Analyse mittels GC-MS

Wie beim Menschen so sind auch bei Tieren Geruch und Geschmack von Lebens-bzw. Futtermitteln ausschlaggebend für die Akzeptanz. Dies macht die Erforschung des Aromas unerlässlich. In dieser Arbeit wurden erstmals Eicheln auf ihre flüchtigen Aromastoffe untersucht.

Bei der Extraktion der Analyten aus der Probe für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie werden zwei Arten unterschieden. Bei der Immersions-SPME wird der beschichtete Teil der Faser direkt in die Probenlösung getaucht, bei der hier durchgeführten Headspace-SPME wird die Faser hingegen im Gasraum über der Probe platziert. Die SPME Einheit und die Extraktion im Gasraum über der Probe sind in Abbildung 3.7. dargestellt.

1 - Faserhalter 2 - Kolben 3 - Zylinder

4 - Probengefäß (Headspacevial) 5 - Deckel mit Septum

6 - Faser im Gasraum 7 - Probe

Abbildung 3.7. Darstellung der Aufnahme der flüchtigen Aromastoffe beim SPME

Die SPME Einheit ist wie folgt aufgebaut (Abb. 3.7.):

Der Faserhalter (1) besteht aus einem Zylinder (3) mit Kolben (2), an dem die Faser angeschraubt wird. Durch Herunterschieben des Kolbens wird die beschichtete Faser aus der Schutzkanüle geschoben oder in die Schutzkanüle zurückgezogen.

Das Probengefäß ist ein sogenanntes Headspacevial, hier wird nur soviel Probe eingefüllt, dass darüber ein Gasraum verbleibt in den die Faser eingeführt wird um

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Bördelkappe mit integriertem Septum verschlossen. Mit in die Schutzkanüle zurückgezogener Faser wird das Septum des Probengefäßes (5) durchstochen. Der Kolben wird nach unten gedrückt und die Faser dem Gasraum über der Probe (6) ausgesetzt. Durch die Halteschraube wird die Faser in der ausgefahrenen Position fixiert. Die flüchtigen Bestandteile werden nun von der Faserbeschichtung adsorbiert.

Später wird die Faser in die Schutzhülle zurückgezogen und die Nadel aus dem Probengefäß entfernt. Im direkten Anschluss an die Extraktion erfolgt die thermische Desorption im GC-Injektor.

Für die SPME wurden Materialien der Fa. Supelco, Schnelldorf, genutzt (Übersicht 3.4.).

Übersicht 3.4. Übersicht der SPME Materialien

Material Besonderheit Artikel-Nummer

Faserhalter (SPME Holder Manual) 57330-U

50/30

Polydimethylsiloxan–Stableflex–Fasern Länge: 2 cm 57348-U

Headspacevials 20 mL SU-860049

Butylgummiseptum + Aluminiumbördelkappe 854979

3.5.1. Probenaufbereitung und Aromastoffanreicherung

Die ganzen Eicheln wurden nach einer groben manuellen Zerkleinerung in einer Kaffeemühle (Alaska KM 850) fein zerkleinert. Von diesem Eichelmehl wurden jeweils 3 g als Probenmaterial in ein Zentrifugenglas eingewogen und mit 10 mL eines Gemisches aus wässriger Natriumchloridlösung (20 %) und Methanol (50:50) versetzt. Anschließend wurde die Mischung mit dem Ultraturrax® (Typ TP 18/10, FA Janke & Kunkel, Staufen) homogenisiert. Die homogenisierte Probe wurde in das Headspacevial (Probengefäß) umgefüllt, und mit weiteren 2 mL des

Natriumchlorid-Das Headspacevial wurde mit einem Rührmagneten versehen, mit Gummiseptum und Bördelkappe luftdicht verschlossen und in ein Wasserbad gestellt. Zum Einstellen des Konzentrationsgleichgewichtes der flüchtigen Verbindungen zwischen Homogenisat und Gasraum wurde die Probe zunächst 30 Minuten im 38 °C warmen Wasserbad mit 1000 U/min gerührt.

Parallel zur Gleichgewichtseinstellung wurde die SPME-Faser im Inlet des GC bei 220 °C für ebenfalls 30 Minuten konditioniert. Danach wurde die Faser im Gasraum über der Probe platziert, um in einer zweistündigen Extraktionsphase bei gleichbleibender Rührintensität und Temperatur im Wasserbad die flüchtigen Verbindungen aufzunehmen.

Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Faser zur thermischen Desorption im Inlet des Gaschromatographen mit einer Eindringtiefe von 4 cm exponiert.

Pro Eichelfutterart wurde die Probenaufarbeitung (vom Einwiegen bis zur Desorption der Faser im Inlet des Gaschromatographen) jeweils drei Mal durchgeführt. Die Ergebnisse der Gaschromatographie-Massenspektrometrie sind in Kapitel 4.5. mit Chromatogrammen zu finden.

3.5.2. Methodenentwicklung für die GC-MS

Die Entwicklung der Methode entfiel weitgehend, da dieser Teil der Arbeit parallel zu der Aromastoffanalyse in Eichelrohschinken und -Rohwürsten von KASTNER (2008) durchgeführt wurde. Um eine mögliche Vergleichbarkeit von Fleischproben und Eichelproben herzustellen, wurde die Methode CPWAX4 (siehe Kapitel 3.6.6.) übernommen und geringfügig optimiert. In der überarbeiteten Methode wurde ein Solvent Delay für 5 Minuten eingestellt. Das bedeutet, die ersten 5 Minuten des Laufes wurden nicht aufgezeichnet, da in dieser Zeit lediglich der Lösungsmittelpeak auftrat.

Es galt weiter, die Extraktion zu verbessern, da die Aufnahme der Stoffe durch die Faser mit reiner NaCl-Lösung nicht ausreichend ist. Hingegen führt die ausschließliche Verwendung von Methanol zu einer Überladung der Faser.

Außerdem wurde die Probenmenge erhöht um den Gehalt an flüchtigen Substanzen im Gasraum zu erhöhen. Der Versuch, die Probenmenge zu verdoppeln oder zu verdreifachen scheiterte, da das Probenmaterial nicht mehr gleichmäßig gerührt werden konnte und damit der Übertritt der zu analysierenden Stoffe in den Gasraum nicht mehr gewährleistet war.

Als optimal stellte sich daher die Verwendung von insgesamt 12 mL NaCl-Methanol-Lösung (50:50) und 3 g Eichelmehl dar.

3.5.3. Gaschromatographie

Die Analyse im Gaschromatographen des Gerätetypes HP 5890 Series II (Hewlett-Packard, Böblingen) wurde mit einer CP-WAX 52 CB Kapillarsäule mit einer Länge

der Fa. Varian durchgeführt.

Zur Absicherung der Ergebnisse kam eine DB-5 Kapillarsäule mit einer Länge von 30

Scientific) zum Einsatz.

Die mit Probenmaterial beladene SPME Faser wurde mit Hilfe einer Führungsschiene (Inlet Guide, Fa Supelco) durch ein vorperforiertes Septum (Thermogreen L, Supelco) in den Gaschromatographen manuell eingeführt. Für jede GC-MS Analyse war eine erneute Extraktion mittels SPME nötig. Die Desorption der SPME-Faser erfolgte bei einer Injektionstemperatur von 220 °C im Splitless-Verfahren. Als Trägergas diente Helium mit einer konstanten Flussrate. Der Säulenvordruck wurde mit steigender Temperatur im GC-Ofen automatisch angepasst.

Gemessen wurde mit der Methode CPWAX4S5 mit 2 verschiedenen Trennsäulen:

• erste Trennsäule: CP-Wax Kapillarsäule, 60 m x 0,25 mm x 0,25 m (Fa. Varian)

• zweite Trennsäule: DB-5 Kapillarsäule,

30 m x 0,320 mm x 1,0 m (Fa. J&W Scientific)

• Säulenvordruck: 140 kPa

• Flussrate: 1,3 mL/min

• Solvent Delay: 5 min

• Temperaturprogramm: initial 40 °C für 5 min 5 °C/min auf 200 °C final 200 °C für 20 min

• Ionisationsmethode: negativ

3.5.4. Massenspektrometrie

Bei dem eingesetzten GC-Massenspektrometer handelte es sich um einen HP 5989 A mit Quadrupol der Fa. Agilent, Böblingen. Die Ionisation erfolgte mittels Elektronenstoß, bei einer Ioniersierungsenergie von 70 eV. Die Temperatur der Ionenquelle betrug 200 °C, die Betriebstemperatur des Quadrupols 150 °C.

Die Scan Range aller Messungen betrug 35 bis 200 m/z mit einer Detektionsuntergrenze (Threshold) von einem Molekülgewicht von 200.

Mit einem Standard Autotune wurde zu Beginn eines Versuchstages die Spannung des Electron-Multipliers neu festgelegt.

3.5.5. Auswertung und Identifizierung

Die Daten der GC-MS-Analysen wurden als Chromatogramm dargestellt. Die Massenspektren der analysierten Verbindungen aus den Proben wurden mit Spektren aus der MS Spektrenbibliothek WILEY verglichen.

Die Daten der GC/MS-Analysen lieferten für jede Verbindung aus den chromatographischen Bedingungen eine bestimmte Retentionszeit sowie ein für die Fragmentierung charakteristisches Massenspektrum. In Abbildung 3.8. ist beispielhaft das Massenspektrum mit den Hauptfragmenten für Decan dargestellt.

Bei der Masse [M – H]- 141 handelt es sich um die Molekülmasse der Verbindung, was der Formel C10H21 [-H] entspricht. Durch die Elektronenstoßionisierung entstehen aus Decan überwiegend Fragmente mit (m/z) 43, 57 und 71, die Differenz von 14 entspricht CH2-Einheiten. Die (m/z) 43 tritt in diesem Massenspektrum am häufigsten auf und entspricht der Struktur C3H7 [-H]. Daneben deuten die ebenfalls dominanten Massen (m/z) 71 bzw. (m/z) 57 auf eine C5H11-Gruppe [-H] bzw. die Struktur von C2H5hin.

Abbildung 3.8. Massenspektrum für Decan mit Fragmentierung

Hauptmolekülpeak bei [M - H]- 141, Fragmente bei (m/z) 71 und (m/z) 57

Wie bei Decan entstehen bei allen flüchtigen Verbindungen charakteristische Fragmentierungsprodukte. Diese sind in Tabelle 8.12. im Anhang aufgeführt.

In Kapitel 4.5. sind Chromatogramme der einzelnen Eichelextrakte abgebildet, dort sind auch tabellarisch für jeden Probenextrakt die identifizierten Verbindungen

[M – H]

Decan [M – H]- 141 (mV)

[M – H]- 71

[M – H]- 57