Probenaufarbeitung

Vor Beginn der Probenaufarbeitung mit Trichloressigsäure (TCA) wurden verschiedene Lösungen angesetzt und eisgekühlt bereitgestellt.

Zu diesen Lösungen gehörten:

- eine 4 % ige TCA-Lösung, hergestellt aus 0,4 g Trichloressigsäure in 1 L

tridestilliertem Wasser

- eine 1 molare Natriumhydroxid-Lösung, hergestellt durch Einwaage von

400 g Natriumhydroxidplätzchen in 1 L tridestilliertem Wasser

- eine Bromcyanlösung mit der Konzentration von 0,3 g/L

- eine 1 molare Salzsäurelösung, hergestellt aus 25 %iger Salzsäure und tridestilliertem Wasser

- ein Phosphatpuffer, hergestellt aus Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4;

ca. pH 4,5) und Dikaliumhydrogenphopsphat (K2HPO4; ca. pH 9) mit einer Konzentration von jeweils 250 mM, das K2HPO4 wurde vorgelegt und mit dem KH2PO4 auf einen pH–Wert von 6,4 eingestellt

- eine Elutionslösung für die Festphasenextraktion, bestehend aus eben

genanntem Phosphatpuffer und Acetonitril (ACN) im Verhältnis 80:20 und mit einem End-pH von 6,95

- ein Phosphatpuffer, hergestellt aus KH2PO4 (ca. pH 4,5) und K2HPO4 (ca.

pH 9) mit einer Konzentration von jeweils 65 mM, das K2HPO4 wurde vorgelegt und mit dem KH2PO4 auf einen pH–Wert von 6,5 eingestellt

- ein Eluent (= Eluent A) für die HPLC–Analystik aus 63 % der eben genannten 65 mmolaren Phosphatpufferlösung und 37 % ACN, bei einem End–pH von 7,15, eingestellt durch 0,1 molare Salzsäure (HCl)

- ein Phosphatpuffer, hergestellt aus KH2PO4 (ca. pH 4,5) und K2HPO4 (ca.

pH 9) mit einer Konzentration von jeweils 110 mM, das K2HPO4 wurde vorgelegt und mit dem KH2PO4 auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt

- ein Eluent (= Eluent B) für die HPLC–Analytik aus 60 % der eben genannten

110 mmolaren Phosphatpufferlösung und 40 % ACN, bei einem End–pH von 7,25, der durch den Ansatz erreicht wurde und nicht mit HCl eingestellt werden musste

- gegebenenfalls Kochsalz, Nitritpökelsalz, Kaliumnitrat, Natriumnitrit sowie Ascorbinsäure für die Versuche mit Zusatzstoffzugabe

3.3.2.2 Bereitstellung von Materialien

Für die Aufarbeitung der Probe mit TCA war es äußerst wichtig, dass einige Gefäße und Kolben bereits eisgekühlt bereitstanden, wenn die Probe im Instiut eintraf. Deswegen empfahl es sich, bereits vor Probenholung die Aufstellung und Kühlung aller Gefäße und Geräte vorzunehmen, um später Verzögerungen zu vermeiden.

Gefäße, die bereitstehen und eisgekühlt sein sollten:

- 3 x mit Eis gefüllte Styroporbehälter

- 1-3 x (je nach zu erwartender Probenanzahl) eisgekühlte 20 mL Messkolben - 3 x eisgekühlte 50 mL Bechergläser gefüllt mit entweder eisgekühlter NaOH

(1 M), TCA (4%) oder Tri Dest

- 1-3 x (je nach Probenanzahl) 25 mL Bechergläser (eisgekühlt) - 1-3 x (je nach Probenanzahl) 50 mL Bechergläser (eisgekühlt) - Glastrichter für die Messkolben sowie Glaswolle als Filtereinsatz - 1 x 10 mL Glaspipette

- 1 Plastik-Einmalpipette

3.3.2.3 Thiaminextraktion mit Hilfe von Trichloressigsäure und Derivatisierung zu Thiochrom

Es wurde, unabhängig vom zu untersuchenden Material, zunächst die gesamte Probe mit Hilfe einer Moulinette zerkleinert. Nachfolgend wurden 4 g dieser zerkleinerten Probe in ein Zentrifugenglas abgewogen und mit 6 mL 4 %iger und eisgekühlter Trichloressigsäure versehen. Nun folgte eine Homogenisierung mit einem Stabrührer (Ultra-Turrax, TP 18-10, Janke-Kunkel GmbH & Co. KG-IKA Labortechnik, Staufen, Breisgau) für ca. 30 Sekunden.

Am Rührer anhaftende Probenmatrix wurde mit 1 mL der 4 %igen, eisgekühlten Trichloressigsäure abgespült. Das Zentrifugenglas wurde nun in einer Tischzentrifuge (Hettich Universal 1200) bei einer relativen Zentrifugationsbeschleunigung (RZB) von 1500 für ca. 3 min zentrifugiert. Danach wurde der Überstand in einen bereitstehenden, eisgekühlten 20 mL Messkolben durch einen Glastricher mit Glaswolle überführt. Der Messkolben befand sich lichtgeschützt in einem lichtundurchlässigen, eisgefüllten Styroporbehälter. Die Matrix im Zentrifugenglas wurde nun erneut mit 6 mL Trichloressigsäure versehen und es folgte ein zweiter Extraktionsdurchgang, analog zum ersten. Der Überstand dieses Durchgangs wurde durch den gleichen Glasfilter zum Überstand des ersten Durchgangs gegeben. Eine weitere Wiederholung des Extraktions-vorganges folgte nun mit 4 mL Trichloressigsäure. Nach Filterung des letzten Überstandes in den Messkolben, wurde dieser auf 20 mL mit eisgekühltem, tridestilliertem Wasser aufgefüllt. Nach Durchmischung des Überstandes mit dem tridestilliertem Wasser, wurden 2 mL in ein ebenfalls eisgekühltes Becherglas überführt (Abb. 33).

4 ,0 g du rch G lasw o llefilter filtrieren

4 m L 4 % ige T C A zuge be n d urch G lasw ollefilte r filtrieren

S edim e nt v erw erfe n 2 m in zentrifugie ren Z e ntrifu gen glas

W aag e S tabrührer T isch ze ntrifu ge E inm alp ipetten du rch G lasw o llefilter filtrieren

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Abb. 33: Thiaminextraktion durch eisgekühlte TCA und Derivatisierung zu Thiochrom durch BrCN

3.3.2.4 Thiaminextraktion mit Salzsäure und Hochdruck

Unabhängig von der Matrix wurden 4 g einer Probe mit einer Moulinette zerkleinert. Die Probe wurde in ein hitzebeständiges, getöntes Glas überführt und es erfolgte die Zugabe von 20,4 mL Salzsäure (0,1 molar). Nach der Homogenisierung mit dem Stabrührer wurde die Probe für 10 min bei Einstellung des Sterilisators auf 134 °C und unter Hochdruck erhitzt. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation durch eine Tischzentrifuge (Hettich Universal 1200) bei einer RZB von 1500 für ca. 3 min Nachfolgend wurde der Überstand durch einen Glastrichter mit Glaswolle in einen 20 mL Kolben überführt. Der Kolben wurde mit tridestilliertem Wasser aufgefüllt und die Lösung zur besseren Entnahme in ein Becherglas gefüllt. 2 mL der Lösung wurden entnommen und in ein eisgekühltes Becherglas überführt. Ein typisches Chromatogramm nach dieser Extraktionsmethode zeigt Abb. 47, Kapitel 4.3. Beim Vergleich mit Abb. 48, Kapitel 4.3 wird der Unterschied zur Extraktion mit 4 %iger TCA deutlich.

3.3.2.5 Derivatisierung

Zur Derivatisierung und somit Überführung des Thiamins und seiner Phosphatester in Thiochrom wurde 1 mL Bromcyanlösung (0,3 g/L) zu den 2 mL Probe im eisgekühlten Becherglas zugesetzt. Dieser Verfahrensschritt war unabhängig von der vorherigen Extraktionsart. Nach Zugabe von 0,9 mL einer 1-molaren NaOH-Lösung wurde ein pH-Wert von 12 erreicht. Ein alkalisches Milieu war für die Oxidation von Thiamin und seinen Phosphatestern in Thiochrom und die entsprechenden Phosphatester unerlässlich.

Die Probe wurde für eine Reaktionszeit von 20 min im Dunkeln eisgekühlt gelagert.

Nach der Derivatisierung wurde die Thiochrom-Lösung mit Hilfe von eisgekühlter, 1-molarer Salzsäure von pH 12 auf pH 7 eingestellt. Um bei dieser Ansäuerung ausfallende Proteine zu entfernen erfolgte eine erneute Zentrifugation mit einer Tischzentrifuge ( 3200 Eppendorf, Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) bei einer RZB von 8000 über 2 min. Zu diesem Zweck wurde die Probe in 4 Eppendorfcaps überführt (Abb. 33).

3.3.2.6 Festphasenextraktion

Während der Zentrifugation zur Entfernung der ausgefallenen Proteine wurden die Aufsatzstücke der Unterdruckkammer der Festphase zunächst mit tridestilliertem Wasser gereinigt und nachfolgend mit Luft getrocknet. Anschließend wurden 2 Festphasensäulen (C-18 ec und SAX) unabhängig voneinander erst mit 5 mL Methanol und dann mit 5 mL tridestilliertem Wasser konditioniert.

Nun wurden diese beiden Säulen mittels eines Verbindungsstückes kombiniert, wobei die C-18 ec-Säule oben und die SAX–Säule unten positioniert wurde. Die derivatisierte Probe aus den Eppendorfcaps wurde auf die Säulenkombination aufgetragen, und die Eppendorfcaps mit jeweils 0,5 mL tridestilliertem Wasser ausgespült. Das Spülwasser wurde ebenfalls auf die erste Säulenkombination gegeben. Nachdem die Probe beide Säulen durchlaufen hatte, wurde der Durchfluss in einem Reagenzglas aufgefangen. Es war darauf zu achten, dass keine der beiden Säulen vor Auftrag der gesamten Probenmenge trockenläuft, um die volle Thiochrombindungsfähigkeit während des gesamten Probenauftrages zu erhalten.

Nach dem Probenauftrag wurden die kombinierten Säulen auf das nächste Ventil gesteckt und es folgte ein Waschgang mit 2,5 mL tridestilliertem Wasser, um unerwünschte Substanzen aus den Säulen auszuwaschen. Die Waschlösung wurde ebenfalls in einem Reagenzglas aufgefangen. Sie enthielt die Substanzen, die zusätzlich an die Säulen gebunden wurden, aber im Gegensatz zu Thiochrom und seinen Phosphatestern durch tridestilliertes Wasser auswaschbar waren.

Unter dem dritten Ventil wurde ein 5 mL Messkolben positioniert. 4,3 mL Elutionslösung wurden auf die Festphasensäulen gegeben und langsam in den Kolben getropft. Zur Kontrolle der Vollständigkeit der Elution wurde die Säulenkombination noch ein Ventil weiter gesteckt und nochmals 4,3 mL Elutionslösung aufgetragen. Die Glaskolben mit dem ersten und zweiten Eluat wurden nachfolgend mit tridestilliertem Wasser auf 5 mL aufgefüllt und analysiert. Sie enthielten nun das reine Thiochrom und Thiochromphosphate (Abb. 34).

2

Elutionslösung: 250 mmolarer Phosphatpuffer (KH2PO4 (250 mM), ca. pH 4,5,

und K₂HPO₄ (250 mM), ca. pH 9; KH₂PO₄ wurde vorgelegt und mit K₂HPO₄ auf pH 6,4 eingestellt) und ACN (80 : 20) bei einem End pH von 6,95