3. Material und Methoden
3.7. Bestimmung der Trockenmasse
Von allen Eichelproben sowie den Eichelfutterproben wurden die Trockenmassen bestimmt. Dafür wurden jeweils 1 g Probe in eine Probenschale eingewogen und in das Feuchte-Analysegerät MB 35, Ohaus, Greifensee, Schweiz verbracht.
Zusätzlich wurden weitere physikalische Bestimmungen der ganzen Eicheln hinsichtlich der Gesamtmasse und des Massenverhältnisses von Exosperm (Schale) zu Endosperm (Kern) durchgeführt. Alle nachfolgend beschriebenen Bestimmungen wurden sechsfach ausgeführt. Die Gesamtmasse wurde für 100 Eicheln bestimmt, außerdem wurde die Anzahl der Eicheln, die für 100 g benötigt werden, berechnet.
Diese Bestimmungen wurden für grüne, unreife, reife und überreife, leicht zerfallene
Eicheln durchgeführt. Außerdem wurden Vergleiche zwischen Eicheln der Stieleiche und der Roteiche gezogen.
Da sich das Schälen der frischen Eicheln schwierig gestaltete, wurden für das Massenverhältnis von Exosperm zu Endosperm lediglich 10 Eicheln verwendet.
Dieses Verhältnis wurde auch für unreife und reife Eicheln errechnet. Die aus den Messungen resultierenden Daten finden sich in Kapitel 4.1..
3.8. Gesamtphenolgehalt nach Folin-Ciocalteu
Den Gesamtphenolgehalt von Eicheln bestimmten schon RAKIC et al. (2005, 2007).
Für einen Vergleich mit deren Angaben und für einen Überblick über die untersuchten verschiedenen Eichelfutterzubereitungen wurde in dieser Arbeit auch der Gesamtphenolgehalt ermittelt (vgl. Kap. 2.4.5.).
Zunächst wurde eine Stammlösung aus Gallussäure-Monohydrat hergestellt (100 mg/100 mL). Dafür wurden 10 mg Gallussäure-Monohydrat in 10 mL tridestilliertem Wasser gelöst. Diese Stammlösung wurde mit tridestilliertem Wasser auf die Konzentrationen von 50 mg, 10 mg und 5 mg in 100 mL gebracht.
Weiter musste bei Raumtemperatur gesättigte Natriumcarbonatlösung vorbereitet vorliegen. Dazu wurden 40,5 g Na2CO3 in 200 mL tridestilliertem Wasser gelöst.
Die Messung wurde zunächst für einen Blindwert (tridestilliertes Wasser) und die Stammlösung sowie die Standardlösungen aus Gallussäure-Monohydrat durchgeführt. Anschließend erfolgte der Vergleich mit den Extrakten.
0,1 mL Extraktionslösung bzw. Gallussäure-Monohydrat-Standardlösung bzw.
tridestilliertes Wasser für den Blindwert wurden in einem Messkolben mit 8,4 mL entmineralisiertem Wasser verdünnt. Diesem wurden 0,5 mL Folin-Ciocalteu-Reagenz zugesetzt und für 3-6 min stehen gelassen. Anschließend wurde 1,0 mL gesättigte Natriumcarbonatlösung zugegeben. Nach 90 Minuten bei Raumtemperatur
wurde die Extinktion bei 720 nm in 1 cm Einmalküvetten gegen den Reagenz-blindwert gemessen.
Der Gesamtphenolgehalt wurde für die drei Eichelfutterarten (ganze, reife Eicheln, thermisch getrocknetes Eichelschrot sowie Eichelsilage) bestimmt. Für erste Aussagen über die Veränderungen während des Reifeprozesses wurden außerdem ganze, grüne Eicheln und überreife, leicht zerfallene Eicheln untersucht. Für einen Artenvergleich wurden Eicheln der Roteiche separat untersucht.
Die Messdaten werden in Kapitel 4.2. beschrieben, in Kapitel 4.4.5. werden sie der berechneten Menge aller detektierten Polyphenole gegenübergestellt und in Kapitel 5.3. wird abschließend die Aussagekraft diskutiert.
Über die Kalibrierung mit Gallussäure-Monohydrat-Standardlösungen wurde der Gesamtphenolgehalt in Gallussäureäquivalenten (GAE) in mg/mL bzw. mg/g angegeben. Der Linearitätsbereich betrug zwischen 5 und 100 mg/100 mL und der Variationskoeffizient unter 9 %.
0,0000 0,1000 0,2000 0,3000 0,4000 0,5000 0,6000 0,7000
0 20 40 60 80 100 120
Gallussäure (mg / mL) Extinktion
Abbildung 3.10. Kalibriergerade der Gallussäure für Gesamtphenolbestimmung
Der so ermittelte Gesamtphenolgehalt in Eichelfutterproben gibt nur einen Überblick und dient in dieser Arbeit vor allem dem Vergleich mit Daten aus der Literatur. Die
Aussagekraft des Gesamtphenolgehalts ist nur bedingt vergleichbar mit der berechneten Gesamtmenge aller detektierten Polyphenole (vgl. Kap. 4.2., 4.4.5. und 5.3.).
3.9. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistic analysis system (SAS) für Windows (Version 9.1), SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.
Die statistische Auswertung der Messergebnisse bezüglich der Polyphenole in Eicheln bzw. Eichelfutterarten wurde über die einfaktorielle Varianzanalyse durchgeführt.
4. Ergebnisse
4.1. Trockenmasse und weitere physikalische Eigenschaften des Probenmaterials
Das Probenmaterial bestand aus drei Eichelarten. Für die physikalische Bestimmung wurden nur Eicheln ausgesucht, die eindeutig der Stieleiche und der Roteiche zugeordnet werden konnten, um Aussagen über den artspezifischen Unterschied treffen zu können. Die Eicheln der Art Q. robur L. (deutsche Stieleiche) waren mit einer Länge von 2,8 cm und 1,7 cm Breite oval bis länglich geformt. Damit waren deutsche Eicheln im Vergleich zu Eicheln aus dem mediterranen Raum kleiner und hatten gleichzeitig ein geringeres Gewicht. Wie in Tabelle 4.1. dargestellt, wogen 10 reife deutsche Eicheln im Durchschnitt 40,8 g. Somit wurden für 100 g Rohmaterial etwa 28 Eicheln benötigt. Die Eicheln der Roteiche (Q. rubra L.) waren dagegen eher rund, mit einer Länge von 2,3 cm und einer Breite von 2,0 cm.
RAKIC et al. (2005) bestimmten mediterrane Eichelproben physikalisch anhand mehrerer Größen. Die von ihnen untersuchten Eicheln der Art Q. robur waren bei zylindrisch bis ovaler Form etwa 3,6 cm lang und 2,8 cm breit. Für umgerechnet 100 g Gesamtmasse waren durchschnittlich 13,89 Eicheln der mediterranen Art nötig. 10 Eicheln wogen dabei fast das Doppelte der deutschen Eicheln (71,9 g). Das Verhältnis von Schale zu Kern lag bei 1:5,9 (RAKIC et al. 2005).
Tabelle 4.1. Mittelwerte der physikalischen Eigenschaften des Ausgangsmaterials
(Mittelwerte aus 6 unabhängigen Messungen) – Differenzen kommen durch Rundungsabweichungen zustande
Anzahl der Eicheln in 100 g 30,05 25,95 32,70 32,54
Gewicht von 10 Eicheln 35,55 40,81 35,31 31,40
Exokarp (in %) 19,15 14,14 17,36 40,19
Endokarp (in %) 80,85 85,81 82,37 59,55
Verhältnis
Exosperm:Endosperm
1:4,20 1:6,05 1:4,68 1:1,48
In Tabelle 4.1. sind die Eichelarten, die für diese Arbeit zur Verfügung standen, und ihrer physikalischen Eigenschaften aufgelistet. Die physikalischen Eigenschaften des Ausgangsmaterials sind aus mehreren Gründen wichtig, zum einen für den Sammelvorgang und die Lagerung, zum anderen für die Berechnung und Kalkulation der optimalen Aufnahmemenge für Schweine zur Erzielung hochwertiger Eichelfleischprodukte.
Die Gewichtsveränderungen zeigten deutlich, dass während der Reife der Kern signifikant schwerer wird. Der Anteil der Schale sank demnach bei zunehmenden Reifegrad.
Die Trockenmasse wurde anhand der in Kapitel 3.7. beschriebenen Methodendurchführung bestimmt. Tabelle 4.2. zeigt die Trockenmasse der Eicheln unterschiedlicher Arten. In Tabelle 4.3. werden die Unterschiede der Reifegrade in Bezug auf die Trockenmasse aufgezeigt. In Tabelle 4.4. ist die Trockenmasse der Schalen (Exosperm) im Vergleich zu der Trockenmasse der Kerne (Endosperm) dargestellt. In Abbildung 4.1. werden die relativen Werte der Trockenmassen verglichen.
Tabelle 4.2. Trockenmasse der Eichelarten Q. robur L. und Q. rubra L.
Art der Eicheln Trockenmasse in %
1 2 3 4 5 6 Durchschnitt
Q. robur L. 65,88 65,63 66,96 67,50 67,71 68,20 66,98 Q. rubra L. 82,17 82,11 81,97 82,31 82,62 87,51 83,12
Tabelle 4.3. Trockenmasse normaler Eicheln (Q. robur L.) verschiedener Reifegrade Trockenmasse in %
Reifegrad
Q. robur L. 1 2 3 4 5 6 Durchschnitt
unreif 60,53 62,17 60,02 61,33 60,70 60,04 60,80
reif 65,88 65,63 66,96 67,50 67,71 68,20 66,98
überreif 60,63 61,06 57,21 59,57 58,96 59,48 59,49
Tabelle 4.4. Durchschnittliche Trockenmasse (n=6) ganzer Eicheln, Exosperm und Endosperm der Eichelarten Q. rubra L. und Q. robur L. verschiedener Reifegrade
Trockenmasse in %
Bei beiden Eichelarten waren die Trockenmassen des Kernes der reifen Eicheln nur geringfügig größer als die der Schalen. Jedoch waren die Trockenmassen der Eicheln von Q. rubra L. signifikant höher als von Q. robur L.; grundsätzlich waren alle Trockenmassen von Q. robur L. geringer.
ganz Endosperm Perikarp
Abbildung 4.1. Diagramm zur Übersicht der Trockenmasse verschiedener Eicheln
Aus diesen Tabellen und der Abbildung kann geschlossen werden, dass die Trockenmassen je nach Eichelart, Reifegrad und abhängig von Exosperm und Endosperm unterschiedlich waren und sich im Laufe der Verarbeitung oder Lagerung (mit eventueller Trocknung oder Keimung) ändern. Diese Änderungen waren nicht einheitlich. Die Trockenmasse verringerte sich bei fortschreitender Reife signifikant, wobei die Trockenmasse der Schale ungefähr gleich blieb, sodass die
4.2. Gesamtphenolgehalt
Der Gesamtphenolgehalt war bei den verschiedenen Extrakten sehr unterschiedlich.
Zur Analyse wurden Extrakte mit Methanol von den einzelnen Eichelproben analog zur sonstigen Probenvorbereitung hergestellt. Der Gesamtphenolgehalt wurde nach Folin-Ciocalteu bestimmt (Kap. 3.6.). Die Ergebnisse in Tabelle 4.5. sind in Gallussäureäquivalenten (GAE) angegeben. Die für die Berechnungen zugrunde liegenden Messungen mit Gallussäure-Monohydrat-Standardlösungen sind im Anhang 4.2. und 4.3. aufgeführt.
Bei Veränderung des pH-Wertes, wie z. B. bei der Eichelsilage, sank der Gesamtphenolgehalt. Der Grund hierfür scheint darin zu liegen, dass nicht alle phenolischen Verbindungen stabil bei Abweichungen des pH-Wertes sind.
Der Gesamtpolyphenolgehalt wurde mit Hilfe der Spektrophotometrie (vgl. Kap. 3.8.) bei einer festen Wellenlänge von 720 nm ermittelt. Die Ergebnisse wurden auf 100 g Eicheln als Ausgangsmasse umgerechnet.
Tabelle 4.5. Gesamtphenolgehalte (angegeben in Gallussäure-Äquivalent (GAE); in mg/100 g) von grünen, reifen und überreifen Eicheln der Stieleiche, thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage sowie reifen Eicheln der Roteiche; jeweils Mittelwerte und Minimal-und Maximalwerte (n = 6)
Den Ergebnissen in Tabelle 4.5. liegen 6 Messreihen zu Grunde. Sie bestätigen über die minimalen und maximalen Werte die große Varianz innerhalb der Eichelproben.
Der Varianzkoeffizient liegt bei 5-8.
Anhand des Gesamtphenolgehaltes nach Folin-Ciocalteu zeichnete sich eine deutliche Tendenz ab: Während bei grünen Eicheln der Gehalt noch sehr gering war,
(79,3 mg in 100 g grünen Eicheln) zu reifen Eicheln (429,9 mg in 100 g reifen Eicheln) entsprachen einer Zunahme um 442 %, dagegen sank der Phenolgehalt von den reifen zu den überreifen Eicheln wieder auf 150,2 mg/ 100 g ab.
grün
Abbildung 4.2. Vergleich des Gesamtphenolgehaltes verschiedener Eichelproben untereinander;
angegeben in Gallussäure-Äquivalent (n = 6)
Auch der Unterschied zwischen den Eichelarten war signifikant. Die deutsche reife Eichel enthielt nach diesen Bestimmungen gut 25 % weniger Phenole als die reife Eichel der Amerikanischen Roteiche. Die von RAKIC et al. (2007) untersuchten Eicheln von Q. robur und Q. cerris besaßen nur gering voneinander abweichende Gesamtphenolgehalte (0,223 bzw. 0,0229 mg GAE/ mg Trockengewicht).
Prägnant stellte sich auch der Unterschied bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten verarbeiteten Eichelfuttermitteln dar. Unbehandelte Eicheln enthielten viele Polyphenole, deren Gehalte sanken durch thermische Trocknung oder durch den Siliervorgang unter 25 %.
Der Vergleich zu den Anteilen der detektierten Polyphenole wird in Kapitel 4.4.5.
dargestellt.
4.3. Ergebnisse aus der Dünnschichtchromatographie
Bei der Dünnschichtchromatographie von Eichelextrakten erwiesen sich Fließmittel mit einer Polarität von 4,5 bzw. 5,8 bis 6,6 als optimal. Die Berechnung der gewählten Polarität von 4,76 ist im Anhang 8.6. aufgeführt. Verwendet wurden sowohl RP-18 als auch Si60-Platten.
Die Verwendung der Festphasenextraktion vor dem Auftragen auf die DC-Platte verminderte den Anteil an Störsubstanzen, reichte aber nicht aus, um den Extrakt optimal für die Identifikation aufzutrennen.
Auch das Ausschütteln mit unpolaren Lösemitteln oder die Probenbearbeitung mittels Rotationsverdampfer erbrachte nicht den erwünschten Erfolg. Der Rotationsverdampfer ermöglichte es, einen konzentrierten Extrakt aufzutragen. Dies ließ zwar keine bessere Auftrennung zu, aber weitere Banden wurden sichtbar. Der höhere Anteil an Schmierstoffen wurde durch die Festphasenextraktion weitestgehend eliminiert.
Die Auswertung erfolgt anhand der berechneten Rf-Werte (Kap. 3.3.4.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.6. dargestellt.
Tabelle 4.6. Rf-Werte der verschiedenen Eichelfraktionen (Pro Lauf sind die deutlich erkennbaren Banden gemessen und deren Rf-Werte berechnet)
Lauf H2O MeOH Hexan Toluol Chloroform
1 0,775 0,975 0,775 0,8625
Tabelle 4.7. Rf-Werte der Vergleichssubstanzen
0,975 0,975 0,75 0,975 0,9875 0,9875 0,975
Im Bereich der getrennten Polyphenole der Probe traten noch weitere störende fluoreszierende Flecken auf. Somit war es nicht möglich, eine eindeutige Identifikation durchzuführen. Aus diesem Grund wurde die Dünnschicht-chromatographie nicht weiter optimiert. Es wurde darauf verzichtet, die Ergebnisse statistisch abzusichern. Bei Betrachtung der Abbildung 4.3. wird die Schwierigkeit deutlich.
Abbildung 4.3. Beispielchromatogramm der Dünnschichtchromatographie
1 – Methanol-Extrakt, 2 – Kaffeesäure, 3 – Ellagsäure, 4 – Vanillinsäure,
5 – Hexan-Extrakt, 6 – Ethanol-Extrakt, 7 – Methanol-Extrakt, 8 – Methanol-Extrakt, 9 – Gallussäure, 10 – Chlorogensäure, 11 – Catechin
Eine Möglichkeit zur Verbesserung dieser Analysenart ist die Verwendung von Enzymen. Bisher gelang es zwar, durch den Zusatz von Tannase einige Banden deutlicher darzustellen, aber eine optimale Probenauftrennung für die Dünnschichtchromatographie konnte nicht erreicht werden.
Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie wurde aus den oben aufgeführten Gründen zugunsten der HPLC eingestellt.
Fließmittelfront
Startpunkt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
4.4. Ergebnisse aus der HPLC
4.4.1. Wiederfindungsrate, Nachweis–, Erfassungs– und Bestimmungsgrenze
Die durchschnittlichen Wiederfindungsraten der wichtigsten Vergleichssubstanzen sind in Tabelle 4.8. aufgeführt. Die hier angeführten Wiederfindungen stellen Mittelwerte aus sechs unabhängig voneinander durchgeführten Analysen dar.
Die gewählten Referenzsubstanzen zeigten unterschiedliche Wiederfindungsraten.
Bei der Betrachtung der einzelnen Polyphenole wird ersichtlich, dass für Gallussäure mit durchschnittlich 94,7 % die höchste Wiederfindung erzielt wurde. Die komplexen Strukturen der verschiedenen Polyphenole reagierten unterschiedlich auf die
Probenaufbereitung. So erzielte Ellagsäure eine Wiederfindung von nur 43,6 %.
Tabelle 4.8. Wiederfindungsraten verschiedener Polyphenole (n = 6), aus Vergleichssubstanzen nach SPE und HPLC-UV
Die in der Literatur angegebenen Wiederfindungsraten verschiedener Polyphenole betragen zwischen 80 und 90 %, variieren allerdings je nach Literaturquelle mehr oder weniger stark. Dies ist in Abhängigkeit zur Probenaufbereitung und der durchgeführten Probenanalyse zu setzen und ist damit für jede Methodik individuell (SIMON et al. 1990).
Die Nachweisgrenze des Analysenverfahrens wurde durch die Höhe des Detektorrauschens (Störpegel) bestimmt. Sie stellte damit die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode dar. Die Nachweisgrenze ergab sich aus dem Mittelwert des Untergrundsignals und aus einem Vielfachen des Störpegels. Diese Größe wird in der Literatur auch durch das Signal/Rausch-Verhältnis ausgedrückt.
Tabelle 4.9. Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze
Substanz Nachweisgrenze
Damit zeigten die eingesetzten Detektoren eine gute Selektivität, bei der Blindwerte nicht vom Grundrauschen zu unterscheiden waren, so dass die Erfassungsgrenze
geraden abgeleitet wurde. Die Erfassungsgrenze entsprach der doppelten und die Bestimmungsgrenze der dreifachen Nachweisgrenze (Tab. 4.9.).
4.4.2. Extraktion des Probenmaterials
Die Extraktion des Ausgangmaterials erfolgte in 3 Arbeitsschritten mit Methanol (vgl.
Kap. 3.3.1.1.). Durch anschließende Extraktion mit Ethanol und danach mit Wasser (jeweils weitere 3 Arbeitsschritte) wurde die Effektivität überprüft. Dafür wurde der verbleibende Eichelrückstand nacheinander mit den drei Lösungsmitteln extrahiert.
Dabei wurde nur noch ein geringer Polyphenolgehalt herausgelöst. Nur die Extraktion mit Methanol erzielte ausreichende Polyphenolgehalte, die für die weitere Probenverarbeitung ausreichend waren.
Die im Rahmen dieser Arbeit zur Aufreinigung und anschließender Aufkonzentrierung der Proben verwendete Festphasenextraktion wurde durch Variation des Säulenmaterials sowie der Vorkonditionierungs-, Wasch- und Elutionsbedingungen (Volumina- und Lösungsmittelvariationen) zu den in Kap.
3.3.2.2. beschriebenen Bedingungen optimiert. Die in der Literatur beschriebenen SPE mit C-18-Phasen ergaben hohe Wiederfindungsraten (Tab. 4.8.) für die Polyphenole.
Nach der SPE stellte sich der Extrakt von unbehandelten Eicheln klar, gelb bis bräunlich dar. Je nach Probenart kann der Extrakt auch hellgelb, leicht grünlich oder rötlich sein.
Wie bereits SIMON et al. (1990) gezeigt haben, ist eine gelungene Auftrennung sowie eine hohe Wiederfindung unmittelbar von der Extraktionsmethode abhängig.
Besonders empfindlich reagieren Dimere und Trimere von Catechin und die Ester der Hydroxyzimtsäuren (instabil). Vor diesem Hintergrund galt es für das komplexe Polyphenolgemisch in den Eicheln das optimale Extraktionsmittel zu finden.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Zeit (min) Absorbance (mV)
Abbildung 4.4. Vergleich der einzelnen Fraktionen von normalen Eicheln; HPLC-UV;
(1) – EtOH – Fraktion, (2) – MeOH – Fraktion, (3) – H2O - Fraktion
Der Vergleich der Chromatogramme in Abbildung 4.4. zeigt deutlich, dass nach der Fraktionierung mittels SPE mit Ethanol, Methanol und abschließend mit Wasser, bereits in der ersten Ethanol-Fraktion über 98 % der interessierenden Polyphenole enthalten waren und mit den folgenden Fraktionen nur noch wenige Substanzen von der Festphase gelöst werden konnten.
Die Gehalte nahmen bei jedem Fraktionierungsschritt ab. Nach der erfolgten Fraktionierung (vgl. Kap. 3.3.1.2.) mit Ethanol wurden weitere Fraktionen mit Methanol und anschließend Wasser (jeweils 3 Arbeitsschritte wie in Kap. 3.3.1.2.
dargestellt) von der Festphase gelöst. Mit Methanol und Wasser konnten nur noch geringe Polyphenolgehalte aufgenommen werden. Nur die Ethanol-Fraktion erzielte ausreichende Polyphenolgehalte, die für die weitere Probenverarbeitung ausreichend hoch waren.
(1) (2) (3)
Der Durchlauf nach Auftragen des Probenmaterials auf die konditionierte Festphase wurde auf den Gehalt an Polyphenolen überprüft. Die für diese Arbeit wichtigen Peaks konnten im Durchlauf nicht reproduziert werden, d. h. alle zu untersuchenden Polyphenole waren zunächst auf der Festphase gebunden. Dass sie auch nahezu vollständig in der Ethanol-Fraktion enthalten sind, wurde überprüft, in dem die Menge des Ethanols zum Eluieren bestimmt wurde. Bei verschiedenen Ethanolmengen wurden Chromatogramme erstellt, die zeigten, dass 4 mL Ethanol ausreichen.
Außerdem stieg der Gehalt der Polyphenole in der nachfolgenden Methanolfraktion an, wenn die Ethanolmenge sank. Allerdings waren die Gehalte im Methanoleluat gleichbleibend bei 4, 5 und 6 mL Ethanol.
Bereits die Färbungen der drei verschiedenen Fraktionen unmittelbar nach der Festphasenextraktion sowie nach der Konzentration mittels Rotationsverdampfer ließen auf deutliche Unterschiede an nachweisbaren Polyphenolen schließen.
Um sicher zu gehen, dass mit dem Waschschritt (Hexan) nicht wichtige Polyphenole wieder von der Festphasensäule gespült wurden, war auch dieser Durchfluss untersucht worden. Dabei zeigte sich, dass die im Hexan enthaltenen Polyphenole sehr gering bzw. nicht nachweisbar waren.
Während der Optimierung der gesamten Extraktion zeigte sich, dass die mehrfache Extraktion von identischen Eichelproben nur für den ersten Extraktionsschritt auswertbare Ergebnisse lieferte. Die folgenden Extraktionsschritte mit Methanol und Wasser (vgl. Abb. 4.3.) wurden aus der Zusammenstellung der Ergebnisse und der Bewertung aus oben aufgeführten Gründen herausgenommen.
4.4.3. Identifizierung mittels HPLC-UV
Ziel der qualitativen Analyse mittels HPLC war es, Substanzen zu identifizieren. Die Charakterisierung erfolgte zunächst anhand der Retentionszeit der in einem Chromatogramm enthaltenen aufgelösten Peaks. Die Retentionszeit einer Substanz
an einer Säule und einem gegebenen Fließmittel ist für jede Substanz charakteristisch.
Bei der hier vorgestellten Methode wurde als stationäre Phase eine neuartige monolithische Säule verwendet, die aufgrund ihres einzigartigen Aufbaus und der biporösen Struktur aus hochreinem Silicagel eine deutlich bessere Auftrennung von komplexen Polyphenolgemischen wie das aus Eichelextrakten erzielen kann.
Diese neue stationäre Phase besitzt gegenüber üblichen RP-18-Säulen bessere Trenneigenschaften, gute Säurestabilität und ein günstigeres Druckverhalten. Der Vergleich zwischen der Trennung der Eichelextrakte mit der neuen Säule und publizierten Methoden (BARAN und SCHWEDT 1992, CANTOS et al. 2003, MEYERS et al. 2006) oder der zuvor verwendeten Methode zeigte eine deutlich verbesserte Trennung (Abb. 4.5.).
Um in der Analytik der Eichelpolyphenole Ergebnisse zu erzielen, die reproduzierbar und einfach zu interpretieren sind, kam der Gradientenlauf zum Einsatz. Mit dieser Methode war der Großteil der Peaks deutlich Basislinien-getrennt. Die anfängliche
„Anhäufung“ von Probenmaterial in der Mitte des Chromatogramms hatte sich mit Fortschreiten der Methodenentwicklung allmählich aufgelöst.
Mit dem verwendeten Wasser/Methanol-Gradienten konnte innerhalb von 45 min eine gute Trennung der wichtigsten Polyphenole erreicht werden. Dabei war der pH-Wert wichtig, denn je höher dieser pH-pH-Wert war, desto breiter und damit schlechter auswertbar wurden vereinzelte Peaks. In der Literatur wird dieses Phänomen v. a. für Anthocyane beschrieben (RECHNER 2000).
Ein weiteres Ziel der Methodenentwicklung war die Erhöhung der Empfindlichkeit und der Selektivität. Dies konnte durch die Kombination von UV und DAD erreicht werden. Durch Kombination einer UV-Detektion mittels DAD konnten so in einem Analysenlauf bei höherer Empfindlichkeit mehr Daten über die einzelnen Polyphenole der analysierten Probe gewonnen werden. Allerdings sind die Daten aus dem UV-Spektrum mittels DAD häufig nicht ausreichend aussagekräftig gewesen. Aufgrund nahezu identischer UV-Spektren konnten beispielsweise Procyanidine sowie Oligo- und Polymere der Flavan-3-ole Catechin und Epicatechin mit diesen zur Verfügung stehenden Mitteln nicht eindeutig unterschieden werden.
Ein weiteres, nicht zu unterschätzendes Problem der Polyphenolanalytik war auch das Fehlen von Vergleichssubstanzen, die als Referenz dienen könnten. Für die Retentionszeit zwischen 21 und 27 Minuten (entsprechend Peak 10 – 16, Abb. 4.4.) lagen keine Referenzsubstanzen vor.
Für die Untersuchungen standen normale (unbehandelte) Eicheln, thermisch getrocknete Eicheln sowie Eichelsilage zur Verfügung. Diese Proben unterschieden sich deutlich im Zerkleinerungsgrad, aufgrund der Verarbeitung aber auch optisch und olfaktorisch.
Die Eichelproben wurden nach dem beschriebenen Extraktionsverfahren (Kap.
3.3.2.) aufgearbeitet und nach der in Kap. 3.3.4.2. beschriebenen HPLC-Methode mit Gradientensystem analysiert.
Abbildung 4.5. Chromatogramm des Gradientenlaufs von ganzen Eicheln
Bei Betrachtung der Abbildung 4.5. stellt sich dar, worin die Schwierigkeiten der Auftrennung des Probenextraktes bestehen. Im Gegensatz zu dem hier dargestellten Gradientensystem wurde beim Einsatz der isokratischen Methode der Probenextrakt nicht Basislinien-getrennt. Aus diesem Grund wurde die Methode nicht angewendet und die zugehörigen Messungen flossen nicht in die Ergebnisse mit ein. Diese
Methode war allerdings für das Verständnis der Methodenentwicklung wichtig und ist daher in dieser Arbeit mit aufgeführt.
Tabelle 4.10. Identifizierung der Inhaltsstoffe von normalen, reifen Eicheln mit Darstellung der gewählten Methode
Rel. Ret.Zeit = Berechnete Retentionszeit ab Einspritzpeak
UV = UV-Spektrenvergleich; Ret. = über Retentionszeitenvergleich;
Add. = Additionsverfahren; * abweichendes UV-Spektrum
3 12,228 Vanillinsäure UV, Ret., Add.
4 13,310 Catechin UV, Ret., Add.
5 15,881 Chlorogensäure UV, Ret., Add.
6 16,529 Salicylsäure UV, Ret., Add.
7 16,922 nicht identifiziert
8 17,455 p-Cumarsäure UV, Ret., Add.
9 19,497 Hydroxybenzoesäuremethylester UV, Ret.
10 21,500 nicht identifiziert
17 30,156 Quercetin-galactosid UV, Ret., Add.
18 31,314 Quercetin-glycosid UV, Ret., Add.
19 31,958 nicht identifiziert
20 33,653 Ellagsäure UV, Ret., Add.
21 36,018 Rutin UV, Ret.
22 36,552 Naringenin UV, Ret., Add.
23 37,036 Quercetin UV, Ret., Add.
Durch die mangelnden Literaturangaben zu Eichelinhaltsstoffen wurden bisher hauptsächlich Substanzen aus Analysen ähnlicher Pflanzen und Pflanzenteile als Referenzsubstanzen verwendet. Dazu gehören unter anderem Gallussäure, Ellagsäure und p-Cumarsäure.
Tabelle 4.11. Identifizierung der Inhaltsstoffe von thermisch getrockneten Eicheln mit Darstellung der gewählten Methode
Rel. Ret.Zeit = Berechnete Retentionszeit ab Einspritzpeak;
UV = UV-Spektrenvergleich; Ret. = über Retentionszeitenvergleich;
Add. = Additionsverfahren;* abweichendes UV-Spektrum
Add. = Additionsverfahren;* abweichendes UV-Spektrum