3 Material und Methoden
3.2. Methoden
3.2.6 Genotypische Bestätigung des Erregers mittels Polymerase-Kettenreaktion
Prinzip
Die PCR ist eine Methode zur enzymatischen Synthese spezifischer DNA-Sequenzen unter in vitro Bedingungen, wobei das Reaktionsprinzip der Replikation der DNA bei der Zellteilung in vivo entspricht. Gegenüber den lebenden Zellen kann die PCR jedoch nur kurze DNA-Abschnitte kopieren und vervielfältigen. Es können so einzelne Gene oder auch nicht-kodierende DNA-Sequenzen vervielfältigt werden. Das Prinzip beruht auf einer exponentiellen enzymatischen Vermehrung eines genau definierten DNA-Abschnitts des Genoms in einer zyklisch ablaufenden Reaktion. Bei dieser Reaktion dienen die Reaktionsprodukte eines Zyklus als Matrize für die Vermehrung im nächsten Zyklus. Für die Replikation werden eine Matritze (Template-DNA), eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase, Desoxynukleotide, zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotide (Primer), die als Starter für die Polymerase dienen, und ein passendes Puffersystem benötigt. Ein Zyklus einer PCR besteht aus folgenden Teilschritten:
1. Thermische Denaturierung:
Aufschmelzung der DNA-Doppelstränge in komplementäre Einzelstränge bei 94 bis 96 °C.
2. Annealing:
Hybridisierung der Oligonukleotidprimer. Dabei lagern sich zwei sequenzspezifische Oligonukleotidprimer bei geeigneter Temperatur über Wasserstoffbrückenbindungen an komplementäre Sequenzen der DNA-Einzelstränge an.
3. Elongation:
Von den Primersequenzen ausgehend synthetisiert die temperaturabhängige DNA-Polymerase (Taq-DNA-Polymerase) einen neuen, jeweils komplementären DNA-Strang.
Diese Schritte werden als Zyklus mehrfach wiederholt. Auf diese Weise kann durch die Abfolge von z. B. 35 Zyklen die Ausgangsmenge an DNA 68-milliardenfach vermehrt werden. Statt nur mit einem Primerpaar zu arbeiten, können in einem PCR-Ansatz auch
mehrere Primerpaare gleichzeitig eingesetzt werden. Hierdurch erhält man die sogenannte Multiplex-PCR.
Anschließend kann das PCR-Produkt durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. Durch Anfärben der DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B.
Ethidiumbromid) kann sie durch Beleuchtung mit UV-Licht sichtbar gemacht werden.
Durchführung der PCR
Für jedes Isolat wurde eine PCR zur Bestätigung der Spezies sowie der Methicillinresistenz durchgeführt. Ziel dieser Untersuchung waren der Nachweis eines S. aureus spezifischen DNA-Fragments (nuc Gen) und der Nachweis des für die Methicillinresistenz verantwortlichen mecA Gens.
Ansetzen der Gebrauchslösungen
Tris-EDTA Puffer, pH 8,0
In Aqua dest. wird 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 200 μl 1 mM EDTA (pH 8,0) gelöst.
Anschließend wird die Lösung mit Aqua dest. auf 100 ml aufgefüllt und mit einem Sterilfilter filtriert.
Lysispuffer
Tab. 3: verwendete Sustanzen für den Lysispuffer.
Substanz Menge
0,1 M Tris-HCL 1,214 g
0,05 % Tween 20 50 μl
240 μg/ ml Proteinase K 24 mg 5 mg/ ml N Acetyl-L-Cystein 500 mg
Zur Herstellung des Lysispuffers wurden 1,214 g Tris in ca. 50 ml LiChrosolv gelöst. Der pH- Wert wurde durch Zugabe von 1 M HCL-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und im Folgenden dann Tween 20, Proteinase K und N Acetyl-L-Cystein darin gelöst. Der Puffer wurde daraufhin mit LiChrosolv auf 100 ml aufgefüllt und durch einen Sterilfilter filtriert.
Gelladepuffer
5,0 ml Glycerin werden zu 0,025 g Bromphenolblau-Natriumsalz gegeben und dann mit Aqua dest. auf 10 ml aufgefüllt. Anschließend wird der Puffer sterilfiltriert.
Manuelle Extraktion der DNA
Die manuelle Extraktion von genomischer DNA erfolgte unter Verwendung des Lysispuffers Tris-HCL mit einem pH-Wert 8,5.
Die manuelle Extraktion der DNA erfolgte aus einer Bakterienkultur, die zuvor auf Columbia-Blutagar angezüchtet wurde. Je 1 ml Tris-EDTA Puffer wurde in beschriftete 2 ml Eppendorf Cups pipettiert und eine Standardtrübung McFarland 2,0 durch Verreiben der Bakterienkultur in dem Puffer mittels einer sterilen Einmalöse hergestellt. Die anschließende Zentrifugation der Suspension fand bei 20 000 g für zehn Minuten statt. Der Überstand wurde dekantiert. Zur Lysis wurde das im Eppendorf Cup verbliebene Pellet durch Zugabe von je 500 μl Lysispuffer Tris-HCL pH 8,5 resuspendiert und auf dem Vortex geschüttelt. Die Ansätze wurden eine Stunde bei 60°C und anschließend für 15 Minuten bei 95°C in einem Thermoschüttler inkubiert. Danach fand eine erneute Zentrifugation für zehn Sekunden bei 6500 g statt. Der DNA-Extrakt wurde sofort weiterverarbeitet.
Um Verunreinigungen und Methodikfehler auszuschließen ist bei jedem Lauf eine Präparationspositivkontrolle (Suspensionsmedium und spezifischer Referenzstamm) und eine Präparationsnegativkontrolle (Suspensionsmedium) mitgeführt worden.
Herstellung des Reaktionsansatzes für die PCR
Zur Durchführung der im Weiteren beschriebenen PCR-Ansätze erfolgte standardmäßig die Erstellung des Reaktionsgemisches (Mastermix). Der Ansatz des Mastermixes erfolgte in einer Sterilbank auf Eis unter Verwendung von Filterpipettenspitzen.
Die Primer für den benötigten Primer-Mix wurden zuvor laut Synthesereport einzeln auf je 100 pmol/μl gelöst (Stammlösung) und daraufhin folgende Arbeitslösung hergestellt:
Tab. 4: Volumen der Arbeitslösung für den Primermix.
Primer Volumen je Arbeitslösung
Mec up 1 und mec up 2 25 pmol/μl
nuc PCR1 und nuc PCR2 20 pmol/μl
Die Arbeitslösungen eines jeden Primers wurden zu gleichen Teilen plus zwei Teile LiChrosolv in ein 0,2 ml Eppendorf-Cup Safe-Lock pipettiert (Primer-Mix).
Der auf Eis pipettierte Reaktionsansatz (Master-Mix) setzte sich wie folgt zusammen:
Tab. 5: Reaktionsansatz für den Mastermix.
Substanz Volumen je Probe
Aqua bidest. 2,5 μl
Ready Mix TM Taq PCR 12,50 μl Primer-Mix (4 Primer enthalten) 7,50 μl
Gesamt-Volumen je Probe 22,50 μl
Die Lösung wurde anschließend mit der Menge von 22,50 μl pro Probe in Eppendorf Cups, Safe-Lock 0,2 ml pipettiert. Zum Master-Mix wurden anschließend pro Probe 2,50 μl der Template-DNA pipettiert.
Der fertige Reaktionsansatz wurde für 15 Sekunden bei 5000 g zentrifugiert und anschließend unter Einhaltung des folgenden Amplifikationsprotokolls in den Thermocycler eingesetzt:
Tab. 6: Temperaturprotokoll PCR
Temperatur (C°) Zeit (Minuten)
First denaturation 94 05:00
Denaturation 94 0:30
30 Zyklen
Annealing 55 0:30
Extension 72 0:45
Final extension 72 05:00
Agarosegelelektrophorese
Nukleinsäuren sind aufgrund ihres Kohlenhydrat-Phosphat-Rückgrates negativ geladen. Im Agarosegel wird DNA elektrophoretisch nach ihrer Größe getrennt, sie wandert im elektrischen Feld zum Pluspol. Dabei ist die Beweglichkeit linearer DNA-Fragmente innerhalb eines bestimmten Größenbereiches proportional zu dem Logarithmus ihrer Molekulargewichte.
Auf Grund der Größe der zu erwartenden Amplifikate wurde ein 1,5 %-iges Agarosegel hergestellt. Dazu wurden 3 g Multi-Agarose in einen 200 ml Erlenmeyerkolben eingewogen.
Zur Agarose wurde 20 ml TAE-Puffer und 180 ml Aqua dest. hinzugegeben und so die Agarose bei 100°C für eine Stunde auf dem Magnetrührer gelöst. Der flüssige Agar wurde dann auf 60°C abgekühlt und blasenfrei auf einen Gelträger mit justiertem 26iger Kamm in eine Flachbettform gegossen. Das Gel kühlte bei 6°C für 30 Minuten im Kühlschrank ab.
Nach Erstarren des Gels wurde der Kamm entfernt und die Elektrophoresekammer mit 500 ml Laufpuffer gefüllt. Als Laufpuffer diente TAE-Puffer 1:10 mit Aqua dest. verdünnt.
Das Amplifikat wurde bei 5000 g für 15 Sekunden zentrifugiert und dann je 10 μl Amplifikat zu 4 μl Gelladepuffer in einer Mikrotiterplatte pipettiert und vermischt. Je 1,5 μl DNA-Ladder wurde mit 4 μl Gelladepuffer und 8,5 μl LiChrosolv vermischt. In jede Tasche des Gels wurden 10 μl pipettiert. Der DNA-Ladder zur Bemessung des Längenstandards sowie die
Positivkontrolle und die Negativkontrolle wurden mit aufgetrennt. Schließlich wurde die Elektrophoresekammer verschlossen und für eine Stunde eine Spannung von 170 V angelegt.
Ethidiumbromidfärbung
Zur optischen Darstellung der Fragmente wurden die Gele nach der Gelelektrophorese in einer Lösung aus 50 ml TAE-Puffer, 450 ml Aqua dest. und 100 μl Ethidiumbromid 0,1 %ig gefärbt. Nach 30 Minuten wurde das Gel aus der Färbelösung entnommen und für fünf Minuten in Aqua dest. gegeben und gewaschen. Anschließend wurde das gefärbte und gewaschene Gel unter UV-Licht in einer Fotokammer digital fotografiert. Die UV-Licht Exposition betrug 8/30 Sekunden und 20/30 Sekunden. Die Beurteilung der Bilder erfolgte mittels der Software „Alpha-Imager“.