4. Ergebnisse
4.6. Ergebnisse aus der HPLC-MS/MS
4.6.1. Identifikation der Eichelproben mittels HPLC-MS/MS
Die Hauptbestandteile der verschiedenen Eichelextrakte konnten durch Vergleich der Fragmentierung mit publizierten Daten (Tab. 4.26.) als Gallussäureglucoside (Verbindungen zwischen Gallussäure und Glucose) und Quercetinglucosid (das Flavonoid Quercetin, welches mit Glucose verknüpft ist) sowie Quercetinglucuronid (mit Glucuronsäure verknüpft) identifiziert werden.
Weiter konnten die mit der HPLC-UV identifizierten Substanzen wie Ellagsäure, Catechin und Quercetin (Tab. 4.27.) bestätigt werden. Damit erweitert sich die Liste der von CANTOS et al. (2003) identifizierten Eichelinhaltsstoffe. Die Autoren untersuchten die Eicheln von Q. ilex, Q. rotundifolia und Q. suber und wiesen verschiedene Gallussäurederivate und Ellagsäurederivate nach.
Übersicht 4.4. Auflistung der Literaturstellen, die für die Identifizierung von Eichelinhaltsstoffen und deren Metaboliten im Harn mittels HPLC-MS/MS herangezogen wurden;
unterteilt in Arbeiten, bei denen entweder pflanzliches Ausgangsmaterial oder Harnproben untersucht worden sind CANTOS et al. 2003 Quercus ssp. Eicheln
-SCHLESIER 2002 Tee
-MEYERS et al. 2006 Tanoak Eicheln
-MÄMMELÄ et al. 2000 Eichenstaub
-PAREJO et al. 2004 Tagetes maxima
-QU et al. 2001 Erigan breviscapus
-ESPIN et al. 2007 - Ellagitanninen nach
Eichelfütterung (Schwein)
MULLEN et al. 2004 - Flavonoide nach
Aufnahme von roten Zwiebeln (Humanstudie)
SANG et al. 2008 - Polyphenole nach Konsum
von Tee (Humanstudie)
Bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eichelproben handelt es sich um Eicheln der Arten Q. robur, Q. petraea und Q. rubra. Bei den unbehandelten Eicheln konnten ebenso Gallussäure ([M – H]- bei m/z 169), Galloylester von Glucose, Tergalloyl-O- und C-Glucoside ([M – H]- bei m/z 631 bzw. m/z 613),
Digalloyl-hexahydroxydiphenoyl-glucose ([M – H]- bei m/z 785) sowie Ellagsäure ([M – H]- bei m/z 301) und deren Derivate detektiert werden (Tab. 4.20.).
Zusätzlich wurde Quercetin und seine Glucosid-Derivate detektiert. Weiter wurden Verbindungen zwischen Gallussäure und Catechin nachgewiesen. Die Galloyl-Glucose-Ester sind unterschiedliche Isomere von Galloyl-Glucose, Digalloyl-Glucose, Trigalloyl-Glucose, Tetragalloyl-Glucose und Pentagalloyl-Glucose.
Tabelle 4.20. zeigt eine Übersicht über die Molekülmassen und typische, zu erwartende Fragmente von verschiedenen Polyphenolen. Bei niedriger Fragmentorspannung erhält man v. a. den Molekülpeak und nur wenige Fragmente, bei höherer Spannung (in diesem Fall 50 V) dagegen ein größeres Fragmentierungsmuster, eventuell unter Verlust des Molekülpeaks.
Tabelle 4.20. Typische Massen der verschiedenen Eichelproben
u. E. = unbehandelte Eicheln; th. g. E. = thermisch getrocknete Eicheln;
E.s. = Eichelsilage; Comp. = in der Literatur mit gleichen Fragmenten angegebene Verbindungen ohne Zuordnung; n.i. = nicht identifiziert; 1 – CANTOS et. al. (2003);
2 – MÄMMELÄ et al. 2000; 3 – MEYERS et al. (2006); 4 – SCHLESIER (2002)* - mit
X Monogalloylglucose 331 271, 211, 169 1, 2
X X Comp. III 347 303, 241 2
X n.i. 373 343,313
X X Valonsäure Dilacton -COO 425 301, 299, 367 1, 2
X X X Ellagsäurepentosid 433 365, 301 1, 3
X X X Quercetin 447 301, 300 2, *
X X X Quercetinglucosid 463 404, 301, 300 *
X X X Digalloylglucopyranose 483 451, 415, 301 1
X Comp. IV 487 271, 211 2
Verbindung [M– H]- Fragmente
X Gallocatechin dimer 593 285 2
X X
Dehyd.
glucosid 613 595, 523, 493, 301 1
X n.i. 615 525, 495
X n.i. 623 575, 555, 507
X n.i. 625 301
X Tergalloyl-o-glucosid 631 451, 301, 571, 188 1, 3 X
Galloyl HHDP
glucopyranose 633 463, 301 2
X X X Trigalloylglucose 635 483, 465, 313 1
X Comp. VI 639 487 2
diphenoylglucose 785 633, 483, 482, 419, 301 1
X X X Tetragalloylglucose 787 635, 617, 465 1
X n.i. 787 631, 469, 169
X Castalagin 933 631 2
X X X Pentagalloylglucose 939 787, 769, 617 1, 3
X n.i. 941 770, 618
Die Ergebnisse werden in Kapitel 5.6. in Bezug auf die Strukturklärung diskutiert.
Die Strukturformeln der wichtigsten Verbindungen sind in Abbildung 2.3.
(Gallussäure), Abb. 2.4. (Ellagsäure), Abb. 2.8. (Gallotannin = Trigalloylglucose), Abb. 4.12. (Castalagin) und im Anhang 8.12. dargestellt.
Die Massenspektren der Eichelfutterproben sind im Anhang 8.12. aufgeführt. In Anhang 8.12.1. folgen die Massenspektren ausgewählter Eichelinhaltsstoffe. Anhang 8.12.2. enthält die Massenspektren der Harnproben, sowie die einzelnen Massenspektren der identifizierten Metaboliten. Ergänzend sind in Anhang 8.12.3.
weitere Strukturformeln aufgeführt.
In Abbildung 4.13. ist das Massenspektrum für Castalagin dargestellt, in der Abbildung 4.12. die dazugehörige Strukturformel. Die [M – H]- 933 (m/z) bringt die Fragmente (m/z) 783 und (m/z) 633, diese entstanden durch Abspaltung jeweils
eines Galloylrests unter Verbrauch von Wasser, wie in Abbildung 4.12. dargestellt.
Als Resultat lag die (m/z) 169 vor, was bei negativer Ionisation der Masse von Gallussäure entspricht. Die Identifizierung erfolgte über das Fragmentierungsmuster von MÄMMELÄ et al. (2000).
Abbildung 4.12. Castalagin ([M – H]- 933) und mögliche Fragmentierung
Abbildung 4. 3. Massenspektrum zu [M – H]- 933 Castalagin
[M –H]- 783
Damit gelang es, die Eichelinhaltsstoffe (Q. ilex, Q. rotundifolia, Q. suber), die von CANTOS et al. (2003) charakterisiert wurden, um das in Q. ruber enthaltene Castalagin zu ergänzen. Weiter wurde in thermisch getrockneten Eicheln Catechin ermittelt, welches CANTOS et al. (2003) in ihren Eichelproben nicht fanden.
Die von CANTOS et al. (2003) analysierten Inhaltsstoffe (in unbehandelten Eicheln) konnten nicht alle in den hier untersuchten unbehandelten Eicheln nachgewiesen werden, sind aber in den behandelten Eichelproben detektierbar. Deshalb ist davon auszugehen, dass sie auch in den unbehandelten vorhanden sind, nur aufgrund der geringen Stichprobenzahl nicht nachgewiesen werden konnten.
Unter Betrachtung der identifizierten Verbindungen der einzelnen Eichelfutterproben zeigt sich, dass thermisch getrocknete Eicheln weniger Glucosid-Verbindungen aufweisen, als Eichelsilage oder unbehandelte Eicheln. Eichelsilage hingegen zeigt ein größeres Spektrum an Estern der Galloyl-Glucose.
4.6.2. Untersuchung der Harnproben mittels HPLC-MS/MS
Nach Fütterung mit Eicheln konnten im Harn der Schweine verschiedene Metabolite detektiert werden. Durch die massenspektrometrischen Analysen konnten Quercetinmetaboliten und Urolithin A-glucosid nachgewiesen werden. Nach der Aufnahme von Ellagsäure entstehen verschiedene Urolithine (ESPIN et al. 2007). In den vorliegenden Harnproben konnte nur das Urolithin A nachgewiesen werden (Abb. 4.14.).
Die Hauptmetaboliten sind Glucuron-Konjugate und Glucosid-Verbindungen, innerhalb der Fragmentierungsmuster stellten sich vereinzelt auch Sulfatabspaltungen und Methylgruppen dar (vgl. Abb.4.14., Strukturformeln, Spektren sind im Anhang 8.12.).
In parallel laufenden Untersuchungen zum Metabolismus von Polyphenolen bei Schweinen konnte gezeigt werden, dass die Methylierung bei erhöhter
Polyphenol-Zufuhr zunimmt. Bei normal gefütterten Schweinen findet sie nicht oder nur in sehr geringem Umfang statt. Diese Ergebnisse sind Teil von durchgeführten Untersuchungen anderer Autoren, sie sind noch nicht abschließend veröffentlicht worden.
Abbildung 4. 14. Ellagsäure und deren Metabolit Urolithin A
In Tabelle 4.21. sind Ergebnisse der HPLC-MS/MS-Analyse in Abhängigkeit von der Futtermenge an Eicheln pro Tag und von der Dauer aufgeführt. Dabei wurden nur Massen und deren Fragmente berücksichtigt, die bei den Kontrolltieren der gleichen Fütterungsreihe nicht nachzuweisen waren.
Nach einer Fütterungszeit von 24 Stunden traten im Harn Massen auf, die bei normal gefütterten Schweinen nicht auftraten. Dies stimmt mit den von ESPIN et al. (2007) angegebenen Ausscheidungsmaxima (24 – 48 Stunden) überein. Allerdings waren nur drei dieser Massen bei längerer Fütterung von gleicher oder höherer Menge an Eicheln auch detektierbar. Die Ionen bei (m/z) 239 und (m/z) 403 waren sowohl bei Fütterung von 100 g als auch bei 4 kg pro Tag bereits nach 24 Stunden über einen längeren Fütterungszeitraum im Harn nachweisbar, nicht aber bei den Kontrolltieren.
Dahingegen war (m/z) 320 nur bei geringer Fütterungsmenge detektierbar, und wurde bei den mit 4 kg Eicheln gemästeten Schweinen nicht aufgefunden.
Die Massen, die im Harn der mit wenig Eichelschrot (100 g/d) gemästeten Schweine detektiert werden konnten, stellten sich im Harn von Schweinen der 4 kg-Eichelmast nicht dar, mit Ausnahme von [M – H]- 385 und [M – H]- 829 (vgl. Anhang 8.12.).
Betrachtet man die Fragmente, traten die [M – H]- mit m/z 176 hervor, eine Glucuronid-Einheit, die abgespalten wird. Aufgrund des Stoffwechsels bei
Ellagsäure Urolithin A
Schweinen, bei denen auszuscheidende Verbindungen über Glucuronsäure gebunden werden, war das Fragment m/z 176 auch bei den Kontrolltieren auffindbar.
Charakteristisch für die Eichelfütterung sind hingegen die Fragmente (m/z) 169 ([M – H]- Gallussäure) und (m/z) 301 ([M – H]- Ellagsäure). Darauf wird in Kapitel 5.7.
eingegangen.
Tabelle 4.21. Im Harn der Schweine detektierbare Polyphenole und ihr Fragmentierungsmuster 24 h > 24 h [M– H]- Fragmente Harn detektierten Massen durch Eichelfütterung bedingt wurden oder durch die Umsetzung des Grundfutters.
Des Weiteren ermöglicht die Bindungsstelle der Glucoside oder Glucuronide eine ganz unterschiedliche Fragmentierung eines jeden Metaboliten.
O
Identifiziert über Fragmentierungsmuster von MULLEN et al. (2004), die Autoren analysierten menschlichen Urin nach (gesteigerter) Aufnahme von roten Zwiebeln
Im Abgleich mit der Literatur (ESPIN et al. 2007, MULLEN et al. 2004, SANG et al.
2008, PAREJO et al. 2004; vgl. Tab. 4.26.) konnten folgende Stoffe eindeutig anhand der Masse und der charakteristischen Fragmentierung identifiziert werden:
Quercetinsulfat zeigte sich mit [M – H]- bei m/z 381 und dem Tochterion bei m/z 301 ([M – H]- -80, Verlust der Sulfatgruppe SO3). Quercetin-3-glucosid produzierte [M – H]- 463, ebenfalls mit einem Tochterion mit m/z 301 (Quercetin) unter Abspaltung einer Glucose-Einheit ([M – H]- -162). Quercetagetin-7-O-glucosid (Quercetagetrin) hatte die [M – H]- 479, das Fragment lag bei m/z 317 ([M – H]- -162, Verlust einer Glucose-Einheit). Außerdem konnte Urolithin A-diglucuronid ([M – H] -579) anhand seiner Fragmente m/z 403 ([M – H]- -176, Glucuronid-Einheit), m/z 227 ([M – H]- -352, 2 Glucuronid-Einheiten) und m/z 175 (Glucuronid-Einheit – H)
Abbildung 4.16. Strukturen von Urolithin A-diglucuronid (identifiziert durch Daten von ESPIN et al.
(2007)) und Quercetagetin-7-O-glucosid (identifiziert durch Daten von PAREJO et al.
5. Diskussion
In dieser Arbeit wurden die Inhaltsstoffe von deutschen Eicheln bestimmt und erstmalig verschiedene Verarbeitungen der Eicheln als Futtermittel mit Hinblick auf ihre polyphenolischen Inhaltsstoffe miteinander verglichen. Neue Erkenntnisse lieferten auch die Untersuchungen der verschiedenen Reifegrade der Eicheln.
Einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Metabolisierung von Polyphenolen stellen die Untersuchungen der Harnproben mit Eicheln gefütterter Schweine dar. Bei den Harnanalysen wurden verschiedene Fütterungsversuche unterschiedlicher Dauer und mit unterschiedlichen Futtermengen gegenübergestellt.
Obwohl Eicheln lange Zeit in der Humanernährung in Deutschland nur als kostengünstiger Nahrungsmittelersatz dienten, werden sie auch heute noch besonders im Mediterranen Raum verwendet. In einigen Studien werden sie als Lieferant von Ellagsäure diskutiert, die u. a. als Antioxidans wirkt. Allerdings wachsen in vielen südlichen Ländern vorrangig Eichenarten, deren Inhaltsstoffe qualitativ und quantitativ nicht zwingend identisch mit denen der deutschen Eichenarten sind.
Bereits der Geschmack weist darauf hin, er wird bei Q. ilex Eicheln als herb beschrieben, während deutsche Eicheln stark bitter schmecken.
In Anlehnung an die Eichelmast von vor 150 Jahren werden wieder vermehrt Schweine mit Eicheln gemästet. Die Renaissance des Eichelschinkens führt in Deutschland nicht nur zum Wiederaufleben der Weidemast. Angepasst an die Vorschriften, Hygienebedingungen und individuellen örtlichen Gegebenheiten wird zusätzlich versucht, durch die Stallmast mit Eicheln ebenso hochwertige Eichelfleischprodukte zu erzielen. Durch die Eichelmast und eine Reifung von fünf bis sechs Monaten bildet sich ein typisch feinherbes Eichelaroma in Rohschinken und Rohwürsten aus.
Mit einer Eichelmast über mindestens einen Monat mit insgesamt annähernd 100 kg Eicheln pro Schwein können Spezialitäten erzeugt werden, die eine deutliche Qualitätszunahme (Geschmack, Konsistenz, Lagerfähigkeit) aufweisen. Daraus
stehen für die Fleischwirtschaft höhere Erträge in Aussicht, da eine deutlich steigende Nachfrage durch die Verbraucher besteht.
Mit dem Ziel dieser Nachfrage gerecht zu werden, muss eine Verarbeitungsmöglichkeit der Eicheln gefunden werden, die neben wirtschaftlichen Aspekten auch die nutritiven Vorgaben für das Endprodukt erfüllt.
5.1. Untersuchungen zu Eichelpolyphenolen
Erste grundlegende Untersuchungen über phenolische Substanzen in Früchten gehen auf KELHÖFER (1908) und FISCHER (1919) zurück. Lange Zeit standen keine geeigneten Analysemethoden zur Bestimmung und Trennung der Polyphenole zur Verfügung. Ältere halbquantitative Aussagen über die Gehalte an Polyphenolen, basierend auf kolorimetrischen Bestimmungen, besitzen aufgrund der großen Reaktionsvielfalt der Polyphenole nur eine beschränkte Aussagekraft (SPANOS und WROLSTAD 1990, HERRMANN 1993, RITTER 1994).
5.2. Dünnschichtchromatographie
Die Möglichkeiten der Dünnschichtchromatographie sind in der durchgeführten Arbeit nicht vollkommen ausgeschöpft worden. Durch geeignete Probenvorbereitung und möglicherweise zweidimensionale Dünnschichtchromatographie können die Ergebnisse verbessert werden.
Bei der zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie wird nach dem Einsatz eines Laufmittels die Platte um 90° gedreht und dem gleichen oder auch einem anderen Laufmittel ein weiteres Mal ausgesetzt.
Der Vergleich der Tabelle 4.6. mit den Rf-Werten der Vergleichssubstanzen aus Tabelle 4.7. zeigt deutlich die Schwierigkeit der Identifikation der Eichelinhaltsstoffe
ausschließlich mittels der Dünnschichtchromatographie. Bereits die Auswertung der Vergleichssubstanzen erwies sich als kompliziert, da gleiche Rf-Werte sowie ähnliche Extinktionen (Kap. 3.3.4.) auftraten und die Interpretation von Eichelproben mit dieser Durchführung nahezu unmöglich machten. Die Unterscheidung einiger einzelner Vergleichssubstanzen, führte bereits zu Problemen, da diese aufgrund ähnlicher Polarität gleiche Retentionszeiten hatten.
Mit den aus der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnissen kann man einerseits Vergleichssubstanzen wählen, die in der eindimensionalen und zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie schnelle und zufriedenstellende Analysen von verschiedenen Eichelextrakten ermöglichen und andererseits vergleichende Untersuchungen verschiedener Eichelproben anfertigen.
Steht für die Untersuchung von Eichelextrakten oder anderen komplexen Polyphenolgemischen nur die Dünnschichtchromatographie zur Verfügung, so kann zum einen versucht werden, das Fließmittel zu verändern. Dabei scheint die Polarität von etwa 4,76 als Ausgangsbasis für die Zusammensetzung gut zu sein.
Zum anderen ist es möglich, die Extraktion zu verbessern. Dabei ist unbedingt zu beachten, dass mit weiterer Aufreinigung nicht auch wesentliche Bestandteile entfernt bzw. deren Anteil vermindert werden.
5.3. HPLC
Es wurden bereits verschiedene chromatographische Techniken für diese Substanzen entwickelt. Dabei stellt sich die HPLC als die geeignetste dar. Diese hat eine hohe Sensitivität und eine größere Effizienz als die DC. Die gewählte Säule (Chromolith®) ermöglicht im Vergleich zu einer herkömmlichen RP-C18 Säule eine schnellere Separation der phenolischen Inhaltsstoffe. Wie schon CASTELLARI et al.
(2002) zeigten, kann mit dem Einsatz dieser Säule durch die besseren chromatographischen Eigenschaften die Detektion der Eichelinhaltsstoffe wesentlich verbessert werden. Durch die größere Oberfläche (Makro- und Mesoporen) als bei
herkömmlichen Säulenmaterial können auch Verbindungen mit ähnlichem chromatographischen Verhalten (Retentionszeit) von einander getrennt werden.
Gleichzeitig kann durch die höhere Flussrate die Analysenzeit verkürzt werden.
Bei der Analyse der Inhaltsstoffe mittels HPLC-UV und DAD wird in normalen, unbehandelten Eicheln ein großes Spektrum verschiedener Polyphenole identifiziert (Kap. 4.3.). Trotz ähnlicher Retentionszeiten und insgesamt ähnlicher UV-Spektren können die in normalen Eicheln detektierten Polyphenole nicht in gleicher Form auch in thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage analysiert werden (Tab. 4.10., 4.11., 4.12., Kap. 4.3.) . In den verarbeiteten Eichelfutterproben stellen sich dagegen einige freie Polyphenole deutlicher dar als in den Proben der unbehandelten Eicheln.
Durch thermische Aufspaltung und fermentative Prozesse kommt es zu Veränderungen an den Makromolekülen und der Zunahme einzelner Polyphenole.
Diese sind über die Vergleichssubstanzen identifizierbar, wie z. B. bei Kaffeesäure und Zimtsäure. Die strukturelle Ähnlichkeit mit Chlorogensäure lässt vermuten, dass von der Chlorogensäure während des Verarbeitungsprozesses der C6-Ring mit Carboxylgruppe abgespalten wird. Somit lässt sich Chlorogensäure in unbehandelten Eicheln darstellen, in den verarbeiteten Eichelproben hingegen nicht. Dafür sind in den verarbeiteten Eichelproben die Abbauprodukte Kaffeesäure und Zimtsäure (- 2 OH-Gruppen) detektierbar.
Auch wenn nach interner Standardisierung (Addierung eines Standards zur Probe) ein Peak identifiziert scheint, ist dennoch nicht klar, ob die chemische Verbindung in der Probe und im Standard identisch ist. Die Ergebnisse können durch einen Abgleich des UV-Spektrums (DAD) oder der Massenspur eines Massenspektrometers gestützt werden. Weitere Sicherheit gibt auch die Experimentdurchführung unter zwei unterschiedlichen Trennbedingungen (unterschiedliche Säulen und/oder unterschiedliche mobile Phasen).
Außerdem ist die Intensität, gemessen in Millivolt, nicht bei jeder Substanz gleich groß, abhängig von der Detektionswellenlänge und dem UV-Maximum der jeweiligen
Substanz. So kann eine Substanz zwar in höherer Konzentration in der Eichelprobe enthalten sein und damit einen hohen Gesamtphenolgehalt ausmachen. Bei der gewählten Wellenlänge (280 nm) sind nicht alle Verbindungen optimal detektierbar und daher wird der Gehalt der Polyphenole über die Wiederfindungsrate in der Ursprungsmenge berechnet.
Wie bei CONDE et al. (1995) werden die Eichelproben bei 280 nm gemessen (Optimum für Catechine, Proanthocyanidine, Flavanone und Dihydroflavonole).
Diese Wellenlänge ist in Bezug auf die Eichelextrakte gut gewählt, was sich durch den Vergleich der UV-Maxima unter Einsatz des DAD (Tab. 4.13., 4.14., 4.15.) bestätigt. Für verarbeitete Eicheln ist diese Wellenlänge allerdings nicht ausreichend, besonders Eichelsilage zeigt mit einem durchschnittlichem UV-Maxima von 300 nm prägnante Veränderungen der UV-Aktivität der Inhaltsstoffe.
Noch steht nicht fest, ob sich die gefundenen Unterschiede in verschiedenen Eichelfutterarten auch zu anderen Sammelzeitpunkten oder in unterschiedlichen Eichelarten evt. sogar in Abhängigkeit zur Sonneneinwirkung während der Reife bestätigen lassen. Allerdings sind die Unterschiede groß genug, dass sie mit Sicherheit festgestellt werden können.
Nach CANTOS et al. (2003) haben Eicheln von Q. ilex den höchsten Gehalt an Polyphenolen. Hier kommt man auf >2 g Phenole/ kg Eicheln. Nimmt man eine Gesamtmenge von 7 bis 10 kg Eicheln, die ein Schwein maximal pro Tag fressen kann, entspricht dies einer aufgenommenen Menge von 14 bis 20 g Polyphenolen pro Schwein täglich. Die Summe liegt bei Q. rotundifolia bei ~1,5 g/kg Eicheln und noch geringer bei Q. suber bei <0,5 g/kg Eicheln.
Die in Tabelle 5.1. aufgeführten Daten weichen vom Gesamtphenolgehalt zu der Summe der analysierten Polyphenole stark voneinander ab. Beide Analysearten sind durch Probenanzahl (n = 6) und gute Reproduzierbarkeit (Varianz zwischen 1 und 2) statistisch belegbar. Die Differenzen können sich aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit der Messmethoden erklären.
Tabelle 5.1. Übersicht der Phenolgehalte ermittelt als Gesamtphenolgehalt nach Folin-Ciocalteu (Kap. 4.2.) und als Summe der analysierten Polyphenole (Kap. 4.4.5.); der prozentualen Berechung liegen die unbehandelten Eicheln zugrunde; bezogen auf die ursprüngliche Substanz.
Unbehandelte Eicheln Therm. getr. Eicheln Eichelsilage
Gesamtphenolgehalt (mg/ 100g) 429,9 101,2 96,7
(%) 100,0 23,5 22,5
Analys. Polyphenole (mg/ 100g) 68,0 13,8 32,7
(%) 100,0 20,3 48,2
Anhand der chromatographisch bestimmten Einzelmengen der Polyphenole ergibt sich für Q. robur eine Gesamtmenge von 0,7 g Polyphenolen/ kg frischer, unbehandelter Eicheln. Bisher wurden die Schweine mit maximal 4 kg Eicheln pro Tag gemästet, das entspricht einer täglichen Aufnahme von 2,8 g Polyphenolen.
Würde man die Futtermenge auf die von CANTOS et al. (2003) genannten 7 bis 10 kg Eicheln pro Tag erhöhen, erreicht man sogar eine tägliche Aufnahme von 4,9 bis 7 g pro Schwein. Damit liegt man weit über den Mengen, die noch als akzeptabel gelten, um keine Nebenwirkungen auszulösen.
Für den prozentualen Vergleich der Gehaltsveränderungen durch Verarbeitung (Tab.
5.1.) werden die Werte der unbehandelten Eicheln mit 100 % gleichgesetzt.
Gegenübergestellt werden die zu Beginn ermittelten Gesamtphenolgehalte nach Folin-Ciocalteu (Kap. 4.2.) und die Gesamtmenge der chromatographisch analysierten Polyphenole (Kap. 4.4.5.). So sind bei 720 nm (nach Vorschrift zur Analyse des Gesamtphenolgehaltes nach Folin-Ciocalteu) bedeutend weniger Polyphenole nachweisbar als mit der verwendeten Analysenmethodik chromatographisch aufgenommen werden können. Außerdem sind zusätzlich Abweichungen in den Ergebnissen durch unterschiedliche Sensitivität zwischen HPLC und Photospektrometrie zu erwarten. Weiter steht neben der Empfindlichkeit auch die Messgenauigkeit der Geräte zur Diskussion.
In den Chromatogrammen der analysierten Eichelproben (Abb. 4.4., Kap. 4.4.3., unbehandelte Eicheln, übertragbar für therm. getr. Eicheln und Eichelsilage) stellen
sich eine Reihe kleiner Peaks dar, die mit der entwickelten Methodik nicht eindeutig zu identifizieren sind.
Entweder besitzen diese insgesamt eine zu geringe Konzentration, oder sie haben nur eine geringe UV-Aktivität und können aus diesem Grund nicht ausreichend chromatographisch aufgenommen werden. Für eine umfassendere Liste an Inhaltsstoffen ist es möglich, Fraktionen zu schneiden und nach einem (eventuellem) Zwischenschritt der Aufkonzentration über eine andere Säule eine andere Auftrennung zu erzielen. Durch diese ergänzenden Analysen ist es möglich, zusätzlich zu den hier bereits identifizierten Polyphenolen weitere Verbindungen zu charakterisieren.
Außerdem kann durch kritisches Betrachten der Probenaufarbeitung gegebenenfalls ein Weg gefunden werden, die Hauptbestandteile zuvor abzutrennen und dadurch die in kleinen Mengen vorhandenen Stoffe zu gewinnen und zu identifizieren.
Weiter kann ebenfalls aus diesem Grund der Einsatz von Enzymen erfolgen und es können über die Abtrennung z. B. von Zuckerresten weitere Identifikationen ermöglicht werden.
Eine weitere Möglichkeit ist, das Probenvolumen zu erhöhen bei gleichzeitiger Berücksichtigung der Kapazität der gewählten Säule. Ob es von Vorteil ist, die Säulentemperatur über beispielsweise einen eingesetzten Säulenofen konstant zu halten, ist fraglich, da die Polyphenole sich relativ stabil und unempfindlich darstellen.
Trotzdem kann dies ein weiterer Schritt zur Optimierung der Methode sein.
5.3.1. Einfluss des Reifezustandes
Wenn Eicheln als Tierfutter in der Freilandhaltung genutzt werden sollen, darf nicht außer Betracht gelassen werden, dass die Tiere auch grüne oder überreife Eicheln aufnehmen könnten.
Dieser Aspekt führte dazu, dass auch unterschiedliche Reifegrade der Eicheln untersucht worden. In der chemischen Analytik liegen bisher keine Daten zum
Einfluss des Reifezustandes vor. Damit leistet die vorliegende Arbeit einen großen Beitrag zum Verständnis der Vorgänge in Pflanzen während der Fruchtreife.
Generell sind Polyphenole in allen Eicheln enthalten. Die Tanningehalte sind laut Literatur besonders hoch in grünen, unreifen Eicheln. Werden diese von Tieren aufgenommen, kommt es verstärkt zu Erkrankungen und Vergiftungserscheinungen.
Dies kann mit den hier durchgeführten Untersuchungen nicht bestätigt werden.
Sowohl der Gesamtphenolgehalt als auch die HPLC-Analyse zeigen bei grünen Eicheln geringere Werte als bei reifen Eicheln. Erwartungsgemäß sind sie signifikant niedriger in überreifen, bereits leicht zerfallenen Eicheln. Allerdings reichen die Gehalte in diesen Eichelproben aus, um bei gezielten Fütterung von Schweinen trotz allem noch die gewünschten Effekte zu erreichen. Gleichzeitig ist zu beachten, dass bei empfindlichen und prädestinierten Tieren auch zerfallene, überreife Eicheln Vergiftungserscheinungen auslösen können.
0 10 20 30 40 50 60 70
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
grüne Eicheln reife Eicheln überreife Eicheln
Abbildung 5.1. Polyphenole in unreifen (grünen), reifen (normalen) und überreifen (zerfallenen) Eicheln (Namen der Verbindungen siehe Tab. 4.19.)
In der Literatur wird immer wieder auf die Gefahr der Vergiftung besonders durch grüne Eicheln hingewiesen (BENTZ 1969, WOLF 1996). Dies kann mit der hier verwendeten Analysenmethodik nicht ausreichend bestätigt werden. Insgesamt sind
Absorbance (mV)
Peak Nr.
die Phenolgehalte in unreifen Eicheln nur halb so hoch wie in normalen Eicheln. Am höchsten sind sie in den Proben aus überreifen Eicheln, demnach müssten diese die giftigsten sein. Das stimmt mit der Annahme, dass unreife Eicheln die höchste Toxizität besitzen, nicht überein.
Das lässt vermuten, dass einzelne Polyphenole eine höhere Toxizität aufweisen als andere. Unter diesem Gesichtspunkt sind die Proben daraufhin zu untersuchen, ob
Das lässt vermuten, dass einzelne Polyphenole eine höhere Toxizität aufweisen als andere. Unter diesem Gesichtspunkt sind die Proben daraufhin zu untersuchen, ob