spätherbst auch zerfallene, überreife Eicheln gesammelt. Anders als in der Literatur (HUMPHREYS 1988;

HUNNIUS 2004) auch für andere unreife Pflanzen angegeben, sind die Tanningehalte in grünen Eicheln nicht besonders hoch. Die Unterschiede sind als Diagramm in Abbildung 5.1. in Kapitel 5.1.1. dargestellt. Insgesamt konnten in grünen Eicheln 54,4 % der in unbehandelten, reifen Eicheln detektierten Polyphenole nachgewiesen werden. In überreifen Eicheln waren sogar 128,8 % Polyphenole enthalten. Verglichen mit den prozentualen Veränderungen der Gesamt-phenolgehalte der unterschiedlichen Reifegrade besaßen diese Ergebnisse eine zufriedenstellende Übereinstimmung.

0 100 200 300 400 500 600

unbehandelte Eicheln therm. getr. Eicheln Eichelsilage in %

Gallussäure Ellagsäure

Abbildung 4.7. Relative Veränderungen (%) der Gallussäure und Ellagsäure in thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage bezogen auf normale Eicheln

Insgesamt betrachtet stellt jede Verarbeitungstechnik eine große Veränderung der Polyphenolgehalte dar. Die Gehalte der Polyphenole aus normalen Eicheln nahm in Folge der Fermentation bei der Eichelsilage ab.

Gallussäure war in höheren Konzentrationen in unbehandelten Eicheln enthalten.

Abbildung 4.7. zeigt die relativen Veränderungen der freien Gallussäure und freien Ellagsäure bei thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage bezogen auf unbehandelte Eicheln. Der Abbau von Gallatgruppen im Verlauf der Verarbeitung stellte sich chromatographisch nicht signifikant dar.

Die normalen Eicheln hatten die höchsten Gehalte an freier Gallussäure. 49 % waren davon noch in den thermisch getrockneten Eicheln nachweisbar. Der Gallussäuregehalt war bei der Eichelsilage auf 30 % des Ausgangsgehalts gesunken.

Bei der Analyse durch HPLC-UV konnten in unbehandelten Eicheln eine ganze Reihe an Polyphenolen und Catechinen (Chlorogensäure, Kaffeesäure, Catechin, Epicatechin und Quercetin) nachgewiesen werden. Es war möglich, diese auch in grünen und überreifen Eicheln zu identifizieren. In der Eichelsilage konnten kein freies Epicatechin und keine freie Chlorogensäure nachwiesen werden. In den unbehandelten Eicheln dominierte neben der freien Gallussäure auch vor allem freie Ellagsäure, gefolgt von Quercetin-galaktosid. Durch thermische Trocknung und Fermentation wurden diese Verbindungen unterschiedlich beeinflusst. Viele Substanzen wurden bei der Verarbeitung oxidiert und/oder gespalten. Um circa 50 % sank der Gehalt von flüssigchromatographisch nachweisbarer ungebundener Gallussäure, auch die Gehalte von Quercetin-galaktosid und Epicatechin nahmen ab.

Andererseits stiegen besonders die Gehalte der Ellagsäure bei thermisch getrockneten Eicheln um 380 %, in der Eichelsilage wurden sogar 560 % im Vergleich zu unbehandelten Eicheln detektiert.