2. Schrifttum
2.4. Analyse der Polyphenole
2.4.3. Analytische Methoden mittels GC-MS
Mit der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist es möglich, die Massen verschiedener gasförmiger Substanzen aufzunehmen und die einzelnen Verbindungen zu identifizieren können. Dafür müssen die zu identifizierenden Proben gasförmig vorliegen um über eine Adsorptionsfläche für die Massenspektrometrie zugänglich zu sein. Eine effektive Technik zur Analyse von flüchtigen und nicht flüchtigen Verbindungen ist die SPME, Solid Phase Microextraction (Festphasenmikroextraktion).
Die SPME Technik wird besonders im Lebensmittelbereich zur Analyse flüchtiger Substanzen genutzt. Die Aromaforschung verschiedenster Nahrungsmittel durch SPME ergänzt die bisherigen Extraktionstechniken. Gegenwärtig wird die SPME Technik vielfach für die Aromastoffanalyse von Fleisch und Fleischprodukten, wie auch von Rohschinken Iberischer Schweine, eingesetzt (ELMORE et al. 2000, KASTNER 2008).
2.4.4. Analytische Methoden mittels LC-MS/MS
Die Massenspektrometrie stellt einen wichtigen Schritt in der Strukturaufklärung dar.
Mit ihr können Aussagen über das Molekulargewicht einer Substanz gemacht oder über Fragmentierungen Rückschlüsse auf die Struktur gezogen werden. Über die hochauflösende Massenspektrometrie können die an der Struktur beteiligten Verbindungen bestimmt werden.
MÄMMELÄ et al. (2000) nutzten diese Methode mit vorgeschalteter Auftrennung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie zur Analyse der Tannine in zwei Eichenholzarten (Q. alba und Q. robur). Über die Massenspektrometrie mit Ionenfalle und Elektrospray-Ionisation gelang es den Autoren, eine umfangreiche Liste der Inhaltsstoffe aus Eichenstaub zu erstellen.
Bei der Ionisierungsmethode wird die Probe bei Atmosphärendruck über eine Potentialdifferenz von mehreren Kilovolt durch eine Kapillare in das Massenspektrometer gesprüht. Das Lösungsmittel verdampft und die entstehenden Tropfen werden elektrostatisch aufgeladen. Sie können gemäß ihrer Größe und Ladung im Analysator detektiert werden. Man erhält so die Massenzahl (m/z) für das Gesamtmolekül und durch Zerschlagen des eigentlichen Moleküls dessen mögliche Fragmente. Durch die vorherige Auftrennung über HPLC besteht die Möglichkeit, die Massen der einzelnen Substanzen aus Gemischen zu bestimmen. Eine schematische Darstellung vom Aufbau eines Massenspektrometers stellt die Abbildung 3.10., Kapitel 3.6., dar.
Unter Einsatz der negativen Elektronenspray-Ionisation Massenspektrometrie (ESI-MS) identifizierten MEYERS et al. (2006) die kondensierten und hydrolysierbaren Tannine in Lithocarpus densiflorus, welche artverwandt mit Quercus spp. sind.
Anhand unterschiedlicher Fragmentierungsmuster konnten nicht nur Gallussäurereste ([M - H]- m/z 169) nachgewiesen werden, sondern außerdem das
Vorhandensein von Galloylglucose-Einheiten ([M - H]- m/z 331) und Aufspaltung des Zuckerrings gezeigt werden.
Diese Art der kollisionsinduzierten Fragmentierung wird auch von ESPIN et al. (2007) genutzt, um Stoffwechselprodukte von Ellagsäure und Ellagitanninen nachzuweisen und dadurch deren Bioverfügbarkeit und Metabolismus aufzuklären. Anlass für diese Studien ist der Zusammenhang zwischen der präventiven Wirkung von Ellagitanninen im menschlichen Körper und ihrem hohen Anteil in Früchten, Nüssen und Eichenholz-gereiftem Wein. In vorhergehenden Studien konnten die Autoren bereits mehrere entstehende Urolithine im Harn von mit Eicheln gefütterter Iberischer Schweine differenzieren.
In der Studie von ESPIN et al. (2007) wird das Schwein als monogastrisches Tiermodell genutzt, welches dem Menschen unter physiologischen Gesichtspunkten sehr nahe steht. Dabei stellen besonders iberische Schweine aufgrund der nahezu ausschließlichen Eichelfütterung (reich an Polyphenolen) ein exzellentes Modell da, um die Gewebeverteilung von Flavonoiden zu überprüfen. Es gelang, in unterschiedlichen Körpergeweben (Muskel, Fett, Lunge, Leber, Herz und Niere) 31 Metaboliten des Ellagitannins zu identifizieren, von denen jedoch keiner im Harn nachweisbar war. Im Harn wurden hingegen Glucuronide und Diglucuronide der Ellagsäure sowie methyliertes Urolithin A und methyliertes Urolithin B durch den Einsatz von LC-MS/MS ermittelt.
MULLEN et al. (2004) zeigten die Schwierigkeit auf, einen mittels HPLC identifizierten Peak über die Analyse mit Tandem Massenspektrometrie zu bestätigen. MULLEN et al. gelang es dadurch, nach Aufnahme von roten Zwiebeln fünf Quercetin-glucuronide (in menschl. Plasma und Urin) zu detektieren und gleichzeitig das Vorhandensein von Flavonolglucosiden im Plasma auszuschließen.
Auch SANG et al. (2008) nutzten die ESI-MS zum Nachweis von Tee-Polyphenolen und deren Metaboliten im menschlichen Urin. Die Autoren konnten 20 Metaboliten identifizieren, darunter (-)-Epigallocatechin-glucuronide und (-)-Epicatechin-glucuronide sowie deren methylierten und sulfatierten Formen und Catechine mit
Ringaufspaltung. Über die charakteristischen Massendaten sind grundlegende Informationen für fortführende Forschungen des Metabolismus anderer diätetischer Lebensmittel gewonnen worden.
2.4.5. Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes
Bei der Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes nach Folin-Ciocalteu werden die Polyphenole einer zu untersuchenden Probe durch die Folin-Ciocalteu-Reagenz farblich sichtbar gemacht. Mit einem Spektrophotometer wird dann die Intensität gemessen. Über externe Kalibration durch verschiedene Konzentrationen einer Referenzsubstanz, die parallel zu dem Untersuchungsmaterial mit Folin-Ciocalteu-Reagenz behandelt werden, kann der Gehalt der Probe berechnet werden.
Auf diese Weise bestimmten RAKIC et al. (2007 und 2005) die Werte von Eicheln Q. robur und Q. cerris in unbehandeltem Zustand und nach thermischer Behandlung.
Die Autoren konnten so anhand des Gesamtphenolgehaltes und der Gesamtmenge der Tannine zeigen, dass die Menge der Polyphenole geringfügig zunahm, der Tanningehalt nach thermischer Röstung dagegen signifikant abnahm.
Mit Hilfe der Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes erklären TOWO et al. (2006) den Einfluss der Milchsäure-Fermentation auf Hirse-Zubereitungen. Sie untersuchten mehrere Zubereitungsabschnitte zwischen unbehandelter Hirse und fermentierter Hirse. Bereits TOWO et al. zeigten auf diese Weise, dass der Gesamtphenolgehalt in den Proben durch Fermentation signifikant absinkt. Dies soll in der vorliegenden Arbeit an den Proben aus unbehandelten, thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage überprüft werden.
3. Material und Methoden
3.1. Chemikalien
Alle benötigten Chemikalien sind im Anhang 8.1. tabellarisch mit Bezugsquelle und Reinheitsgrad aufgelistet. Die zur Identifikation verwendeten Vergleichssubstanzen, die in Kapitel 3.3.2. erwähnt werden, sind mit Bezugsquelle und Reinheitsgrad im Anhang 8.2. zu finden.
3.2. Untersuchungsmaterial
Bei dem Probenmaterial handelte es sich um verschiedene Eicheln und Eichelzubereitungen.
Für alle Versuche wurden ausschließlich Eicheln verwendet, deren Art und Herkunft bekannt war. Diese wurden in Hannover und Umgebung gesammelt. Dabei wurden vorwiegend reife, ganze Eicheln vom Boden aufgenommen. Für Vergleiche wurden überreife, dunkle und bereits leicht zerfallene Eicheln vom Boden gesammelt sowie noch grüne Eicheln vom Baum gepflückt. Um gegebenenfalls zusätzlich Art-unterschiede nachweisen zu können, wurden reife Eicheln der Roteiche separat gesammelt. Unmittelbar nach Eintreffen im Institut für Chemische Analytik wurde das Probenmaterial verarbeitet und bis zur Extraktion und weiteren Analyse bei –18 °C gelagert.
Zur Verfügung standen zusätzlich neben den frischen Eicheln (grüne, reife, überreife Eicheln) verschiedene Futterproben der Firma Büning/Bentheimer Schweine. Der Betrieb der Firma Büning, in dem Schweine mit Eicheln gefüttert werden, versuchte den Problemen bei der Lagerung durch verschiedene Zubereitungen der Eicheln entgegenzuwirken. Die Lagerfähigkeit und die Haltbarkeit werden dadurch verbessert.
Zusätzlich zu den Eichel-Futterproben standen Harnproben von Schweinen, die im Stall mit bestimmten Eichelmengen gemästet wurden, zur Verfügung. Zum Vergleich lagen des weiteren Harnproben von herkömmlich gefütterten Schweinen vor.
3.2.1. Ganze Eicheln
Die ganzen Eicheln wurden in der Umgebung Hannovers gesammelt und können damit eindeutig ihrer Art zugeordnet werden.
Eicheln von Q. robur L. und Q. petraea Liebl. (Fagaceae) wurden in Hannover und Umgebung im Herbst 2006 und im Herbst 2007 gesammelt. Dabei wurde darauf geachtet, dass die reifen und die grünen Eicheln unbeschädigt waren und keine Löcher aufwiesen.
Die ganzen Eicheln wurden zunächst mit einem Messer zerteilt, dann mit Hilfe einer Moulinette zerkleinert, um eine optimale Extraktion zu gewährleisten. Um mögliche Verluste während der Lagerung zu minimieren, sind alle Proben vakuumverpackt und dann bei –18 °C bis zur endgültigen Probenanalyse gelagert worden.
3.2.2. Futterproben der Fa. Büning
Um der steigenden Nachfrage nach Produkten mit Eicheln gefütterter Schweinen gerecht zu werden, mussten zunehmend mehr Eicheln gelagert werden. Daher war die zunächst praktizierte thermische Trocknung der Eicheln (2006) nicht mehr praktikabel. 2007 wurde auf Silieren von Eichelschrot umgestellt. Das Probenmaterial wurde freundlicherweise von der Fa. Büning/Bentheimer Schweine zur Verfügung gestellt.
Diese Proben wurden vakuumverpackt verschickt und sofort nach Erhalt im Institut für Chemische Analytik bei –18 °C bis zur Probenaufbereitung eingefroren.
3.2.2.1. Thermisch getrocknetes Eichelschrot
Die Trocknung der zuvor geschroteten Eicheln erfolgte bei ca. 85 °C. Dadurch wurde die Schimmelbildung während der Lagerung weitestgehend ausgeschlossen.
Allerdings bringt diese Verarbeitungsmethode einen hohen Arbeits- und Kostenaufwand mit sich, weshalb die Firma Büning die Trocknung durch das weniger aufwendige Silieren der Eicheln abgelöst hat.
Da das thermisch getrocknete Eichelschrot bereits ausreichend zerkleinert war, blieb dieses Probenmaterial bis zur Verarbeitung tiefgekühlt und wurde erst kurz vor der eigentlichen Analyse geöffnet und dann weiterverarbeitet.
3.2.2.2. Eichelsilage
Für die Konservierung durch Silieren sind nahezu alle Grünfuttermittel geeignet wie Gras, Mais, kleeartige Futterpflanzen, Luzerne, Ackerbohnen, Hafer sowie Rübenblätter. Dabei wird das wasserhaltige Material gehäckselt und luftdicht abgedeckt. Bei Bedarf kommen Silierhilfsmittel zum Einsatz, um die Qualität der Silage zu verbessern und einen schnellen Gärprozess zu gewährleisten.
Der Siliervorgang setzt damit ein, dass sich die Milchsäurebakterien vermehren und den Zuckeranteil der Pflanzenmasse in Milchsäure vergären. Diese gibt der Silage den typisch säuerlichen Geruch und Geschmack. Der pH-Wert sinkt auf 4 und verhindert so das Wachstum von Fäulnisbakterien. Wird die Silage schließlich noch saurer, werden auch die Milchsäurebakterien gehemmt. Die Gärung kommt so zum Stillstand und das silierte Futter ist nun lange Zeit haltbar.
Während des Silierprozesses wird im Siliergut enthaltener Zucker bzw. Stärke durch Bakterien in Milchsäure umgewandelt, etwas Essigsäure, und, wenn der Silierprozess nicht optimal verläuft, mehr oder weniger viel Buttersäure. Sie werden als Gärsäuren bezeichnet.
Nasssilagen neigen aufgrund des Wassergehalts sowie geringer Zuckergehalte oft zu Essig- und Buttersäuregärung. Die pH-Wert-Absenkung ist in diesem Falle nicht so stark wie bei der Milchsäuregärung. Zudem kann in diesen Silagen Milchsäure bakteriell in Essig- und Buttersäure umgewandelt werden.
Zur Konservierung der gesammelten 48 Tonnen Eicheln (2007) verwendete die Fa.
Büning 215 Liter eines Siliermittels, das aus Natriumbenzoat und Propionsäure besteht. Propionsäure wird für diese Zwecke häufig genutzt, da diese Säure nicht nur den Gärverlauf fördert, sondern gleichzeitig auch die aerobe Stabilität verbessert und energieliefernd wirkt.
Zur Silierung von Eicheln im Speziellen sind in der Literatur keine Angaben zu finden.
Analog zu den oben aufgeführten Grünfutterarten ist bei der Silierung von Eicheln unter dem Einsatz von Siliermittel das Entstehen von Milchsäure, aber auch Essigsäure und vermutlich auch von Buttersäure zu erwarten.
Das vorliegende Probenmaterial wies einen ausreichenden Zerkleinerungsgrad auf.
Es blieb bis zur Verarbeitung tiefgekühlt und wurde erst kurz vor der eigentlichen Analyse geöffnet und dann weiterverarbeitet.
3.2.3. Weiteres Probenmaterial
Neben den oben genannten Eichelproben wurde für eine bessere Bewertung der Effektivität der Waldweide als mögliche Mastform weiteres Probenmaterial (verschiedene Reifegrade der Eicheln, unterschiedliche Eichelarten; siehe Tabelle 3.1.) gesammelt.
Um beurteilen zu können, ob Schweine während der Eichelmast im Wald über einen langen Zeitraum ausreichend hohe Polyphenolgehalte zu sich nehmen, dürfen sowohl grüne Eicheln als auch überreife, leicht zersetzte Eicheln und Eichenlaub nicht außer Acht gelassen werden.
Beim Sammeln des Probenmaterials wurde darauf geachtet, dass die grünen Eicheln ganz waren und nur die überreifen Eicheln leicht aufgesprungen und auch vereinzelt Löcher hatten.
Übersicht 3.1. Übersicht über das Probenmaterial, die Herkunft, den Reifegrad sowie die Verarbeitung der Eicheln
Probenmaterial Herkunft Jahr Reifegrad Verarbeitung
ganze, grüne Eicheln vom Baum gepflückt 2006 frisch, unreif ganze, reife Eicheln vom Boden gesammelt 2006 frisch, reif
Eichelschrot Fa. Büning 2006 reif thermisch getrocknet
Eichelsilage Fa. Büning 2007 reif siliert
zerfallene Eicheln vom Boden gesammelt 2006 überreif, bereits leicht zerfallen Roteicheln vom Boden gesammelt 2006 frisch, reif
Selbstverständlich deckten diese Proben nicht das komplette Futterspektrum der Schweine in den (zumeist nicht reinen) Eichenwäldern ab, doch lassen sie erste Aussagen über die Veränderungen in den Eicheln während der Reifung (siehe auch Kapitel 2.3.2.) zu.
Schweine nehmen grüne Eicheln eher selten auf (REY et al. 1998). Allerdings ist die Aufnahme nicht auszuschließen, insbesondere wenn das sonstige Futterangebot knapp ist und durch Stürme etc. viele grüne Eicheln zu Boden gefallen sind.
Für weitere Gegenüberstellungen standen außerdem ganze, reife Eicheln der Roteiche (Q. rubra L.) zur Untersuchung bereit. Auch hierfür wurden ausschließlich ganze Eicheln ohne Löcher gesammelt.
Alle Proben wurden mit einem Messer zerkleinert und in einer Moulinette zermahlen.
Bis zur Analyse wurden die Proben bei –18 °C gelagert.
3.2.4. Harn von Schweinen, die mit Eicheln gefüttert wurden
Die Fütterungsstudien bei Schweinen mit Eicheln erfolgten im Herbst 2006 in der Klinik für kleine Klauentiere an der Tierärztliche Hochschule Hannover. Während der Fütterungsuntersuchung wurden Harnproben von Schweinen genommen, die täglich mit 4 kg Eichelschrot gefüttert wurden. Die Fütterungsperiode dauerte fünf Wochen
(siehe Übersicht 3.2.). Bei den Schweinen dieser Fütterungsreihe handelte es sich um Hybridschweine, welche im gleichem Alter und annähernd einheitlichem Gewicht aus demselben Bestand bezogen wurden. Die Tagesration von 4 kg Eichelschrot wurde mit 750 g Sojaschrot sowie 100 mL Sojaöl und 1 kg Schweinefutter der Klinik (80 % Gerste, 15 % Sojaschrot, 2 % Sojaöl, 3 % Mineralfutter) ergänzt. Hierdurch sollte eventuellen Mangelerscheinungen durch zu geringe Eiweißzufuhr vorgebeugt und gleichzeitig durch das Mischen der einzelnen Bestandteile die Akzeptanz erhöht werden. Bei alleiniger Fütterung von Eichelschrot wurde dieses verweigert. Zur Gewinnung des Harns wurden die Schweine am Tag vor der Schlachtung katheterisiert.
Im Frühjahr 2008 wurden weitere Fütterungsversuche im Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Anlass für diese Versuchsreihen waren die Auswirkungen der Eichelfütterung auf die Schweine. Da bereits geringe Futtermengen in Abhängigkeit von Größe und Alter des Tieres zu deutlichen Veränderungen im Körper führen, erfolgte lediglich eine Fütterung von 100 g Eicheln täglich zusätzlich zum Alleinfutter. Die Harnproben dieser Schweine wurden in der Sektion, direkt im Anschluss an die Tötung der Schweine, aus der Blase entnommen.
3.2.5. Harn von Schweinen, die mit Alleinfutter gefüttert wurden
Für Vergleichszwecke standen Harnproben von Schweinen, die mit Alleinfutter gefüttert wurden, zur Verfügung. Innerhalb aller Fütterungsreihen, sowohl in der Klinik für kleine Klauentiere als auch im Institut für Tierernährung der Stiftung Tierärztliche Hochschule, wurden gleichzeitig unter gleichen Voraussetzungen (Rasse, Herkunft, Alter, Gewicht) und gleichen Bedingungen weitere Schweine gehalten, die identisches Futter ohne den Zusatz von Eichelschrot bekamen. Bei dem Alleinfutter handelt es sich um ein klinikeigenes Mischfutter. In der Fütterungsreihe der Klinik für kleine Klauentiere wurden so die ersten Vergleichsproben an Harn gewonnen. Diese Proben wurden mittels Katheter direkt
aus der Blase am lebenden Tier am Tag vor der Schlachtung gewonnen. Die Proben aus den Fütterungsstudien im Institut für Tierernährung wurden hingegen während der Sektion am unmittelbar zuvor getöteten Tier gewonnen.
Übersicht 3.2. Übersicht über die unterschiedliche Fütterung mit Eicheln
Jahr Institut Tierdaten Futtermenge
2007 Klinik für kleine Klauentiere
Mastschwein, 115 kg KGW 4 kg Eicheln + 1 kg Mischfutter + 750 g Sojaschrot + 100 mL Sojaöl 2008 Tierernährung Ferkel, 14-27 kg KGW 100 g Eicheln + 890 g Alleinfutter 2008 Tierernährung Ferkel, 14-27 kg KGW 100 g Eicheln + 890 g Alleinfutter
Alle Fütterungsreihen (Klinik für kleine Klauentiere und Institut für Tierernährung, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) wurden im Rahmen anderer Projekte durchgeführt. Für die vorliegende Arbeit war daher kein Tierversuchsantrag zu stellen.
3.3. Polyphenolanalyse
Eine detaillierte Betrachtung und Bewertung der Verarbeitungstechnik von Eicheln als Futtermittel auf ihre wirksamen Inhaltsstoffe erfordert gut reproduzierbare und leistungsfähige Analysenmethoden. Für optimale Ergebnisse ist eine schnelle und einfache Aufarbeitung und Messung der Proben notwendig, um Veränderungen der Proben durch Lagerung und lange Wartezeiten zu vermeiden.
Anfänglich wurde die Polyphenolanalyse mit zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt. In Anlehnung an die Arbeit von CHEBAN et al. 1976 (siehe Kap. 2.4.1.) wurde zunächst versucht, verschiedene Extrakte aus Eichelmaterial durch Dünnschichtchromatographie aufzutrennen. Dabei gestaltete es sich schwierig, eine ausreichende Menge an Probenmaterial aufzutragen, denn mit ansteigender Menge vergrößerte sich auch die Stärke der Schmierstoffe. Dadurch konnte keine deutliche und zufriedenstellende Auftrennung in mehrere Banden erreicht werden. Auch der Versuch das Fliessmittel anzupassen brachte kaum Verbesserung. Aus diesem
Grund wurde die Analyse mit der weniger geeigneten Dünnschichtchromatographie eingestellt und die Analysen mittels HPLC fortgeführt.
Aufgrund der in der Literatur nur unzureichendenden Angaben über die Identifikation der pflanzlichen Polyphenole in Eicheln, galt es eine sinnvolle Kombination aus mehreren HPLC-Analysemethoden zu erstellen und diese später unter Beachtung der eigenen Gegebenheiten zu optimieren.
3.3.1. Probenaufbereitung
3.3.1.1. Extraktion der Phenole
Unabhängig von der durchgeführten Analysenart wurde das Probenmaterial immer gleich extrahiert, einzige Ausnahme war die Analyse mittels GC-MS, die Probenaufbereitung dafür wird separat in Kapitel 3.6. beschrieben.
Das Probenmaterial war bereits vorbereitet, geschrotet und gemahlen, und lag zur weiteren Aufbereitung im Gefrierschrank bereit.
Zur weiteren Probenaufbereitung wurden die einzelnen Proben dann mittels Ultraturrax T-25 (Janke-Kunkel GmbH & Co. KG-Ika Labortechnik, Staufen, Breisgau) bei 24.000 rpm für ca. 30 Sekunden nach Zugabe von Methanol homogenisiert. In insgesamt drei Schritten wurden 20 g Probenmaterial nacheinander 20 mL, 2 x 10 mL Methanol zugesetzt und im Ultraschallbad (Knauer, Berlin) für jeweils 10 min belassen. Der Extrakt wurde vorsichtig abgenommen und für 5 min in einer Zentrifuge (Hettich Universal 1200) bei einer relativen Zentrifugationsbeschleunigung (RZB) von 1500 zentrifugiert. Die nach der Zentrifugation vereinigten Überstände bildeten den Rohextrakt. Anschließend wurde dieser im 50 °C warmen Wasserbad des Rotationsverdampfer mit Vakuumcontroler (Janke & Kunkel, Deutschland) bei auf ca. 280 mbar reduziertem Druck auf ca. 4 mL eingedampft.
Waage Probenmaterial geschrotet
Abbildung 3.1. Fliessschema zur Extraktion des Probenmaterials
Die Extraktion des Probenmaterials ist in Abbildung 3.1. als Fliessschema dargestellt. Auf gleiche Weise wurden aus grünen Eicheln sowie alten, bereits leicht zersetzten Eicheln Extrakte hergestellt.
3.3.1.2. Festphasenextraktion (SPE, engl. Solid Phase Extraction)
Unter Verwendung der Festphasenextraktion wurde der Rohextrakt in mehrere Fraktionen aufgetrennt. So wurden zunächst die stark unpolaren Stoffe, die schon bei der Dünnschichtchromatographie zu Schmierspuren führten, abgetrennt.
Zur Vorbereitung der SPE wurden die Aufsatzstücke der Unterdruckkammer der Festphase zunächst mit tridestilliertem Wasser gereinigt und nachfolgend mit Luft getrocknet. Verwendet wurde eine 6 mL Chromabond® SiOH Festphase, Carl Roth GmbH & Co. KG, Deutschland. Die Festphasensäule wurde erst mit 6 mL tridestilliertem Wasser und dann mit 6 mL Methanol konditioniert.
Auf die so vorbereitete Festphasensäule wurden 400
Rohextrakt wurden entsprechend alle mit Methanol extraktierbaren Polyphenole aus 2 g Ausgangsmaterial zur weiteren Analyse vorbereitet.
Nach dem Probenauftrag wurde die Säule auf das nächste Ventil gesteckt und es folgte ein Waschgang mit 4 mL Hexan, um unerwünschte Substanzen von der Säule zu waschen. Die Waschlösung wurde ebenfalls aufgefangen, um zu überprüfen, dass keine relevanten Substanzen zu diesem Zeitpunkt bereits ausgewaschen wurden. Anschließend wurde die Festphasensäule über einem 25 mL Messkolben positioniert. Für die erste Fraktionierung sind 4 mL Ethanol auf die Festphasensäule gegeben und langsam in den Kolben getropft worden.
Für jede weitere Fraktion wurde die Säule ein Ventil weiter gesteckt und die Elutionslösungen konnten somit in separaten Messkolben aufgefangen werden. So folgten Fraktionen aus je 4 mL MeOH und 4 mL H2O, die aber im Vergleich keine zufriedenstellenden Ergebnisse brachten, weshalb hauptsächlich mit der EtOH-Fraktion gearbeitet wurde (siehe Kap. 4.4.2.).
Für jede Probe wurde dieser Vorgang insgesamt 3x wiederholt, um genügend Probenmaterial zu erhalten (Abb. 3.2.).
Säule:
Die drei sich daraus ergebenden 12 mL Fraktionen (EtOH, MeOH, H2O) wurden danach, getrennt von einander, wiederum auf 1,2 mL am Rotationsverdampfer (Janke & Kunkel, Deutschland) reduziert. Die resultierenden 1,2 mL Extrakt entsprachen somit aufgrund der komplexen Probenaufbereitung einer Ausgangsmenge von 6 g ursprünglicher Substanz. Die konzentrierten Extrakte wurden in je ein Eppendorfcap überführt. Diese wurden abschließend für 2 min bei einer RZB von 8000 in einer Kleinzentrifuge (3200 Eppendorf, Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) zentrifugiert. Die Analyse erfolgte mittels HPLC-UV und HPLC-DAD.
Zur besseren Übersicht der Probenaufarbeitung mittels SPE ist in Abbildung 3.2. ein Fliessdiagramm dazu dargestellt. Die Wiederfindungsrate (Kap. 3.4.) der Vergleichssubstanzen wird mittels dieser Festphasenextraktion ermittelt.
3.3.2. Vergleichssubstanzen
Die zur Identifikation verwendeten Vergleichssubstanzen sind mit Bezugsquelle, Reinheitsgrad, Trivialnamen und Summenformel im Anhang 8.2. aufgelistet. Es handelt sich um Substanzen, die in der Literatur als typische Pflanzenpolyphenole beschrieben sind, für Eicheln bekannt sind oder in vergleichbaren Pflanzen bzw.
Pflanzenteilen bereits nachgewiesen wurden. Sie wurden zur Identifikation und zur
Pflanzenteilen bereits nachgewiesen wurden. Sie wurden zur Identifikation und zur