5. Diskussion
5.1. Chromatographie
5.1.1 Methodenentwicklung
Für eine bessere Trennung der Analyten wurde zunächst eine neue Säulenkombination etabliert, bestehend aus einer C-8-RP-Säule und einer nachfolgend angeschlossenen NH2-Säule. Vor beide Trennungssäulen wurde eine C-8-Vorsäule geschaltet.
Der Vorteil dieser Kombination lag in der besseren Retardierung des zum unpolaren Thiochrom derivatisierten Thiamin durch die unpolare RP-Säule (Abb. 70) im Vergleich zur nur geringen Retardierung bei Verwendung einer NH2-Phase ohne Kombination (siehe Kapitel 2.12.3, Abb. 27 und 28). Die nachgeschaltete NH2-Säule ermöglichte die für die Thiaminphosphatanalyse günstige Elutionsreihenfolge der Thiochromformen von zunächst TP, dann TP2 und schließlich TP3 durch ionische Wechselwirkung der postiv geladenen NH2-Phase mit den negativ geladenen Thiochromphosphaten. Je mehr Phosphatreste vorhanden waren, desto stärker war die Wechselwirkung und umso stärker wurde das Thiochromphosphat an der stationären Phase gebunden. Die Thiochromform des TP erschien folglich schneller im Chromatogramm als die des TP3.
Im Folgenden sind bei der Erwähnung der Trennungseigenschaften verschiedener Säulen und Methoden in Bezug auf Thiamin und Thiaminphosphate immer die Thiochromderivate dieser Substanzen gemeint, denn diese wurden bei der in dieser Forschungsarbeit verwendeten Vorsäulenderivatisierung auf der stationären Phase voneinander separiert.
Die Trennung wurde zunächst mit Hilfe einer isokratischen Methode mit einem Acetonitril:
Phosphatpuffergemisch 40:60 (KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2PO4 auf pH 6,5 eingestellt) mit einer Molarität von 75 mM, pH 8 und einem flow von 0,7 mL/min durchgeführt, wie sie beispielsweise bei der Analyse von T im Plasma nativer Eier erfolgreich angewandt worden war (Abb. 70).
Abb. 70: Analyse von Thiamin im Plasma nativer Eier (BÄCKERMANN, 2007)
mobile Phase: ACN – Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4
(75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (40:60), pH 8
stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit Eurospher-100-C-8-RP Säule und LiChrospher-100-NH2-Säule
Obwohl T mit dieser Methode zuverlässig nachgewiesen werden konnte, war zum einen der pH–Wert am oberen Limit des Bereiches, der eine dauerhafte Stabilität der mit Silicapartikeln gefüllten HPLC–Säulen gewährleistete (pH 2 bis 8), und zum zweiten lagen die Retentionszeiten von T (ca. 7 min) und TP (ca. 8 min) sehr dicht zusammen, was die Trennung einer Kalibrationslösung aus T, TP und TP2 zeigte (Abb. 71). Bei höheren Gehalten in einer Probe wären die Substanzen nicht mehr eindeutig differenzierbar.
Weiterhin war die Laufzeit des Programms mit nur 30 Min für im Schweinefleisch vorhandene höher phosphorylierte Thiaminphosphate (TP3, TP4) zu kurz.
0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 71: Chromatogramm nach Auftrennung einer Standardlösung mit T, TP und TP2 durch ein isokratisches System
mobile Phase: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4
(75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (40:60), pH 8
stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit Eurospher-100-C-8-RP Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
Um Thiamin und alle vorhandenen Thiaminphosphate zuverlässig und in angemessener Zeit nachweisen zu können, wurde nach einer neuen Säulenkombination eine neue HPLC-Methode entwickelt.
Ziel der neuen Methode war eine zuverlässige und saubere Auftrennung von Thiamin und Thiaminphosphaten in komplexen Matrices wie Schweinefleisch, in denen höher phosphorylierte Thiaminphosphate als TP2 regelmäßig zu erwarten waren. Weiterhin sollte eine größtmögliche Schonung der Säule durch niedrigere pH-Werte als pH 8 erreicht werden.
Der erste Schritt der Methodenentwicklung lag im Wechsel vom isokratischen System zum Gradientensystem, um möglichst schnell die Auswirkungen verschiedener Eluentenkonzentrationen untersuchen zu können, ohne für jede Konzentrationsänderung einen neuen Eluenten ansetzen zu müssen. Durch das Gradientensystem können außerdem auch Substanzkomponenten unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit getrennt werden, da die Zusammensetzung der mobilen Phase während eines HPLC-Laufes geändert werden kann.
Die mobile Phase des Gradientensystems setzte sich aus zwei Eluenten zusammen. Die Eluenten waren über jeweils eine Pumpe mit einer Mischkammer und nachfolgend mit den
T TP TP2
HPLC-Säulen verbunden. Über die Steuerung der Pumpen mit Hilfe eines Computerprogrammes, wurden die verschiedenen Eluenten in unterschiedlichen Anteilen gemischt und die entstehende mobile Phase anschließend durch die Säulen gepumpt (Kapitel 3.3.3.2, Abb. 37).
Der erste Eluent (Eluent A) für das Gradientensystem orientierte sich am Eluenten des isokratischen Systems. Aus dem dort verwendeten Mischungsverhältnis von 40 % Acetonitril (ACN) und 60 % Phosphatpuffer wurde das Mischungsverhältnis 37 % ACN und 63 % Phosphatpuffer abgeleitet. Der zweite Eluent setzte sich aus 50 % ACN und 50 % Phosphatpuffer zusammen. Die Konzentration des Phosphatpuffers betrug bei beiden Eluenten 75 mM und war hergestellt aus einer wässrigen Kaliumdihydrogenphosphat-lösung (KH2PO4) und einer wässrigen Dikaliumhydrogenphosphatlösung (K2HPO4).
Erstere Lösung hatte einen pH von 4,5 und wurde mit Hilfe der zweiten Phosphatlösung (pH 9) auf pH 6,5 eingestellt. Die Herstellung des Phosphatpuffers erfolgte immer nach diesem Prinzip, lediglich die Molaritäten beider Pufferlösungen wurden den wechselnden Methoden angepasst.
Nach Anmischung und Entgasung wurden beide Eluenten mit 1-molarer HCl auf einen pH von 7,15 eingestellt. Der pH-Wert jedes Eluenten, der während der Methodenentwicklung angesetzt wurde, erfolgte mit 1-molarer HCl.
Anschließend erfolgte die Entwicklung eines Programmes zur Steuerung beider Eluenten (Tab. 20).
Die Flussrate (flow) blieb zunächst wie beim isokratischen System bei 0,7 mL/min
Eluent A stellte für 10 min einen Anteil von 97 %. Theoretisch sollte sich dadurch an der Elution des freien Thiamins sowie des TP nicht viel ändern, da Eluent A sich vom Eluenten des isokratischen Systems nur durch den pH-Wert und den geringgradig höheren Phosphatpufferanteil unterschied.
Nach der Elution von T und TP innerhalb von 10 min (siehe Abb. 71), wechselte die Zusammensetzung der mobilen Phase und Eluent B nahm mit 95 % den größeren Part ein. Mit Steigerung des Anteils des Eluenten B sank die Phosphatpufferkonzentration in den Trennsäulen, was zu einer verzögerten Elution des TP2 führen sollte, da die Thiaminphosphate von der NH2-Säule durch ionische Wechselwirkungen besser retardiert werden konnten.
Time Flow Pump Pump
Tab. 20: 1. Gradientensystem
Time: Zeit, die der Analysenlauf dauert
Flow: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase Pump A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase Pump B: Anteil des Eluenten B an der mobilen Phase
Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und
Theoretisch musste das erstellte Programm somit in einer ähnlich Retentionszeit für T und TP aber in einer verlängerten Retentionszeit für TP2 resultieren und somit zu einer Abtrennung des TP2 von den anderen beiden Analyten im Chromatogramm führen.
-50
Abb. 72: 1. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,15
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde
vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,15 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
Nach Entwicklung des Programmes (Tab. 20) wurd eine Standardlösung aus T (c = 44 ng/mL), TP (c = 112 ng/mL) und TP2 (c = 183,2 ng/mL) hergestellt, die in ihrer
T TP TP2
Zusammensetzung während der gesamten Methodenentwicklung gleich blieb. Diese Lösung wurde während der Methodenfindung in die HPLC – Anlage injiziert.
Das 1. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem (Abb. 72) zeigte im Vergleich zum isokratischen System vergleichbare Retentionszeiten für T und TP.
TP2 zeigte im Chromatogramm eine geringgradig verlängerte Retentionszeit von ca. 13 min auf ca. 14 min, bedingt durch die Erniedrigung des Phosphatanteils der mobilen Phase nach 10 min und die daraus resultierenden schlechtere Elutionskraft der mobilen Phase für Thiaminphosphate.
Aus diesen Ergebnissen folgte der Schluss den Phosphatanteil weiter und früher zu erniedrigen, um auch TP und T weiter zu separieren und gleichzeitig die Retentionszeit von TP2 zu erhöhen.
Time Flow Pump Pump hh:mm:ss mL/min %A %B
00:00:00 0,7 97 3
00:05:00 0,7 3 97
00:31:01 0,7 97 3
01:00:00 0,7 97 3
Tab. 21: 2. Gradientensystem
Time: Zeit, die der Analysenlauf dauert
Flow: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase Pump A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase Pump B: Anteil des Eluenten B an der mobilen Phase
Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,15
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,15
Die theoretischen Überlegungen wurden durch ein neu erstelltes Programm (Tab. 21) mit früherer Erhöhung des Anteils von Eluent B bereits nach 5 Min, sowie einer Verlängerung der Laufzeit auf insgesamt eine Stunde im Hinblick auf die spätere Analyse höher phosphorylierter Thiaminphosphate als TP2 im Schweinefleisch umgesetzt. Nach 31 Min wurde auf die Anfangseinstellung zurückgefahren, da zu diesem Zeitpunkt im Hinblick auf das vorangegangene Chromatogramm (Abb. 72) alle Analyten eluiert sein sollten. Eine stärkere Erniedrigung des Phosphatanteils durch eine Erhöhung der Pumpleistung B von 95 % (Programmm 1; Tab. 20) auf 97 % (Programm 2, Tab. 21) sollte ebenfalls zur
Retentionszeitverlängerung beitragen. Die chromatographisch sichtbaren Folgen dieser Programmänderung sind in Abb. 73 abgebildet.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 73: 2. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,15
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde
vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,15 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
T hatte eine verlängerte Retentionszeit von ungefähr 8 min entwickelt, TP wurde nach 14 min und TP2 erst nach 34 min im Chromatogramm sichtbar.
Vor allem die Verschiebung des TP2 nach hinten war auf den verringerten Phosphatpufferanteil der mobilen Phase zurückzuführen. Die Überlegung, je geringer der Phosphatanteil desto länger die Retentionszeiten der Thiaminphosphate, ließ sich durch die abnehmende Elutionskraft der mobilen Phase mit Erniedrigung des Phosphatpufferanteils erklären, der bei ausreichend hoher Konzentration im Austausch gegen die Thiaminphosphate an der NH2–Säule gebunden wurde und zur Elution der Thiaminphosphate führte.
Auf dieser Grundlage wurde eine erneute Weiterentwicklung des Programms vorgenommen (Tab. 22).
TP2
TP T
Time Flow Pump Pump
hh:mm:ss mL/min %A %B
00:00:00 0,7 97 3
00:12:00 0,7 3 97
00:22:00 0,7 97 3
01:00:00 0,7 97 3
Tab. 22: 3. Gradientensystem
Time: Zeit, die der Analysenlauf dauert
Flow: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase Pump A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase Pump B: Anteile des Eluenten B an der mobilen Phase
Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,15
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,15
Das neue Programm war erneut durch ein späteres Einsetzen der Erhöhung des Anteils des Eluenten B gekennzeichnet. Ein Vergleich mit Abb. 73 machte deutlich, dass T nach 12 min eluiert sein musste, TP aber noch nicht. Eine Erhöhung des Anteils des Eluenten B und die daraus resultierende Erniedrigung des Phosphatanteils in der mobilen Phase nach 12 min sollte somit nur auf die Thiaminphosphate Auswirkung haben. Dies hatte theoretisch zur Folge, das T relativ schnell eluiert würde, die Elution von TP aber nach hinten verschoben werden würde. Dies sollte zu einer besseren Trennung von freiem Thiamin und TP führen.
Nach 22 min wurde der Phosphatanteil wieder erhöht, um eine zu lange Retentionszeit des TP2 zu verhindern.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [m in]
Peakfläche [mV]
Abb. 74: 3. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensytem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,15
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit
K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,15 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
Das resultierende 3. Chromatogramm (Abb. 74) ähnelte trotz Programmänderung dem 2.
Chromatogramm (Abb. 73). Offensichtlich hatte die Erniedrigung des Phosphatpuffer-anteils auf das TP keine sichtbaren Auswirkungen.
Eine Erklärung könnte die Tatsache liefern, dass TP im Vergleich zu den anderen Thiaminphosphaten durch das Vorhandensein nur eines Phosphatrestes möglicherweise wie das freie Thiamin an der unpolaren RP-8-Phase gebunden wurde und somit eine Erhöhung des Phosphatpufferanteils der mobilen Phase keine oder nur geringe Auswirkungen hatte.
Nachdem die Trennung von T, TP und TP2 zunächst für ausreichend befunden wurde, sollte als nächster Schritt der Phosphatpuffer in beiden Eluenten ersetzen werden, da dieser sich bei einer eventuell weiterführenden Problematik bezüglich der Identifikation unbekannter Substanzen mittels Massenspektrometrie zu einem Störfaktor entwickeln würde. Weiterhin bestand die Gefahr des Verstopfens der Säulen und Pumpen durch sich ablagernde Phosphatkristalle.
Zunächst wurde Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) in gleicher Molarität und in gleicher Mischung mit Acetonitril anstelle des Phosphatpuffers eingesetzt. Die
TP2
TP T
Schwierigkeit und letztendlich auch Unbrauchbarkeit für unsere Untersuchungen fand sich in der Tatsache, dass der pH-Wert der Eluenten nicht einstellbar war. Durch fortlaufende CO2-Ausgasung aus dem Puffer war der pH-Wert der Eluenten nach 10 Stunden von pH 7,2 auf pH 8,15 gestiegen, somit konnte kein Eluent fixen, reproduzierbaren Rahmen-bedingungen unterworfen werden.
Neben NH4HCO3 wurde Ammoniumchlorid (NH4Cl) als Phosphatpufferersatz ausprobiert.
Der Ansatz erfolgte wieder analog zu beiden Phosphatpuffereluenten, die Schwierigkeit war hier allerdings in zu kleinen Peaks zu sehen, die bei Verwendung der gleichen Konzentration der Standardlösung nur maximal der Hälfte der Peaks mit Phosphatpuffereluent entsprachen (vgl. Abb. 74 und 75). Weiterhin war eine Elution des Thiamins nur mit Doppelspitze möglich. Somit ging die Vermeidung des Phosphatpuffers deutlich auf Kosten der Nachweisgrenze und folglich war auch dieser Puffer wenig geeignet.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 75: 4. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: Acetonitril-NH4Cl, 75 mM (37:63), pH 7,15 Eluent B: Acetonitril-NH4Cl, 75 mM (50:50), pH 7,15 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
Es folgte die Rückkehr zum Phosphatpuffer. Die nächste Veränderung bestand in einer Erhöhung des pH-Wertes beider Eluenten auf pH 7,25. Der hohe pH-Wert von 8 im anfänglichen isokratischen Problem zeigte sich in kurzen Retentionszeiten. Dies war nun auch gewünscht, um TP2 wieder von fast 40 min Retentionszeit schneller von der Festphase zu lösen. Die Folgen der pH-Wert-Erhöhung zeigten sich in Abb. 76.
TP2
TP T
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Abb. 76: 5. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,25
Eluent B: ACN – Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit
K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
TP2 war deutlich weniger retardiert, während T und TP noch immer gut getrennt waren.
Time Flow Pump Pump hh:mm:ss mL/min %A %B
00:00:00 0,7 97 3
00:05:00 0,7 3 97
00:25:00 0,8 3 97
00:31:00 0,7 3 97
00:31:01 0,7 97 3
01:00:00 0,7 97 3
Tab. 23: 4. Gradientensystem
Time: Zeit, die der Analysenlauf dauert
Flow: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase Pump A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase Pump B: Anteile des Eluenten B an der mobilen Phase
Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,25
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5,
und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25
Um die Trennung von T und TP beizubehalten, TP2 aber noch näher heranzuführen wurde eine Flussratenerhöhung vorgenommen. Das Programm der neuen Methode ist in Tab. 23 zusammengefasst.
TP2
TP T
Die Flussrate des Eluenten wurde von 5 min bis 25 min kontinuierlich auf 0,8 mL/min erhöht und dann bis zur 31. Minute auf diesem Level gehalten. Zwischen der 25. und 31.
Min sollte das TP2 von der Säule eluieren (siehe Abb. 76) und musste durch eine Erhöhung der Flussrate schneller im Chromatogramm erscheinen. T und TP dürften theoretisch nur wenig beeinflusst werden. Ein Abbild des Chromatogramms ist unter Abb.
77 zu finden.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 77: 6. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,25
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit
K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
T und TP hatten ebenfalls geringgradig verkürzte Retentionszeiten entwickelt, erklärbar durch die nur langsame Erhöhung der Flussrate, die bereits 5 min nach Start der Analyse begann (siehe Tab. 23) und erst nach 25 min die volle Rate von 0,8 mL/min erreicht hatte.
Also wurden auch diese beiden Substanzen von der schon geringgradig erhöhten Flussrate schneller eluiert.
Im Hinblick auf die spätere Untersuchung des Schweinefleisches wurde zu diesem Zeitpunkt der Methodenentwicklung TP3 mit in den Standard aufgenommen. Da der TP3 -Standard nicht unbegrenzt vorhanden ist, sind die Vorversuche ohne TP3 unternommen worden.
TP2
TP T
Eine Zugabe zur Standardlösung von 400 ng/mL TP3 ohne Veränderung der Methode oder der Eluenten führte zum in Abb. 78 dargestellten Chromatogramm.
-50 0 50 100 150 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Abb. 78: 7. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,25
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde
vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher – 100 – NH2 Säule
Als Nebenbefund wurde auch hier wieder die Veränderung der Peakflächen der niedriger phosphorylierten Thiaminphosphate bei Zugabe der nicht mehr reinen TP3–Stammlösung deutlich. Da diese Versuchsreihe aber nicht auf Gehaltsbestimmungen sondern auf die Optimierung von Retentionszeiten zielte, konnte diese Tatsache ignoriert werden.
Die Retentionszeit des TP3 war ohne weitere Änderung der Methode zu lang, um es in angemessener Zeit mehrmals täglich bestimmen zu können. Analog zur Erniedrigung des Gehaltes an Phosphatpuffer zur Verlängerung der Retentionszeiten wurde nun der Phosphatpuffergehalt des Eluenten B auf 100 mM bei einem bleibenden pH von 7,25 erhöht, um die Peaks in kürzerer Zeit nachzuweisen. Die Methode (siehe Tab. 23) sowie Eluent A wurden beibehalten. Das folgende Chromatogramm (Abb. 79) zeigt das Ergebnis dieser Änderung.
TP3
TP2
TP T
-50 0 50 100 150 200 250 300
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 79: 8. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensystem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (75 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (37:63), pH 7,25
Eluent B: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (100 mM), ca. pH 4,5, und K2HPO4 (75 mM), ca. pH 9; KH2PO4 wurde vorgelegt und
mit K2HPO4 auf pH 6,5 eingestellt) (50:50), pH 7,25 stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher – 100 – NH2 Säule
TP2 und TP3 sind nun zufriedenstellend und in nicht zu langer Zeit aber dennoch deutlich voneinander getrennt, lediglich bei T und TP besteht noch die Gefahr, dass sie, besonders bei hohen Konzentrationen, nicht mehr vollständig voneinander differenzierbar sind.
Um auch diesen Bereich zu optimieren, wurde Eluent A verändert. Die Phosphatpufferkonzentration betrug nur noch 70 mM bei einem End-pH-Wert von 7,15 (Abb. 80).
Diese Trennung der Analyten ist für die Routinediagnostik als zufriedenstellend zu bewerten, so dass die Methode im Lauf der Probenanalysen nur noch geringgradig, aufgrund von Abnutzungserscheinungen der NH2-Säule, verändert wurde und letztendlich wie in Tab. 24 dargestellt Anwendung findet.
TP2
TP3
TP T
-50
Abb. 80: 9. Chromatogramm nach Wechsel zum Gradientensytem
mobile Phase: Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (70 mM), ca. pH stationäre Phase: Eurospher-100-C-8-Vorsäule kombiniert mit
Eurospher-100-C-8-RP-Säule und LiChrospher-100-NH2 Säule
Time Flow Pump Pump
Tab. 24: 5. Gradientensystem
Time: Zeit, die der Analysenlauf dauert
Flow: Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase Pump A: Anteile des Eluenten A an der mobilen Phase Pump B: Anteile des Eluenten B an der mobilen Phase
Eluent A: ACN-Phosphatpuffer (aus KH2PO4 (65 mM), ca. pH 4,5, und
Die routinemäßig verwendeten Eluenten setzen sich zusammen aus:
Eluent A: 37 % ACN/ 63 % Phosphatpuffer (65 mM) aus K2HPO4 und KH2PO4 (pH 6,5); End-pH des Eluenten: 7,15, eingestellt durch 0,1-molare HCl
TP3
TP2
TP T
Eluent B: 40 % ACN/ 60 % Phosphatpuffer (110 mM) aus K2HPO4 und KH2PO4 (pH 6,5);End-pH des Eluenten: 7,25
-50 0 50 100 150 200 250 300
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retentionszeit [min]
Peakfläche [mV]
Abb. 81: Chromatogramm nach letzter Änderung der Methode
Abb. 81: Chromatogramm nach letzter Änderung der Methode