HPLC

Die HPLC hatte ihre Anfänge in den 60er Jahren zunächst als „High Pressure Liquid Chromatographie“ (Hochdruckflüssigkeitschromatographie), wurde aber dank verbesserter Säulenmaterialien und Geräten Ende der 70er Jahre in die „High Performance Liquid Chromatographie“ (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) umgewandelt.

Der Name umschreibt eine schnelle Trenntechnik, bei dem das zu trennende Gemisch mit Hilfe eines Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches (mobile Phase/ Eluent) zur Säule transportiert wird. Die Säule ist ein Rohr, dass mit einer stationären Phase, meistens Kieselgel (syn.: Silicagel), gefüllt ist. An der Oberfläche des Kieselgels sind bestimmte Gruppen gebunden, die als Austauschplätze für die zu trennenden Substanzen fungieren.

Je nach Art wird eine Substanz unterschiedlich lange festgehalten, was in unter-schiedlichen Retentionszeiten resultiert. Die Trennung kann durch Einsatz verschiedener Phasen und Lösungsmittel-Gemische beeinflusst werden.

Die Probensubstanzen werden nach dem Säulendurchlauf von einem Detektor registriert, der die Informationen an einen Rechner weitergibt. Das Ergebnis ist ein Chromatogramm.

Die Anzahl der Peaks entspricht der Anzahl der aufgetrennten Probenkomponenten, die Fläche ist deren Menge proportional.

Zu unterscheiden sind das isokratische System, bei dem während eines HPLC–Laufes nur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet wird und das Gradientensystem, bei dem die Eluentenzusammensetzung über die Zeit geändert wird (Abb. 37).

Das isokratische System zeichnet sich durch eine konstante Wechselwirkung zwischen Laufmittel und stationärer Phase während der gesamten Zeit der Trennung aus. Vor allem ähnliche Substanzen können mit diesem System gut getrennt werden.

Durch das Gradientensystem können auch Substanzkomponenten unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit getrennt werden.

E lu e n t A E lu e n t B

Abb. 37: Schematische Darstellung einer HPLC–Anlage mit Fluoreszenzdetektor

und Gradientensystem

mobile Phase: Eluent A: ACN – Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (65 mM), ca. pH 4,5, und

stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit

Eurospher-100-C-8-RP-Säule und Grom Saphir 110 NH2-Säule, ec Pumpe A: fördert den Anteil von Eluent A an der mobilen Phase (Knauer,

Modell 64)

Pumpe B: fördert den Anteil von Eluent B an der mobilen Phase (Knauer,

Modell 64)

Mischkammer: mischt die definierten Anteile von Eluent A und Eluent B zur mobilen

Phase (Knauer)

Injektor: mit 20 µL Probenschleife (Knauer)

Fluoreszenzdetektor: Exzitation 375 nm; Emission 450 nm (Perkin Elmer, LC 240) Rechner: Intel Pentium III mit 751 MHz, 256 MB RAM

Betriebssystem: Windows XP Professionel Version 2002 Programm: Knauer Eurochrom 2000

Da bei dieser Arbeitsweise nach der Trennung eine andere Zusammensetzung der Eluenten vorliegen kann als am Anfang, ist stets darauf zu achten, dass das System am Anfang einer Trennung im Gleichgewicht ist.

100 µL der aufgearbeiteten und derivatisierten Probe wurden mit Hilfe einer Probenspritze aufgenommen und in das Abfallgefäß verworfen. Nach einmaliger Wiederholung erfolgte beim dritten Mal die Injektion von 20 µL über die Probenschleife des Injektors in den Eluentenstrom. Die Probenschleifenkapazität war dabei auf 20 µL definiert, so dass immer die gleiche Probenmenge in den Eluentenstrom injiziert wurde.

Ein gleichbleibender Eluentenstrom war durch eine Steuerungssoftware sowie durch Hochleistungskolbenpumpen gewährleistet, die auch bei hohem Gegendruck eine konstante Förderleistung erzielten, sofern die Eluenten vor Einsatz in der HPLC-Anlage entgast worden waren. Luftblasen im System führten zu Störpeaks und Druckschwankungen.

Anfangs fanden die Untersuchungen mit Hilfe eines isokratischen Systems statt. Der Eluent bestand aus einem Gemisch von 40 % Acetonitril und 60 % Phosphatpuffer. Der Phosphatpuffer wurde aus 75 mmolarer K2HPO4 – Lösung (pH 4,5) und 75 mmolarer KH2PO4 – Lösung (pH 9) hergestellt, indem K2HPO4 vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt wurde. Der End-pH des Eluenten nach Mischung mit Acetonitril lag bei 7. Die verwendete Probenschleife (Knauer) fasste 20 µl. Es wurden insgesamt 2 Trennsäulen (Knauer, Eurospher-100 C-8, 250 mm x 4 mm, 5 µm; Knauer, LiChrospher-100 NH2, 250 mm x 4 mm, 5 µm) und eine Vorsäule (Knauer Eurospher-100 C-8, 30 mm x 4,6) verwendet. Der anschließende Fluoreszenzdetektor (Perkin Elmer LC 240) war mit einem Computersystem (Intel Pentium III mit 751 MHz, 256 MB RAM, Betriebssystem: Windows XP Professionel Version 2002, Programm: Knauer Eurochrom 2000, Drucker: HP Laserjet 1010) verbunden. Es speicherte die Analysenergebnisse und wurde genutzt, um die Lauf-zeit sowie die Flussrate des Eluenten während einer Analyse zu programmieren. Die Flussrate betrug 0,7 mL/min über 30 min.

Um eine bessere Trennleistung zu erzielen, wurde das isokratische System zu Gunsten eines Gradientensystems weiterentwickelt werden.

Die Anteile jedes Eluenten am Strom wurden mittels eines vorher erstellten Steuerungsprogrammes festgelegt.

Das Gradientensystem bestand aus zwei Eluenten. Eluent A setzte sich aus 37 % Acetonitril und 63 % Phosphatpuffer zusammen. Der Phosphatpuffer hatte eine Molarität von 65 mM und einen pH von 6,5, seine Anmischung erfolgte analog zum Puffer des iso-kratischen Systems (siehe oben). Nach Mischung mit Acetonitril und pH-Wert-Einstellung mit 0,1-molarer HCl, betrug der End–pH des Eluenten 7,15.

Eluent B setzte sich aus 40 % Acetonitril und 60 % Phosphatpuffer zusammen, dessen Anmischung ebenfalls der Phosphatpufferanmischung des isokratischen Systems entsprach. Der Phosphatpuffer hatte eine Konzentration von 110 mM bei einem End-pH von 6,5. Der End-pH-Wert dieses Eluenten lag bereits nach der Mischung mit ACN bei 7,25 und wurde nicht mit HCl justiert.

Die Apparatur wurde größtenteils vom isokratischen System übernommen, zugefügt wurde eine weitere Pumpe (Knauer) für den zweiten Eluenten, sowie eine Mischkammer (Knauer). Weiterhin wurde die LiChrospher-NH2-Säule (Knauer) durch eine Alltech-Grom Saphir 110 NH2-Säule (Alltech-Grom Saphir 110 NH2, 150 mm x 4 mm, 5 µm) ersetzt (Abb. 32). Das Computersystem wurde nun neben der Sicherung der Analysenergebnisse und der Flussratenbestimmung genutzt, um die Anteile der Eluenten am Gesamtstrom sowie eine wechselnde Flussrate zu programmieren.

Die Zusammensetzung der Eluenten, sowie die Dauer des gesamten Laufes und die Flussraten wurden durch einen Prozess der Methodenentwicklung optimiert und resultierten schließlich in dem in Tab. 13 dargestellten Programm.

Zeit Fluss Pumpe Pumpe

hh:mm:ss mL/min % A % B

00:00:00 0,7 95 5

00:15:00 0,7 3 97

00:31:00 0,8 3 97

00:59:00 0,8 3 97

01:00:00 0,7 95 5

Tab. 13: Gradientensystem zur Analyse von Thiamin und Thiaminphosphatestern

in Schweinefleisch

Zeit: Zeit, die der Analysenlauf dauert

Fluss: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase

Pumpe A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase, gefördert von Pumpe A (Abb. 32) Pumpe B: Anteile des Eluenten B an der mobilen Phase, gefördert von Pumpe B (Abb. 32) Eluent A: ACN – Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (65 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (65 mM),

ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), p H 7,15

Eluent B: ACN – Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (110 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (110 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25

Durch die Entwicklung dieses Programmes und die zuvor entwickelte Säulenkombination einer C-8-RP-Phase mit einer NH2–Phase (Abb. 37), gekoppelt an eine ebenfalls neu entwickelte Festphasenextraktion (Abb. 34), war es zum ersten Mal möglich, Thiochrom und Thiochromphosphate in angemessener Zeit sauber voneinander zu trennen.