Identifizierung von gerichteten und ungerichteten Stressreaktionen als Effektoren im nicht-viralen Transfektionsprozess

Identifizierung von gerichteten und ungerichteten Stressreaktionen

als Effektoren im nicht-viralen Transfektionsprozess

vorgelegt von

Diplom-Ingenieurin Eva Graf

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften -Dr. rer.

nat.-genehmigte Dissertation

Berlin 2009 D83

Identifizierung von gerichteten und ungerichteten Stressreaktionen

als Effektoren im nicht-viralen Transfektionsprozess

vorgelegt von

Diplom-Ingenieurin Eva Graf

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften -Dr. rer.

nat.-genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. R. Lauster Berichter: Prof. Dr. C. Lang Berichter: Prof. Dr. U. Stahl

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 27. März 2009

Berlin 2009 D83

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl möchte ich sehr dafür danken, dass ich die Doktorarbeit am Institut für Biotechnologie, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik, der Technischen Universität Ber-lin anfertigen konnte. Seine Unterstützung hat mir immer wieder Motivation gegeben.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Christine Lang für ihre wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung zum Gelingen dieser Arbeit. Sie hat mir gezeigt, dass Freude an dem, was man tut, stets der beste Antrieb ist.

Mein Dank gilt natürlich auch allen Mitarbeitern der AG Lang für ihre stete Diskussionsfreu-de. Hervorgehoben danke ich Viktor Sterzer für sein Engagment, mich im Rahmen einer Stu-dien- und Diplomarbeit in dem umfassenden Projekt zu begleiten.

Für konstruktive Hilfestellungen zum Aufbau des Zellkulturlabors und zur Etablierung der Techniken danke ich PD Dr. Reinhard Geßner und Dr. Corinna Dietel vom UK Leipzig, Prof. Dr. Tanja Schwerdtle von der Universität Münster, Timo Neubert vom Institut für Lebens-mitteltechnologie und Lebensmittelchemie der TU Berlin und Birgit Baumann der AG Lang sowie Dr. Ulrike Ziebold vom Max-Delbrück-Zentrum Berlin.

Sehr herzlich möchte ich mich bei PD Dr. Udo Schmidt, Dr. habil. Vera Meyer, Dr. Cornelia Luban, Dr. Markus Veen, Gregor Poplawsky und Rita Waggad für die hilfreichen Ratschläge und angenehmen Plaudereien danken.

Schließlich bedanke ich mich speziell bei meiner Familie und meinen Freunden, die mich stets unterstützt haben.

Inhaltsverzeichnis

1

Einleitung ... 1

2

Problemstellung ... 13

3

Material und Methoden ... 18

3.1 Material ... 18

3.1.1 Biologisches Material... 19

3.1.2 Medien ... 20

3.1.3 Puffer, Lösungen, Verbrauchsmaterial ... 21

3.1.4 Verwendete Lösungen und Substanzen in der Zellkultur ... 21

3.1.5 Plasmide ... 22 3.2 Methoden ... 22 3.2.1 Allgemeine Techniken ... 22 3.2.1.1 Gefrierkultur... 22 3.2.1.2 Kultivierung... 22 3.2.1.3 E.coli Transformation... 22

3.2.1.4 Plasmidisolation aus E. coli (Maxi-Prep) ... 23

3.2.1.5 Konzentrationsbestimmung der DNA-Lösung ... 23

3.2.1.6 Agarose-Gelelektrophorese ... 23

3.2.1.7 Überprüfung der Deletionsmutanten ... 24

3.2.1.7.1 PCR-Programm ... 24

3.2.1.7.2 Isolierung genomischer DNA... 24

3.2.2 Hefe-Transfektion... 25 3.2.2.1 Transfektion... 25 3.2.2.2 Screeningverfahren ... 26 3.2.2.3 Sorbit-Test... 27 3.2.3 LY-Färbung ... 28 3.2.4 Quinacrin-Färbung ... 28 3.2.5 FM4-64-Färbung ... 29 3.2.6 Oxidativer Stress-Assay ... 29 3.2.7 Sensitivitätstest ... 31 3.2.8 DNSS-Zuckernachweis ... 31 3.2.9 Säugerzell-Kultivierung... 32

3.2.9.1 Zellkultur von HepG2- und A549-Zellen ... 32

3.2.9.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen... 32

3.2.9.3 Transfektion von HepG2- und A549-Zellen... 33

3.2.9.4 Quantifizierung von Lucifer Yellow (LY) ... 34

3.2.9.5 HepG2-Färbung mit Lucifer Yellow (LY) ... 34

3.2.9.6 Knock down von Rab5A ... 35

3.2.9.6.1 Protein-Nachweis ... 35

3.2.9.6.1.1 Proteinauftrennung für ca. 30 kDa große Proteine ... 35

3.2.9.6.1.2 Western Blot: ... 36

3.2.9.6.1.3 Coomassie-Färbung ... 36

3.2.9.6.2 siRNA-Reverse- mit anschließender Luciferase-Transfektion ... 36

4

Ergebnisse ... 38

4.1 Transfektionssteigerung durch erhöhten pH-Wert intrazellulärer Kompartimente ...38

4.1.1 Inhibitoren von Ansäuerungsprozessen in Hefe ...39

4.1.1.1 Zink ...39

4.1.1.2 DIDS ...45

4.1.2 Inhibitoren von Ansäuerungsprozessen in HepG2- und A549-Zellen ...47

4.1.2.1 Zink und DIDS...47

4.1.2.2 Chloroquin...53

4.2 Transfektionssteigerung durch cytosolischen Stress...57

4.2.1 Oxidative Stress-Induktoren in Hefe...58

4.2.2 Oxidative Stress-Induktoren in HepG2- und A549-Zellen ...60

4.2.3 Defekte Stressantwort in Hefe...65

4.2.3.1 Einfluss der oxidativen Stress-Antwort auf den Transfektionsprozess ...65

4.2.3.2 Einfluss von zellulären Entgiftungsprozessen auf den Transfektionsprozess68 4.2.3.3 Oxidativer Stress in Stämmen mit defekten Entgiftungsprozessen ...77

4.2.4 Wirkungssteigerung durch Transfektions-Enhancer ...79

4.2.4.1 Transfektions-Enhancer in Hefestämmen mit defektem Entgiftungsprozess79 4.2.4.2 Kombination von Transfektions-Enhancern in HepG2- und A549-Zellen ....82

4.3 Transfektionssteigerung durch Blockade des endocytotischen Transportes ...83

4.3.1 siRNA vermittelte Herunterregulierung von Rab5a in HepG2 ...84

4.3.2 Einfluss von siRNA vermittelten knock down von Rab5a auf Transfektionseffizienz von HepG2 und A549...86

5

Diskussion ... 88

5.1 Cytosolischer Stress...89

5.1.1 Stressoren ...90

5.1.1.1 Perturbation des Ansäuerungsprozesses ...90

5.1.1.2 Oxidativer Stress...96

5.1.2 Targetvalidierung ...99

5.1.2.1 Perturbation des endozytotischen Transportes...99

5.1.2.2 Oxdidative Stressantwort ...101

5.1.2.3 Transporter vermittelte Stressanwort...103

5.1.3 Saccharose und Zell-Metabolite als Stressoren ...108

5.2 Unterschiede zwischen den Zellsystemen ...109

5.3 Erkenntnisse zum Transfektionsprozess...111

6

Zusammenfassung ... 113

7

Ausblick... 114

8

Literatur ... 115

Abkürzungsverzeichnis

AFU Arbitrary Fluorescence Units

APS Ammoniumpersulfat ATB Antibiotika bp Basenpaare bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise CaCl2 Kalziumchlorid

CDF Cation Diffusion Facilitator CuSO4 Kupfersulfat

DEAE (Diethylamino)ethyl

Diamid Azodicarboxylic acid

bis(dimethylamid)

DIDS Diisothiocyanostilbene disul-fonic acid

DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF epidermal growth factor

FCS Fetal Calf Serum

FeSO4 Eisensulfat g Gramm ggf. gegebenenfalls h Stunde(n) HE Heringssperma H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid K2HPO4 Dikaliumhydrogenphosphat KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat kb Kilobasen

KBE Kolonien bildende Einheiten

l Liter LY Lucifer Yellow M Mol / Liter µg Mikrogramm mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO4 Magnesiumsulfat

MFS Major Facilitator Superfamily

min. Minuten ml Milliliter mM Milimol / Liter MnCl2 Manganchlorid msec. Millisekunden NaCl Natriumchlorid Na2HPO4 di-Natriumhydrogenphosphat Na2MoO4 Natriummolybdat NaOH Natronlauge NH4Cl Ammoniumchlorid nm Nanometer n.t. nicht getestet 4NQO 4-Nitro-Quinolin-N-Oxid OD optische Dichte

PBS Phosphat buffered saline PCR Polymer Chain Reaction PEG Polyethylenglycol

ROS reactive oxygen species

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

s. siehe

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

sog. sogenannt

SDS Sodiumdodecylsulfat TAE Tris/Acetat/EDTA

TE Tris/EDTA

Tris Tris(hydroxymethyl) aminoe-than U Units UV Ultraviolette Strahlung V Volt VF Verdünnungsfaktor WT Wildtyp ZnCl2 Zinkchlorid ZnSO4 Zinksulfat

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Wirkmechanismen sowie Regeneration von Glutathion und Thioredoxin. ...4

Abbildung 2: Topologie und Domänenanordnung der ABC-Transporter Subfamilien...8

Abbildung 3: Endozytotischer Transport. ...13

Abbildung 4: Korrelation von Zellen pro ml bei Ernte und Transfektionseffizienz ...26

Abbildung 5: Endocytoseverlauf mittels Lucifer Yellow-Färbung in Hefe ...28

Abbildung 6: Oxidativer Stress in Abhängigkeit von der H2O2-Konzentration und der Inkubationszeit in Hefe...30

Abbildung 7: Einfluss von H2O2 auf das Hefe-Wachstum im Wildtyp ...31

Abbildung 8: Einfluss von Insulin auf die Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen...33

Abbildung 9: Visualisierte Ansäuerung der Vakuole mit und ohne Zinkchlorid (100 µM) in Hefe BY4741 ...40

Abbildung 10: Färbung mit Endozytose-Marker Lucifer Yellow und Membran-Marker FM4-64 mit/ohne Zinkchlorid (300 µM) nach 3,5 h ...40

Abbildung 11: Transfektionseffizienz [-] von Zinkchlorid in verschiedenen Konzentrationen als Faktor in Hefe im Verhältnis zu Proben ohne Zinkchlorid...41

Abbildung 12: Transfektionsfaktor [-] in Abhängigkeit von Energie und Zink (100 µM) ...43

Abbildung 13: Endozytose...43

Abbildung 14: Transfektionsfaktoren [-] von Zink in Wildtyp und den Deletionsstämmen vps21 und ypt7...44

Abbildung 15: Darstellung der Funktion und Lokalisation von den Zinktransportern Zrt3p, Zrc1p und Cot1p. ...44

Abbildung 16: Visualisierte Vakuolen und Ansäuerung der Vakuole mit und ohne DIDS (10 µM) ...46

Abbildung 17: Transfektionsfaktoren [-] von Zinkchlorid in verschiedenen Konzentrationen als Faktor in HepG2 und A549. ...47

Abbildung 18: Transfektionsfaktoren [-] von DIDS in verschiedenen Konzentrationen in den Zelllinien HepG2 und A549. ...48

Abbildung 19: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von ZnCl2 (1 µM) und DIDS (10 µM) in HepG2-Zellen im Vergleich zur Kontrolle ohne Substanz (100 %) in Prozent...49

Abbildung 20: Akkumulierung des fluid phase-Endozytose-Markers Lucifer Yellow in HepG2-Zellen. ...51

Abbildung 21: Färbung von HepG2 Zellen mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow mit und ohne ZnCl2 (1 µM)...52

Abbildung 22: Einfluss von Chloroquin (100 µM) auf die Transfektionseffizienz der Zelllinien HepG2 und A549. ...54

Abbildung 23: Einfluss von Chloroquin (100 µM) auf die Akkumulierung vom fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen. ...55

Abbildung 24: Färbung von HepG2-Zellen mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow mit und ohne Chloroquin (100 µM) ...57

Abbildung 25: Lucifer Yellow-Färbung der Zellen mit und ohne Diamid (10 µM) nach 3,5 h .59 Abbildung 26: Visualisierte Vakuolenmembran mit und ohne H2O2 (10 µM) nach 3,5 h...59

Abbildung 27: Einfluss von Diamid in verschiedenen Konzentrationen auf die Transfektionseffizienz der Zelllinien Hepg2 und A549. ...60

Abbildung 28: Einfluss von H2O2 in verschiedenen Konzentrationen auf die Transfektionseffizienz der Zelllinien HepG2 und A549. ...61

Abbildung 29: Einfluss von Diamid (1 µM) und H2O2 (100 µM) auf die Akkumulierung vom fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen. ...62

Abbildung 30: Färbung von HepG2 Zellen mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow ...64

Abbildung 31: Einfluss von verschiedenen Defekten in der oxidativen Stressantwort und von pbi2 auf die Transfektionseffizienz [-] in Hefe in Bezug auf den Wildtyp...66

Abbildung 32: Durch Lucifer Yellow-Färbung visualisierter Endozytosezeitpunkt in Stämmen mit einem Defekt in der Thioredoxin-Synthese nach 3,5 h ...67

Abbildung 33: Visualisierte Vakuolenmembran in gsh1 und im Wildtyp nach 3,5 h ...68 Abbildung 34: Zusammenhang zwischen den Genen der oxidativen Stressantwort und denen der Entgiftungsprozesse I...69 Abbildung 35: Transfektionsfaktoren und Visualisierung der Endozytose von snq2, pdr5 und ycf1 im Verhältnis zum Wildtyp ...70 Abbildung 36: Färbung von ∆snq2 und ycf1 und Wildtyp mit dem Membran-Marker FM4-6471 Abbildung 37: Zusammenhang zwischen den Genen der oxidativen Stressantwort und

denen der Entgiftungsprozesse II + III...73 Abbildung 38: Färbung von Stämmen mit einem Defekt in Entgiftungsprozessen an der Plasmamembran und Wildtyp mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow ...75 Abbildung 39: Visualisierte Vakuolenmembran von pdr10 und Wildtyp nach 3,5 h...76 Abbildung 40: Einfluss vom Medium auf die Endozytose im Wildtyp an dem Beispiel der FM4-64-Färbung nach 3,5 h...78 Abbildung 41: Transfektionsfaktoren [-] von DIDS (10 µM) und Diamid (10 µM) im Wildtyp,

snq2 und pdr5 ...79

Abbildung 42: Einfluss von Quinidin im Wildtyp und in einer Quinidin-Transporter-Mutante

qdr1 auf die Transfektionseffizienz ...81

Abbildung 43: knock down von Rab5a nach 48 h siRNA-Transfektion mit unterschiedlichen siRNA Konzentrationen und Fugene HD-Volumina ...85 Abbildung 44: knock down von Rab5a nach 72 h siRNA-Transfektion mit 6 pmol

Rab5a-siRNA und 4 µl Fugene HD-Reagenz ...86 Abbildung 45: Transfektionseffizienz nach einem knock down von Rab5a und GAPDH in HepG2- und A549-Zellen. ...87 Abbildung 46: Darstellung des Einflusses vom intakten und defekten Entgiftungsprozess in Gegenwart vom Stressfaktor Quinidin...105 Abbildung 47: Einfluss von cytosolischem Stress auf den endozytotischen Transportweg .112

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1-1: multidrug resitance vermittelnde Proteine in Hefe / Proteinfamilie im Säuger und

Inhibitoren der Säugerproteine ... 9

Tabelle 1-2: Übersicht von Transkriptionsfaktoren und ihre für die Arbeit relevanten Target-Gene ... 12

Tabelle 3-1: Verwendete Substanzen und ihre Hersteller ... 18

Tabelle 3-2: Liste der verwendeten Hefe-Stämme ... 19

Tabelle 3-3: Liste der verwendeten Säugerzelllinien ... 20

Tabelle 3-4: Verwendete Medien mit Verwendungszweck ... 20

Tabelle 3-5: Liste der generell verwendeten Puffer und Lösungen... 21

Tabelle 3-6: Liste der verwendeten Substanzen und Lösungen... 21

Tabelle 3-7: Zusammensetzung des Proteingels ... 35

Tabelle 4-1: Transfektionsfaktoren [-] durch Omeprazol in 5 % DMSO im Verhältnis zu Proben ohne Omeprazol im Wildtyp ... 39

Tabelle 4-2: Vergleich der Transfektionsfaktoren [-] von Zink- und Chlorionen ... 42

Tabelle 4-3: Transfektionsfaktoren [-] von Stämmen mit defekten Zinktransportern in Gegenwart von ZnCl2 (100 µM) ... 45

Tabelle 4-4:Einfluss von DIDS in verschiedenen Konzentrationen auf die Transfektionseffizienz im Verhältnis zu Proben ohne DIDS. ... 46

Tabelle 4-5: Vergleich der Transfektionseffizienz von Zinkchlorid, -sulfat und Magnesiumchlorid in HepG2 (Konzentration: 1 µM) ... 48

Tabelle 4-6: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von Zinkchlorid (1 µM) oder DIDS (10 µM) in HepG2-Zellen in [%] ... 50

Tabelle 4-7: Akkumulation vom fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit und den Additiven ZnCl2 (1 µM) und DIDS (10 µM) ... 51

Tabelle 4-8: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von Chloroquin (100 µM) in HepG2- und A549-Zellen in [%]... 54

Tabelle 4-9: Akkumulation vom fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit und Chloroquin (100 µM) ... 56

Tabelle 4-10: Transfektionsfaktoren der getesteten Oxidationsmittel in Hefe... 58

Tabelle 4-11: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von Diamid (1 µM) in HepG2- und A549-Zellen in [%]... 61

Tabelle 4-12: Akkumulation vom fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit und den Additiven Diamid (1µM) und H2O2 (100 µM)... 63

Tabelle 4-13: Liste verschiedener Stämme mit Defekt im Entgiftungsprozess und deren Transfektionsfaktor in Bezug zum Wildtyp. ... 74

Tabelle 4-14: Oxidativer Stress von verschiedenen Stämmen in verschiedenen Medien in Prozent [%]... 77

Tabelle 4-15: Sensitivität (+) der Deletionsstämme auf die Substanzen Methylglyoxal (0,01-1 %), Essigsäure (1-50 mM), Pyruvat (0,1-100 mM) und 2-Oxoglutarsäure (1-50 mM)... 80

Tabelle 4-16: Prozentuale Transfektionssteigerung durch die Kombination von Chloroquin (100 µM) mit Zinkchlorid (0,1 µM), Diamid (1 µM), DIDS (10 µM) oder H2O2 (1 µM) in HepG2– und A549-Zellen ... 82

Tabelle 4-17: Transfektionsfaktor des Deletionsstammes vps21 in Hefe ... 84

1 Einleitung

Vitale Zellen besitzen die Fähigkeit, auf ungünstige Umweltbedingungen mit einer Anpassung ihres Metabolismus' durch starke Veränderungen von über hunderten Genen auf der Transkriptions-Ebene zu reagieren [Gasch et al. (2000)]. Dieses Phänomen wird im Allgemeinen als Stressantwort (ESR: environmental stress

res-ponse) bezeichnet. Sie ist für jede Zelle charakteristisch, außerordentlich komplex

und wird in Abhängigkeit von der Stressart durch verschiedene Transkriptionsfakto-ren reguliert. Zum Schutz der Zelle werden verschiedene Proteine, die in allen Or-ganismen stark konserviert sind, verstärkt exprimiert. Generell sind ruhende Zellen nicht so stressanfällig wie sich replizierende Zellen [Gasch et al. (2000)]. In Stress-antworten sind hauptsächlich essentielle Proteine mit Funktion in der DNA-Reparatur, im Proteinabbau, im Energie- und Fettsäuremetabolismus, in der Trans-lation, im Zellzyklus, in der Redox-Regulation sowie Chaperone und ABC-Transporter involviert [Kültz (2003), Kültz (2005)].

Eine Beschädigung von DNA kann Doppel- oder Einzelstrangbrüche, Basenmodifi-kationen, Nukleotid-Adukt-Bildungen und falsche Basenpaarbindungen mit sich brin-gen. In Kombination mit dem DNA-Reparatur-Netzwerk, das als entscheidendes Re-paratur-Element den BAS-Komplex (BRCA1-associated genome suveillance

super-complex) aufweist, stellen Chaperone in Eukaryonten eine schnelle Verteidigung

gegen stressinduzierte Beschädigung dar. Sie erkennen ungefaltete Proteine und verhelfen zur natürlichen Konfiguration [Kültz (2005)]. Chaperone können u. a. durch einen Hitzeschock induziert werden. Je größer der Schock, d. h. je höher die Tem-peraturdifferenz dabei ist, desto länger anhaltend ist der Stress [Gasch et al. (2000)]. Chaperone wie HSP60 und HSP70 wirken auch anti-apoptotisch. Apoptotische oder nekrotische Vorgänge leitet die Zelle selbst ein, wenn sie den Stress nicht bewälti-gen kann [Kültz (2005)]. Durch Stress beschädigte Proteine können nicht nur durch Chaperone oder Methioninsulfoxidreduktasen repariert werden, sondern können auch proteolytisch abgebaut werden.

Membranschäden, die z. B. durch physikalische Effekte verursacht werden, gehen mit veränderter Membranspannung oder -durchlässigkeit, Lipid- oder Proteinneuan-ordnung und Lipidperoxidation einher. Lipidperoxide bilden die Ausgangspunkte für radikalische Kettenreaktionen, deren Kettenprolongation zu erheblichen Störungen der Membranintegrität führt. Darüber hinaus aktivieren sie Antworten wie die MAP-

(mitogen-activated protein) Kinase-Kaskade [Toone and Jones (1998), Kültz (2005)]. Der MAPK- oder SAPK/JNK- (stress-activated protein kinases/Jun N-terminal

kina-ses) Weg bezeichnet eine Reihe mehrstufiger Signaltransduktionswege in

Eukaryon-ten, die u. a. an der Regulation der Zelldifferenzierung und des -wachstums sowie an der Apoptose beteiligt sind. Die MAP-Kinasen werden im Säuger in drei Gruppen aufgeteilt: extracellular signal-related kinases ERK-1 und ERK-2, p38-Proteinkinase und JNK. Der ERK-1/ERK-2-Signalweg ist bei 30 % aller Krebsarten hyperaktiviert und wird durch Mitogene aktiviert. Die Induktion der p38-Kaskade erfolgt über Stress, Tumornekrosefaktoren oder den Interleukin-1-Rezeptor Typ 1. Durch Stress, UV-Licht oder osmotischen Schock wird die Kaskade, in die JNK involviert ist, einge-leitet. [Seger & Krebs (1995), Pearson & Robinson (2001)].

Ein weiterer das eukaryontische Zellwachstum und Proliferation kontrollierender Sig-nalweg ist die TOR-(target of rapamycin) Kaskade. Dieser ist in die transkriptionelle Regulation von nährstoff-antwortenden Genen involviert. Seine Aktivität wird durch zellulären Stress (z. B. Hitzeschock, oxidativer oder osmotischer Stress) reduziert. Generell verursacht Rapamycin eine Herunterregulierung von anabolischen Prozes-sen, während katabolische und wachstumsinhibierende Prozesse hochreguliert wer-den [De Virgilio and Loewith (2006), Slattery and Heideman (2007)].

Viele durch diverse Stressarten induzierte Gene wie CTT1 (cytosolische Katalase codierend), SOD2 (Superoxiddismutase codierend), DDR2 (in DNA-Reparatur invol-viert) und HSP12 / HSP104 (Chaperone codierend) besitzen in Hefe das gleiche Promotorelement STRE (stress response element). Dieses wird in Antwort auf oxi-dativen und osmotischen Stress sowie auf Nährstoffmangel, Hitzeschock und einen niedrigen pH-Wert aktiviert. Das Promotorelement STRE wird von den Transkripti-onsfaktoren Msn2p und Msn4p erkannt. Die Wichtigkeit dieser Faktoren ist daran erkennbar, dass eine Doppelmutante msn2msn4 gegen eine Vielzahl von Stressar-ten sensitiv ist [Toone and Jones (1998), Slattery and Heideman (2007)].

Angriffe auf die DNA oder Proteine wird in vielen Fällen durch stress-induzierte Ra-dikalbildung und durch Veränderungen des Redox-Gleichgewichtes in der Zelle ver-mittelt. Dies konnte bei mechanischem, chemischem, thermischem, osmotischem, durch Schwermetalle induzierten oder direkt oxidativem Stress festgestellt werden [Kültz (2005)]. Osmotischer Schock induziert bspw. reversibel Gene, die in die oxida-tive Stressanwort (Oxidoreduktase und cytosolische Katalase), in

Entgiftungspro-zesse sowie in die Synthese und Regulation von kritischen Osmolyten (Trehalose, Glycerin) involviert sind [Piper et al. (1998), Gasch et al. (2000)].

Oxidative Stressantwort

Veränderungen des Redox-Gleichgewichtes sind als oxidativer Stress definiert. Oxi-dativer Stress ist im Unterschied zu anderen Stresstypen ein eher selten von außen herangetragener, sondern vielmehr ein intrazellulär erzeugter Stress [Savemini et al. (1999)]. In allen aeroben Organismen können reactive oxygen species (ROS) durch die Atmung selbst oder durch andere verschiedene physiologische Prozesse wie Haber-Weiss- und Fenton-Reaktionen entstehen [Wan et al. (2001), Koerkamp et al. (2002), Mascarnhas et al. (2008)]. Eine gewisse Konzentration an ROS in den Zellen kann als physiologisch angenommen werden, da die Bildung von ROS eine Beglei-terscheinung vom Zellmetabolismus ist. Daher werden antioxidative Proteine auch ohne äußere Stresseinwirkung präventiv exprimiert. Generell wirkt Cytoplasma re-duzierend: in Hefe ist das Verhältnis zwischen der reduzierten und der oxidierten Form von Glutathion 70:1 bis 190:1 [Rand u. Grant (2006)].

ROS besitzen eine wesentlich stärkere Reaktionsbereitschaft als der molekulare Sauerstoff und wirken daher cytotoxisch. Ist die ROS-Konzentration zu hoch oder das Redox-Gleichgewicht verändert, herrscht oxidativer Stress vor. Die dadurch her-vorgerufenen Schäden sind lebensbedrohlich und vielfältig: Strangbrüche und Punktmutationen der DNA, Aminosäurenmodifikationen, Proteinfragmentierungen und Lipidperoxidation. Die Antwort auf oxidativen Stress verlangt nach einer Neu-programmierung der Transkription und Translation [Mascarnhas et al. (2008)]. Für eine bestimmte Zeitperiode bleiben spezifische und zelltypabhängige Expressionen von bestimmten Proteinen besonders aktiv [Kültz (2005)]. Proteine aus dem Ener-giemetabolismus wie Glycerin-3-phosphatdehydrogenase, 6-Phosphogluconatde-hydrogenase, Enolase, Isocitratdehydrogenase und Citratsynthase werden unter oxidativem Stress besonders exprimiert. Wahrscheinlich spielt dabei die Generie-rung von NADH/NADPH, welche von der antioxidativen Stressantwort benötigt wer-den, eine wichtige Rolle [Savemini et al. (1999), Kültz (2005)].

Glutathion (GSH), welches durch die γ-Glutamylcystein-Synthetase Gsh1p und die Glutathion-Syntase Gsh2p in Hefe synthetisiert wird, stellt einen der beiden Haupt-abwehrmechanismen im Schutz gegen oxidativen Stress dar. Weiterhin besteht es im Cytosol in Koexistenz neben dem zweiten Verteidigungsmechanismus

Thioredo-xin (Trx). ThioredoThioredo-xine 1, 2 (im Cytosol lokalisiert) und 3 (in den Mitochondrien loka-lisiert) sind aktive Antioxidantien [Monje-Casas et al. (2004)], wobei Thioredoxin 2 in Antwort auf oxidativen Stress dominanter als die beiden anderen Thioredoxine exprimiert wird [Lucau-Danila (2005), Rand u. Grant (2006)].

Glutathion und Thioredoxin (wie auch Glutaredoxin) haben Thiole als aktive Grup-pen. Dadurch sind sie für die Reduktion von Peroxiden (ROOH), von Disulfidbindun-gen (Abb. 1 A) und damit auch für die Proteinfaltung sowie Reparatur von geschä-digten Proteinen verantwortlich [Trotter and Grant (2003)]. Bei der Reduktion von Peroxiden fungieren Thioredoxin und Glutathion als Elektronenspender für die Thio-redoxin- bzw. Glutathion-Peroxidase [Carmel-Harel u. Storz (2000)].

Abbildung 1: Wirkmechanismen sowie Regeneration von Glutathion und Thioredoxin.

Bei oxidativem Stress erhöhen sich die Syntheserate von reduziertem GSH, der Ex-port von oxidiertem Glutathion (GSSG) und die Expression der GSH-Oxidoreduktase Glr1p. Diese und die Thioredoxinreduktase Trr1p regenerieren in energieabhängigen Prozessen die oxidierten Formen von GSH und Thioredoxin zu den reduzierten (Abb. 1 B) [Trotter and Grant (2003)]. Eine Mutation im Gen GLR1 erhöht den ge-samten Glutathion-Gehalt, weil der oxidierte Glutathion-Anteil steigt [Carmel-Harel u. Storz (2000), Muller (1996)]. Der Thioredoxinanteil ist jedoch in der Zelle unverän-dert [Trotter and Grant (2003)].

Beide Systeme halten das Redox-Gleichgewicht aufrecht, wobei Glutathion als Indi-kator für oxidativen Stress fungiert. Ihre Verbindung wird in der Literatur gegensätz-lich bewertet: einerseits soll bei einem Defekt im Thioredoxin-System der

Glutathion-2 GSH

GSSG

ROOH

ROH

Peroxidase

A. Reduktion von Disulfidbindungen und Peroxiden (ROOH) mittels Thio-redoxin und Glutathion. Darstellung nach Carmel-Harel u. Storz (2000)

B. Regenerieung von oxidiertem Thioredoxin und Glutathion (GSSG) mittels den entspre-chenden Reduktasen Trr1p und Glr1p. Dar-stellung nach Trotter and Grant (2003):

reduziert oxidiert

Gehalt in der Zelle steigen [Trotter and Grant (2003)], anderseits soll er unter diesen Umständen unberührt bleiben [Muller (1996)]. Glutaredoxine sind Alternativen zu Thioredoxinen, jedoch generell ineffizenter als Thioredoxine [Carmel-Harel u. Storz (2000)]. Die Bedeutung von Thioredoxin ist auch daran zu erkennen, dass die Stabi-lität des Transkriptes vom TRX2-Gen dreifach höher ist als die vom Anti-stressgen

TOR1, welches wiederum stabiler als das von GLR1 ist [Monje-Casas et al. (2004)].

Die Expression der essentiellen Gene der oxidativen Stressantwort wie GSH1,

GSH2, GLR1, TRX2, TRR1 und GPX2 werden durch den Transkriptionsfaktor

ap1p aktiviert [Carmel-Harel u. Storz (2000), Toone et al. (2001)]. Dabei spielt ap1p keine Rolle in der Abwehr von Superoxid-Anionen [Stephen et al. (1995)]. Y-ap1p befindet sich unter stressfreien Bedingungen im Cytosol, sofern das Thioredo-xin-System, einschließlich der Reduktase, aktiv ist. Ist dies nicht der Fall, akkumu-liert der Transkriptionsfaktor wie unter oxidativem Stress im Kern, dem Ort der Transkription. Ein Defekt im Glutathion-System hat dies nicht zur Folge. Nach der Initiierung der Target-Gene wird Yap1p (wahrscheinlich durch Trx2p) reduziert und wieder zurück ins Cytosol entsendet [Carmel-Harel u. Storz (2000), Carmen-Harel et al. (2001), Toone et al. (2001)].

Dabei nehmen noch andere Transkriptionsfaktoren wie Skn7p in der Antwort auf o-xidativem Stress und auf Hitzeschock eine wichtige Funktion ein. Auch durch Skn7p wird die Expression der Gene TRX2 und TRR1 initiiert [Carmel-Harel u. Storz (2000), Toone and Jones (1998)]. Sind zwei Transkriptionsfaktoren wie Skn7p und Yap1p oder Yap1p und Yap2p nicht funktional, ist die Zelle gegen oxidativen Stress wie H2O2 hypersensitiv; Stämme mit Einzelmutationen dagegen sind nur sensitv [Vi-do et al. (2001)]. Auch die Stärke des Stresses spezifiziert die Verwendung der je-weiligen Transkriptionsfaktoren. Bei starkem oxidativen Stress wird Yap1p aktiviert, während es bei schwächerem die Transkriptionsfaktoren Msn2p und Msn4p sind [Toone et al. (2001)]. Diese nehmen auch eine Funktion in der hitzeschock-aktivierten Expression von Trx2p ein, die nicht über Yap1p erfolgt [Gasch et al. (2000), Monje-Casas et al. (2004)]. Auch der Transkriptionsfaktor GCN4, der die Biosynthese von Aminosäuren induziert, spielt eine Rolle in der oxidativen und der osmotischen Stressantwort. Er ist jedoch nicht an der Abwehr von Diamid beteiligt [Toone et al. (2001), Mascarnhas et al. (2008)].

ROS wie Superoxide, Wasserstoffperoxid (H2O2) und andere Peroxide stehen am Anfang einer Kettenreaktion von Peroxidationsprozessen. Um dies zu vermeiden,

müssen diese entgiftet werden [Mascarnhas et al. (2008)]. Dies erfolgt über die In-duktion von verschiedenen Genen der Verteidigung gegen oxdidativen Stress: TRX2 (Thioredoxin codierend), GSH1 (nötig für GSH-Synthese), GLR1 (die Glutathionre-duktase codierend), SOD2+SOD1 (Superoxiddismutasen codierend), GPX2 (Gluta-peroxidase codierend), CTT1 (cytosolische Katalase codierend), GPD1, HOR2,

CAP1 und GCY1 (auch involviert in osmotischer Stressantwort) und HSP30 und SSE2 (involviert in Hitzeschockantwort) [Gasch et al. (2000), Sugiyama et al. (2000),

Monje-Casas et al. (2004), Mascarnhas et al. (2008)].

ROS und das Oxidationsmittel Diamid verursachen Verknüpfungen zwischen Prote-inkomponenten auf lysosomalen Membranen. Diese Schädigung erhöht die Memb-ranpermeabilität und den pH-Wert des Kompartiments [Wan et al. (2001), Kaushik and Cuervo (2006)]. Membranen sind für Diamid und H2O2 permeabel [Koerkamp et al. (2002)]. Dabei weisen H2O2 und Diamid unterschiedliche Oxidationsmechanis-men auf. Während H2O2 generell oxidierend wirkt, ist Diamid ein thiolspezifisches Oxidationsmittel. Dadurch verändert Diamid die natürliche Faltung und somit wo-möglich die Aktivität des Proteins. Diamid löst durch die Interaktion mit GSH auch oxidativen Stress aus, da dadurch die antioxidative Verteidigung geschwächt wird [Mascarnhas et al. (2008), Muller (1996)]. Auf Diamid folgt die Induktion von der oxi-dativen Stressantwort (vor allem die Hochregulierung der Expression von Trx2p [nicht Trx1p oder Trx3p]), der Zellwandbiosynthese, der Atmung und der Proteinfal-tung [Gasch et al. (2000)]. Auch Defekte im Sekretionprozess wurden festgestellt [Toone et al. (2001), Mascarnhas et al. (2008)].

Mittels Dithiotreitol (DTT) kann reduktiver Stress ausgelöst werden. DTT kann passiv in die Zelle eindringen und beugt der Bildung von Disulfidbindungen vor. Dadurch kann ebenso wie bei Diamid die Inaktivierung von Proteinen folgen. In der reduktiven Stressantwort spielen die antioxidativen Thio- Trx2p und Peroxiredoxin Tsa1p, wel-ches auch durch Hitzeschock aktiviert wird, sowie Proteine des vesikulären Trans-portweges wie Arf1p oder Proteine der ESCRT II- + III-Komplexe eine wichtige Rolle [Lucau-Danila (2005), Perrone et al. (2005), Rand u. Grant (2006)].

Die Oxidation von Metall gebundenen Proteinen, und die damit verknüpfte Freilas-sung des Metallions, resultiert nicht nur in einer Inaktivierung des Proteins, sondern möglicherweise auch in Haber-Weiss- und Fenton-Reaktionen [Mascarnhas et al. (2008)]. Redox-aktive Metallionen werden nicht nur durch Oxidation von Metall-bindenden Proteinen freigesetzt, sondern dies können ebenfalls Zink und Cadmium

bewirken, indem sie gebundene Eisen- oder Kupferionen ersetzen. Diese können dann in freiem Zustand die Generierung von ROS über die Fenton-Reaktion einlei-ten [Decottignies et al. (1998), Vido et al. (2001), Mascarnhas et al. (2008)]. Generell aktivieren Eisen, Kupfer, Cadmium und Zink die oxidative Stressantwort, indem u. a. die Expression von Glutathion, Thioredoxin, Superoxiddismutase, von Hitzeschock induzierten Proteinen, Peroxiredoxinen und Glutathionperoxidasen durch ihre Ge-genwart hochreguliert wird. Zink und Cadmium fördern zwar die Bildung von ROS, sind aber selbst nicht redox-aktiv [Decottignies et al. (1998), Yang and Pon (2003), Baird et al. (2006)]. Die toxische Wirkung der Schwermetalle beruht hauptsächlich auf der Interaktion mit zweiwertigen Kationen, mit Thiol-, Sulfhydryl-, Carboxyl-, Imi-dazol- und mit anderen funktionellen Gruppen von Proteinen oder auf dem Verdrän-gen von Cofaktoren essentieller Proteine. Zusätzlich kann dies auch zum Funktions-verlust von Proteinen führen.

Generell hemmen hohe Metallionen-Konzentrationen das Zellwachstum [Yang and Pon (2003)]. Für Pro- und Eukaryoten sind unterschiedliche Mechanismen bekannt, um sich vor den schädlichen Metallkonzentrationen zu schützen. Während Prokaryo-ten hauptsächlich Efflux-Systeme besitzen, um das toxische Metall aus dem Cytosol in das umgebende Medium zu transportieren [Nies (1999)], werden in Eukaryoten die überschüssigen Metalle vorwiegend (mit GSH) komplexiert und in die Vakuole abgesondert [MacDiarmid et al. (2000), Vido et al. (2001)]. Bereits 1995 beschrieben Nies und Silver die CDF-Proteinfamilie (Cation Diffusion Facilitator), deren Mitglieder als membrangebundene Proteine in den Transport von Zink, Cadmium und Cobalt involviert sind. In Hefe vermitteln die Proteine Zrc1p (im Säuger: Znt-2, an spätem Endosom lokalisiert) [MacDiarmid et al. (2002)] und Cot1p Zink-, Cadmium- bzw. Cobaltresistenz.

Zu den Schutzmechanismen vor intrazellulären Metallionen in S. cerevisiae zählen der Ionen-Importstop, Thiolverbindungen wie Glutathion und die Induktion von antio-xidativem Metallothionein [Decottignies et al. (1998)]. Die Expression des Metallothi-oneins wird durch cytotoxische Substanzen wie Zink und Kupfer sowie durch oxida-tiven Stress induziert. Doch die antioxidative Wirkung verhindert weder Lipidperoxi-dation noch DNA-Schäden durch Peroxide [Kiningham and Kasaskis (1998), Baird et al. (2006)]. Metallothioneine sind kleine cysteinreiche Proteine, die Metallionen zu binden vermögen und somit zu deren Entgiftung beitragen [Kiningham and Kasaskis (1998)].

Transporter vermittelte cytosolische Stressantwort

ABC- (ATP-binding cassette) und MFS- (major facilitator superfamily) Transporter-proteine beschützen die Zelle, indem sie den Transport von Endo- und Xenobiotika durch die Membranen ermöglichen. Ihre Hauptfunktion besteht in der Detoxifikation der Zelle. Sie sind in zellulären Membranen wie z. B. Plasma- oder Vakuolen-membran lokalisiert [Jungwirth and Kuchler (2006)], was die Vakuole als einen Ort der Entgiftung definieren lässt. Fast jeder Organismus, vom Bakterium bis zum Säu-getier oder zur Pflanze, weist die Familie der ABC- und die der MFS-Transporter auf [Pao et al. (1998)]. Sie fungieren nicht nur als Membrantransporter, sondern sind in dieser Funktion auch gleichzeitig für die essentielle Stressantwort, für die zelltyp-spezifische Lipidanordnung in Membranen, für die Biogenese von Peroxisomen und für die Funktionalität von Mitochondrien notwendig [Jungwirth and Kuchler (2006)]. Der Unterschied zwischen den Transporterarten liegt in der Größe der Substrate. Diese sind für MFS- und ABC-Transporter u.a. Zucker, (Anti-Krebs-) Medikamente, Vitamine, Metabolite, Aminosäuren, organische und anorganische Anionen sowie Kationen. Qdr1p, Qdr2p und Qdr3p sind beispielhaft Vertreter der MFS-Familie [Nu-nes et al. (2001)]. Zusätzlich können ABC-Transporter noch Makromoleküle wie Pro-teine, Phospholipide und komplexe Zucker transportieren [Pao et al. (1998)]. Ein ty-pisches ABC-Protein besteht aus zwei homologen Hälften. Jede dieser Hälften be-sitzt eine hydrophile, cytoplasmatische und Nukleotid bindende sowie eine hydro-phobe Domäne [Prasad and Panwar (2004)].

Abbildung 2: Topologie und Domänenanordnung der ABC-Transporter Subfamilien. NBD: nucleotid binding domain. Darstellung von Jungwirth and Kuchler (2006)

Aufgrund der unterschiedlichen Topologie ihrer Domänen werden ABC-Transporter in PDR-(Pleiotropic drug resistance), MDR- (Multidrug resistance), MRP- (Multidrug

reistance-related protein) und ALDp- (Adrenoleukodystrophie-Protein) Klassen

un-terteilt (s. Abb. 2). ALDp-Proteine sind an den Peroxisomen zu finden. Die Hefepro-teine Pdr5p, Snq2p, Pdr10p und Pdr12p sind Mitglieder der PDR-Subfamilie, wäh-rend Yor1p, Ycf1p und Bpt1p der MRP-Subfamilie angehören [Prasad and Panwar (2004)].

Die ABC-Transporter rückten in den letzten Jahren in das Licht des Interesses, als erkannt wurde, dass sie eine beträchtliche medizinische, industrielle und ökonomi-sche Bedeutung haben. So spielen sie eine große Rolle bei Resistenzen von poten-tiell pathogenen Bakterien gegen Antibiotika und Antimykotika sowie bei Pflanzen die Resistenz gegen Herbizide [Akache and Turcotte (2002)]. Jährlich sterben zehn-tausende Menschen an Krebs, weil die Chemotherapie aufgrund der starken Ex-pression von ABC-Transportern im Tumorgewebe fehlgeschlagen ist. Vertreter der ABC- und der MFS-Familie verhelfen der Zelle durch ihre entgiftende Transportfunk-tion zu verschiedenen Resistenzen (multidrug resistance). Hinter dem Begriff

mul-tidrug resistance steht ein Phänomen, bei dem Tumorzellen gegen struktur- und

funktionsverschiedene chemotherapeutische Medikamente resistent sind. Einige Transporter sind sehr substratspezifisch, andere multispezifisch mit überlappender Substratspezifität. Die Suche nach Inhibitoren gegen die Transporter wird verstärkt betrieben, um Resistenzen in der Anti-Krebs-Behandlung zu vermeiden [Szakács et al. (2006)].

Tabelle 1-1: multidrug resitance vermittelnde Proteine in Hefe / Proteinfamilie im Säuger und Inhibitoren der Säugerproteine

Homologes multidrug resistance vermittelndes Protein in Hefe multidrug resistance vermittelnde Familie im Säuger Inhibitoren Literatur MDR / ABCB Digoxin, Paclitaxel Cyclosporin A Verapamil Tamoxifen, Vinblastin Lockhart et al. (2003) Henrich (2006), Wang et al. (2001) Wang et al. (2001) Yor1p*, Ycf1p, Bpt1p

[Prasad and Panwar (2004), Sharma et al. (2002)] MRP / ABCC Lithocholsäure Cyclosporin A, Vera-pamil, Quinidin, Quinin GG918 Mefloquin Mrowczynska et al. (2005), Szakács et al. (2006) Mahé et al. (1996) Wu et al. (2005) Snq2p*, Pdr5p*, Pdr10p*, Pdr12p * PDR / ABCG Cucumin Novobiozin, Fumi-tremorgin C Cyclosporin A Shukla et al. (2008), Allen et al. (2002), Hen-rich (2006)

Szakács et al. (2006)

Die Hemmstoffe wurden demnach in Säugerzellen getestet (s. Tabelle 1-1). Auch in Hefe wurden Enniatin und Isonitril als Inhibitoren von Pdr5p identifiziert [Hiraga et al. (2005), Yamamoto et al. (2005)].

Die Bezeichnungen der ABC-Familien als multidrug resistance-Transporter sind un-glücklich, da deren natürliche Funktion nicht der Export von Zytostatika ist. Erst all-mählich lernt man die physiologische Funktion einzelner Transporter kennen. Die Notwendigkeit dieser Proteine lässt sich daran erkennen, dass Mutationen in einem ABC-Transporter kodierenden Gen beim Menschen zu Stoffwechselkrankheiten füh-ren können. Ihre essentielle physiologische Funktion ist auch generell an der beson-ders starken Expression während der logarithmischen Wachstumsphase (und in Stammzellen [Szakács et al. (2006)]) erfassbar [Jungwirth and Kuchler (2006)]. Von Mitgliedern der ABCA-, ABCG- und MDR- (ABCB) Subfamilie ist eine physiolo-gische Funktion als Lipid-Translokator bekannt [Lockhart et al. (2003), Kennedy et al. (2001), Prasad and Panwar (2004)]. Sie sind notwendig für den Erhalt der asym-metrischen Lipidbilayer. Die Hauptbestandteile der inneren Lipidschicht der Plas-mamembran sind Phosphatidylethanolamin und –serin, während in der äußeren vor allem Phosphatidylcholin, Sphingomyelin und Glykolipide lokalisiert sind [Prasad and Panwar (2004)]. MDR1 vermittelt bspw. die Lipid-Translokation von Phospholipiden und Sphingomyelin im Säuger, während MDR2 hingegen speziell für die von Phosphatidylcholin verantwortlich ist [Prasad and Panwar (2004)]. Daran lässt sich bereits eine hohe Substratspezifität erkennen. Auch in Hefe nehmen Yor1p und Pdr5p eine Funktion als Lipid-Flippase ein [Decottignies et al. (1998)], während es bei Snq2p und Pdr12p nur vermutet wird [Holyoak et al. (1999)]. Dagegen spielen Pdr10p, Ycf1p, Pdr11p und Pdr15p keine membranregulierende Rolle [Prasad and Panwar (2004)]. Weiterhin ist von dem an der Plasmamembran lokalisierten Protein Pdr12p die physiologische Funktion bekannt, die Zelle vor schwachen Säuren zu schützen. Es exportiert einkettige organische Säuren der Kettenlänge C1-C7 aus der Zelle [Holyoak et al. (1999), Prasad and Panwar (2004)].

In Säugerzellen konnte eine Verbindung zwischen der Glutathion-Regeneration und der MRP1-Aktivität festgestellt werden: bei einer MRP1-Inhibierung steigt die GSH-Reduktase-Aktivität [Mueller et al. (2005)]. Im Allgmeinen ist über die physiologi-schen Funktionen der resistenzvermittelnden Transporter, die eine essentielle Rolle in der cytosolischen Stressantwort spielen, bislang in Hefe nicht viel bekannt.

Die verschiedenen Proteine innerhalb einer Subfamilie sind zwar untereinander sehr ähnlich und besitzen teilweise identische, aber auch spezifische Substrate. Haupt-sächlich unterscheiden sie sich in ihrer Lokalisation im Gewebe und ihrer Transport-kinetik. MDR-Proteine transportieren Daunorubicin oder Colchicin und MRPs negativ geladene oder neutrale Komponenten, die häufig an Glutathion konjugiert sind. Be-züglich ihrer drug-resistance verleihenden Eigenschaft wurde jedoch keine Notwen-digkeit für eine Konjugation, sondern ein Kotransport von Komponente und Glutathi-on festgestellt [Mahé et al. (1996), Lockhart et al. (2003)]. Als Exportprodukte vGlutathi-on verschiedenen MRPs werden hier Daunorobicin, Methotrexat, Vincristin, Cisplatin, Doxorubicin und Etoposid genannt [Borst et al. (2000)]. Die ABC-Transporter werden im Menschen in den meisten sezernierenden Epithelien, einschließlich Leber, Darm, Niere und Lunge, exprimiert [Kennedy et al. (2001), Lockhart et al. (2003)].

Auch in Hefe weisen die ABC-Transporter überlappende und spezifische Substrate auf. So ist Cycloheximid ein spezifisches Substrat für Pdr5p, für ein weiteres Protein der gleichen PDR-Familie Pdr12p jedoch nicht. Weder Pdr5p noch Pdr12p verleihen der Zelle eine Resistenz gegen 4-Nitro-Quinolin-N-Oxid (4NQO), welches von Snq2p und in untergeordneter Rolle von Atr1p transportiert wird [Holyoak et al. (1999), Pra-sad and Panwar (2004)]. Dabei sind Pdr12p, Pdr5p und Snq2p homolog zueinander [Piper et al. (1998)] und besitzen auch identische Substrate wie Staurosporin oder Fluphenazin [Hirata et al. (1994), Le Crom et al. (2002)]. In Reaktion auf Sorbat wer-den Snq2p und Pdr12p überexprimiert, während Pdr5p sogar herunterreguliert wird [Piper et al. (1998)]. Wiederum teilen sich Pdr5p und Yor1p das Substrat Oligomycin [Decottignies et al. (1995), Cui et al. (1998)], obwohl sie unterschiedlichen Subfam-lien aus dem Säugersystem zuzuordnen sind. Daran lässt sich erkennen, dass Re-geln bezüglich der Protein-Funktion in Hefe nicht einfach aufzustellen sind.

ABC-Proteine sind wegen zur Verfügung stehenden Deletionsbanken in Hefe hin-sichtlich ihrer Regulatoren besser als im Säuger erforscht. So ist bekannt, dass die Transkription deren Gene spezifisch von verschiedenen Transkriptionsfaktoren regu-liert werden kann. Beim Hitzeschock werden zum Beispiel vor allem die Gene PDR5 und SNQ2 induziert [Jungwirth and Kuchler (2006), Miyahara er al. (1996)]. Die meisten Gene wie SNQ2, YOR1, PDR5, PDR10, PDR12 und YCF1 werden durch mehrere Transkriptionsfaktoren reguliert (Tabelle 1-2).

Tabelle 1-2: Übersicht von Transkriptionsfaktoren und ihre für die Arbeit relevanten Target-Gene in der Hefe Saccharomyces cerevsiae

Transkriptions-

faktor ABC-Targetgen Literatur

Pdr1p SNQ2, YOR1, PDR5, PDR10 Decottignies et al. (1998) Pdr3p SNQ2, YOR1, PDR5, PDR10 Decottignies et al. (1998)

Yrr1p SNQ2, YOR1 Akache and Turcotte (2002)

Le Crom et al. (2002)

Stb5p SNQ2, PDR5 Jungwirth and Kuchler (2006)

Pdr8p YOR1 Jungwirth and Kuchler (2006)

War1p PDR12 Jungwirth and Kuchler (2006)

Yap1p SNQ2, PDR5, YCF1, ATR1 Coleman et al. (1997),

Sugiyama et al. (2000)

Yap8p YCF1 Jungwirth and Kuchler (2006)

Die Transkriptionsfaktoren Pdr1p und Pdr3p sind die Hauptregulatoren vom PDR-Netzwerk. Dabei fungieren sie nicht immer zusammen, sondern nehmen auch indi-viduelle Funktionen ein: bereits duch eine Mutation im Gen PDR1 wird die Transkrip-tionen von den Genen PDR10 und PDR15 hochreguliert [Decottignies et al. (1998), Mahé et al. (1996)]. Die Transkriptionsfaktoren werden spezifisch in unterschiedli-chen Stresssituationen aktiviert; beispielsweise ist der Induktor für Pdr1p und Pdr3p Diazoborin [Wehrschütz-Sigl et al. (2004)]. Obwohl der Transkriptionsfaktor Yap1p vor allem für die Initiierung der oxidativen Stressantwort bekannt ist [Vido et al. (2001)], kann diese mit Induktionen von Entgiftungsprozessen verbunden sein. Dies kann indirekt und in Abhängigkeit von PDR1 und PDR3 geschehen [Wendler et al. (1997), Carmel-Harel and Storz (2000)].

2 Problemstellung

Es gibt Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Krankheiten oder Infektionen, die auf einem Gendefekt beruhen. Die einfachste Methode zur Heilung eines defekten Genes könnte ein Ersatz des Genes selbst durch ein gesundes sein. Dies könnte durch das Einschleusen eines funktionellen Gens in Form eines viralen oder nicht-viralen DNA-Vektors erfolgen. Hauptsächlich werden in der Gentherapie virale Vek-toren eingesetzt [www.wiley.co.uk/genmed/clinical]. Die Verwendung von viralen Vektoren bringt Nachteile wie die zeit- und kostenintensive Präparation des Vektors, das potentielle Wiederanlagern der Pathogenität und eine Immunantwort des Emp-fängers auf die viralen Bestandteile mit sich [Wiethoff et al. (2002), Schakowski et al. (2004)]. Nicht-virale Vektoren bieten gegenüber den viralen Vektoren im Transfekti-onsprozess den Vorteil, dass sie eine Kosten sparende Produktion bieten, unabhän-gig vom Teilungsverhalten der Zelle sind, ein geringeres Risiko einer Immunantwort aufweisen und dass sie das Einschleusen von größeren DNA-Inserts ermöglichen [Horobin and Weissig (2005)]. Jedoch ist die Transfektionseffizienz bei Verwendung eines viralen Vektors höher als eines nicht viralen [Wiethoff et al. (2002)]. Daher soll-te deren Transfektionseffizienz für eine effiziensoll-te Anwendung verbessert werden. Die nicht-virale Transfektionsmethode nutzt den natürlichen Mechanismus der En-dozytose (Abb. 3).

Abbildung 3: Endozytotischer Transport. Frühes Endosom nimmt Material (in clathrin-coated vesicles, CCVs) auf und transportiert dieses über das späte Endosom zum Ly-sosom. Darstellung nach Seto et al. (2002)

Die Endozytose umfasst die Aufnahme von Teilen des die Zelle umgebenden Medi-ums und den Transport der Substanzen mittels Vesikeln zum Lysosom (Säugerzelle) / zur Vakuole (Hefezelle), den abbauenden Kompartiment der Zelle. Der erste Schritt

Cytosol

ist die Anlagerung eines DNA-Vektors an die Plasmamembran, gefolgt von dessen Aufnahme in die Zelle per Membraneinstülpung. Das endozytierte Material wird über das frühe Endosom zum späten transportiert, welches das Hauptsortierungskompar-timent zwischen spätem Golgi, dem Lysosom / der Vakuole und dem frühen Endo-som ist. Zum Teil wird das späte EndoEndo-som als Multivesicular Body (MVB) bezeichnet oder als Vorstufe zum späten Endosom angesehen [Seto et al. (2002)]. Im Lysosom / in der Vakuole wird das endozytierte Material (DNA) abgebaut. Entlang des Endo-zytoseweges erfolgt eine Ansäuerung der Vesikel. Der niedrige pH-Wert ist notwen-dig für den Abbau von endozytiertem Material [Bache et al. (2002)]. Recyclingpro-zesse regulieren den Transportweg zurück zur Plasmamembran oder zum späten Golgi [Seto et al. (2002)]. Damit eine Transfektion erfolgt, muss DNA aus dem endo-zytotischen Transport und den Recyclingprozessen entkommen.

Kritische Parameter dieser Transfektionsmethode sind die physikalische und chemi-sche Stabilität der DNA in der extrazellulären Umgebung, die DNA-Aufnahme, das Entkommen der DNA aus den endosomalen Kompartimenten, der Transport im Cy-tosol und die Lokalisation im Kern für die DNA-Transkription [Wiethoff et al. (2002)]. Die Stabilität der extrazellulären DNA sowie die Internalisierung können durch Kom-plexierung von DNA mit kationischen Polymeren, Polypeptiden [Akinc et al. (2005), Utku et al. (2006)] und Lipiden gefördert werden [Wiethoff et al. (2002)]. Beide Kom-plexarten lassen unspezifisch die unmittelbare Nähe zur Plasmamembran der Zelle zu und ermöglichen die Freilassung aus intrazellulären Kompartimenten. Dies erhöht die Transfektionseffizienz. Doch die Kapazität der DNA-Komplexierung ist bei Po-lyplexen auf einen Durchmesser von bis zu 40 nm und bei Lipoplexen auf bis zu 2 µm beschränkt [Khalil et al. (2006)]. Deren Verwendung wird häufig wegen uner-wünschter Nebenwirkungen [Park et al. (2005), Prechtel et al. (2006)] durch Elektro-poration vermieden. Ein weiteres nicht-virales Transfektionsverfahren ist die Ver-wendung von Liposomen [Chen et al. (1999)]. Methoden, die die DNA-Aufnahme durch die Zelle umgehen, sind vor allem Elektroporation [Prechtel et al. (2006)], Nuc-leofection, Gene Gun und Mikroinjektion [Schakowski et al. (2004)]. Eine verbesser-te und stabile Transkription kann selbst in sich schnell verbesser-teilenden Zellen durch nicht-virale „Minicircles“ erreicht werden [Nehlsen et al. (2006), http://www.bionity.com/news/d/58314]. Die Freilassung der DNA ins Cytosol kann durch Platzen der Endosomen, was u. a. durch fusiogene Proteine erreicht werden kann [Okada et al. (1982)], erfolgen [Wiley et al. (1987), Hughes et al. (1996)]. Der Fokus dieser Arbeit zur Verbesserung der Transfektionseffizienz liegt auf dem

vor-zeitigen Entlassen der DNA aus dem endozytotischen Transportweg, noch bevor das Lysosoms / die Vakuole erreicht wird.

Als effiziente, transfektionssteigernde Substanz, einen sog. Transfektionsenhancer, gilt bereits Chloroquin, welches die Zelle penetriert [Erbacher et al. (1996)] und An-säuerungsprozesse intrazellulärer Kompartimente neutralisiert [Khalil et al. (2006)]. Diese Eigenschaft besitzen auch andere Substanzen wie Monensin oder Ammoni-umchlorid, welche jedoch keinen Einfluss auf den Transfektionsprozess ausüben. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Chloroquin zusätzlich in DNA interkalieren und somit vor dem Abbau durch Nukleasen schützen soll. Chloroquin verbessert auch die Transfektion mittes DEAE/Dextran-Komplexes [Erbacher et al. (1996)].

Allgemein nutzt der endozytotische Transportweg Fusionsprozesse, um Transport-Vesikel abzubinden und diese Transport-Vesikel wieder mit dem Zielorganell fusionieren zu lassen. Die Fusion intrazellulärer Kompartimente wird u.a. durch Rab-Proteine und die Ausbildung eines trans-SNARE-Komplexes (soluble N-Ethylmaleimide sensitive

factor attachment protein receptor-Komplex) initiiert. SNARE´s sind

Rezeptorprotei-ne der MembraRezeptorprotei-nen, die Hilfe von eRezeptorprotei-nergieliefernden Rab-GTPasen benötigen. Der Fortgang der Fusion selbst wird durch eine Verschmelzung von den Membranbilay-ern der Kompartimente erreicht [Bonifacio et al. (2004)]. Daher sind viele Transport-proteine zugleich in Fusionsprozesse involviert [Price et al. (2000), Richardson et al. (2004)]. Rab7 (Säugerprotein) / Ypt7p (Hefeprotein) ist für den Transport vom spä-ten Endosom zum Lysosom / zur Vakuole sowie für den Transport von spätem zum frühen Endosom notwendig [Schimmöller and Riezman (1993), Wickner W. (2002), Richardson et al. (2004)]. Auch Rab5 (Säugerprotein) / Vps21p (Hefeprotein) spielt eine Rolle für frühe Transport- und Fusionsschritte von der Plasmamembran zum frühen Endosom, vom Golgi zum Endosom und für die homotypische Fusion von frühen Endosomen [Peterson et al. (1999), Neukamm et al. (2002)].

In enger Anpassung an das Säuger-System wurde ein Transfektions-Assay in Hefe entwickelt [Neukamm et al. (2002)]. Der Assay basiert auf nicht rezeptorvermittelter

fluid-phase-Endozytose. Damit aufgenommene Gene aktiv exprimiert werden, ist ein

Transfer der DNA aus den endozytotischen Kompartimenten ins Cytosol (und nach-folgend in den Kern) nötig. Mittels Hefemodell zeigte sich, dass die Transfektionsef-fizienz steigt, wenn der Transport zur Vakuole wie in den Deletionsstämmen vps21

und ypt7 unterbrochen ist und somit die endozytierte DNA nicht im gleichen Maße mit abbauenden Enzymen aus dem späten Endosom und der Vakuole in Kontakt kommt [Neukamm et al. (2002)]. Die Transfektionseffizienz steigt auch mit einer Un-terbrechung der Vakuolenansäuerung, was mit einer verminderten hydrolytischen Aktivität korreliert [Khalil et al. (2006), Riechers (2007)]. An den Untersuchungen des Einflusses verschiedener Transportproteine auf die Transfektionseffizienz stellte sich heraus, dass es nicht beliebig ist, welches Protein innerhalb eines Prozessschrittes ausgeschaltet ist [Riechers (2007)]. In systematischen Versuchen, die auf Untersu-chungen von verschiedenen Stoffklassen beruhen, konnten Wirkstoffe identifiziert werden, die die Rate der Säuger- und Hefetransfektion steigern [Neukamm et al. (2006)].

Da zu den an der Endozytose beteiligten Proteinen in Hefe Proteine mit homologen Funktionsmechanismen im Säuger identifiziert wurden [Feng et al. (1995), Mullock et al. (2000), Seto et al. (2002), Richardson et al. (2004), Bache et al. (2006)] und der Transportweg über die gleichen Organellen verläuft, kann ein vergleichbares Verhal-ten der Proteine in Hefe mit denen in Säugerzellen erwartet werden.

Darauf aufbauend ist das Ziel dieser Arbeit, für eine effiziente Alternative zur viralen Transfektion, neue oder bereits gefundene Schlüsselreaktionen durch Supplemente zu induzieren. Dabei ist zu beachten, dass die Induktion dieser Reaktionen in der Anwendung nicht durch genetische Manipulation, sondern durch Supplemente (wie Substanzen oder siRNA) ermöglicht werden muss. Um nicht von Supplementen mit ggf. ubiquitärer Wirkungsweise abhängig zu sein, sollen auch neue und spezifische, den lysosomalen DNA-Abbau verzögernde Schlüsselreaktionen im nicht-viralen Transfektionsprozess identifiziert werden.

Dazu sollen folgende Strategien in dieser Arbeit verfolgt werden:

• Identifikation von Transfektionsenhancern. Dabei gilt es, Substanzen zu fin-den,

o die Ansäuerungsprozesse intrazellulärer Kompartimente stören oder

o unspezifisch cytosolischen Stress auslösen.

Diese Zielsetzung basiert auf einer Induktion der Unterbrechung der Vakuole-nansäuerung, die eine transfektionssteigernde Wirkung aufweist, und auf ei-ner Induktion eiei-ner essentiellen Stressantwort, die in verschiedenen Zelltypen vergleichbar ist. Zunächst soll dazu in dieser Arbeit die Hefe als Modellsystem

verwendet werden. Anschließend soll die Wirksamkeit der Transfektions-Enhancer in den Säugerzelllinien HepG2 und A549 überprüft werden. Zusätz-lich wird Kombinationen von neuen Transfektions-Enhancern mit Chloroquin auf eine weitere Transfektionssteigerung untersucht.

• knock down von im Hefemodell identifiziertem Targetprotein in zwei Säuger-zelllinien. Dieser wird duch siRNA (small interfering ribonucleic acid) vermit-telt. Um den Einfluss vom Hefeprotein Vps21p auf die Transfektionseffizienz in Säugerzellen zu bestätigen, soll die Expression des homologen Säugerpro-teins Rab5a mittels siRNA inhibiert und anschließend mit nicht-viraler Vektor-DNA transfiziert werden. Somit soll die Wirkung von dem an der Fusion intra-zellulärer Kompartimente beteiligten Protein Rab5a auf die Transfektionseffi-zienz von Säugerzellen verifiziert werden.

• Identifikation von neuenTargetproteinen bzw. neuen Schlüsselreaktionen, die den Transfektionsprozess beeinflussen. Dazu soll der Einfluss von Deletionen verschiedener, in cytosolischen Stressantworten involvierter Gene auf den Transport endocytierter DNA und auf die Transfektionseffizienz getestet wer-den. Da für die Verwendung von Zusätzen die Erreichbarkeit der Wirkorte gewährleistet sein muss, werden dementsprechend Angriffspunkte ausge-wählt.

Daher sind die Proteine gut geeignet,

o die durch Substanzen im Cytosol einfach angegriffen werden können,

o die auf der Außenmembran der Zelle lokalisiert sind oder

o für die Inhibitoren bereits bekannt sind.

Zusätzlich soll untersucht werden, ob die neuen Transfektions-Enhancer in Stämmen mit einer defekten Stessantwort einen additiven Effekt auf den Transfektionsprozess ausüben.

Diese Arbeit liefert als außerwissenschaftlichen Aspekt Erkenntnisse, die von hoher medizinischer Bedeutung sind. Es wird eine effiziente, sichere und einfach anwend-bare Alternative zur Transfektion mittels viralen Vektors eröffnet. Diese Arbeit dient auch der Targetvalidierung in der Pharmaforschung. Wenn neue Ansatzpunkte für Inhibitoren gefunden werden, die eine starke Steigerung der Transfektionseffizienz versprechen, kann die Sicherheit in der Gentherapie erhöht werden.

3 Material und Methoden

3.1 Material

Tabelle 3-1: Verwendete Substanzen und ihre Hersteller

Substanz Hersteller Substanz Hersteller

Agar Agar Serva, Heidelberg, D KH2PO4 Merck, Darmstadt, D Agarose LE Biozym, Oldenburg, D L-Leucin Carl Roth, Karlsruhe, D Ammoniumacetat neolab, Heidelberg, D Lucifer Yellow-CH Sigma, Steinheim, D Ampicillin Na- Salz Boehringer Mannheim, D poly-L-Lysin HBr Sigma, Steinheim, D Bacto-casaminosäure BD, Le Pont de Claix, F MgCl2 - Lösung Rapidozym, Berlin, D D (+)-Biotin Carl Roth, Karlsruhe, D MgCl2*6H2O Merck, Darmstadt, D CaCl2*2H2O Merck, Darmstadt, D MgSO4*7H2O Merck, Darmstadt, D

Calcium

D-phantothenat Fluka, Buchs, CH MnCl2*4H2O Riedel de Haen, Seelze, D Chloroform neolab, Heidelberg, D L-Methionin Carl Roth, Karlsruhe, D CuSO4*5H2O Merck, Darmstadt, D Natriumazid

Sigma, St. Louis, MO, USA

DIDS Sigma-Aldrich, Steinheim, D NaCl Merck, Darmstadt, D

Diamid Calbiochem, La Jolla, CA,

USA Na2MoO4*2H2O Merck, Darmstadt, D

Sigma-Aldrich, Steinheim, D NaOH Merck, Darmstadt, D DMSO Sigma-Aldrich, Steinheim, D Natrium L-Glutamat*H2O Merck, Darmstadt, D

λ_-DNA New England BioLabs,

Ipswich, MA, USA Nikotinsäure Merck, Darmstadt, D

EDTA Sigma, Steinheim, D Omeprazol Sigma-Aldrich, Steinheim,

D

≥99.8% ethanol Carl Roth, Karlsruhe, D Phenol, Tris saturated Biomol, Hamburg, D FeSO4*7H2O Merck, Darmstadt, D 10x PCR-Puffer Rapidozym, Berlin, D FM4-64 (Synapto Red) Sigma-Aldrich, Steinheim, D 2-Propanol neolab, Heidelberg, D GeneRuler DNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, D Pyridoxin HCl Serva, Heidelberg, D Glasperlen,

Größe: 0,75-1mm Carl Roth, Karlsruhe, D Quinacrine HCL Fluka, Buchs, CH Glukose*H2O Carl Roth, Karlsruhe, D Saccharose Serva, Heidelberg, D Glycerin Carl Roth, Karlsruhe, D Succinat Sigma, St. Louis, MO,

USA

Hefeextrakt KAT Ohly DHW, Hamburg, D Thiamin HCl Sigma, Steinheim, D

Hepes Serva, Heidelberg, D Tris Carl Roth, Karlsruhe, D

HindIII Fermentas, St. Leon-Rot, D Triton X-100 Carl Roth, Karlsruhe, D L-Histidin*HCl*H2O Merck, Darmstadt, D Trypton LP0042 Oxoid, Basingstroke, UK meso-Inosit Carl Roth, Karlsruhe, D Wasserstoffperoxid Merck, Darmstadt, D Isoamylalkohol Merck, Darmstadt, D ZnSO4*7H2O Merck, Darmstadt, D

K2HPO4 Merck, Darmstadt, D ZnCl2 Merck, Darmstadt, D

3.1.1 Biologisches Material

Für diese Arbeit stand eine vollständige Sammlung von Mutantenstämmen für alle lebensfä-higen Einzeldeletionen, basierend auf dem haploiden Stamm BY4741 (MATa, his3 leu2 met15 ura3) der Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Verfügung (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/, [Winzler et al. (1999)]). In dieser Arbeit wurden die in Ta-belle 3-2 aufgeführten Hefe–Stämme verwendet.

Tabelle 3-2: Liste der verwendeten Hefe-Stämme

Stamm mit genetischer Deletion Alias Genname Herkunft

∆atr1 SNQ1 EUROFANII ∆cot1 EUROFANII ∆glr1 LPG17 EUROFANII ∆gsh1 EUROFANII ∆gsh2 EUROFANII ∆pbi2 EUROFANII

∆pdr5 LEM1, YDR1, STS1 EUROFANII

∆pdr10 EUROFANII ∆pdr12 EUROFANII ∆qdr1 EUROFANII ∆qdr2 EUROFANII ∆qdr3 AQR2 EUROFANII ∆snq2 EUROFANII ∆trx1 EUROFANII ∆trx2 EUROFANII

∆vps21 VPS12, VPT12, YPT21, YPT51 EUROFANII

∆yap1 PAR1, SNQ3 EUROFANII

∆ycf1 EUROFANII

∆yor1 YRS1 EUROFANII

∆ypt7 AST4, VAM4 EUROFANII

∆zrc1 OSR1 EUROFANII

Saccharomyces cerevisiae BY4741

∆zrt3 EUROFANII

Escherichia coli SF8 (recBC, lop11, tonA1, thr1, leuB6, thy1, lacY1, supE44, hsm-, hsr-)

diente der Produktion des pFL1- Plasmides. E. coli JM109 (recA1, endA1, gyrA96, thi-1,

hsdR17(rK-mk+), e14–(mcrA–), supE44, relA1, (lac-proAB)/F' [traD36, proAB+, lac Iq,

lacZ M15 (http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/119392709/PDFSTART)

diente der Transformation und anschließenden Produktion des Plasmides pBluescript SK(+). In dieser Arbeit wurden die Säugerzelllinien aus Tabelle 3-3 verwendet. Die Säugerzelllinien wurden freundlicherweise von der AG Geßner (UK Leipzig) und der AG Hartwig (TU Berlin) zur Verfügung gestellt.

Tabelle 3-3: Liste der verwendeten Säugerzelllinien

Zelllinie Art Herkunft

HepG2 A549 humaner Leberkrebs humaner Lungenkrebs AG Geßner, UK Leipzig AG Hartwig, TU Berlin 3.1.2 Medien

In dieser Arbeit wurden folgende Medien verwendet (Tabelle 3-4): Agarplatten wurden 1,5 %ig (w/v) angesetzt.

Tabelle 3-4: Verwendete Medien mit Verwendungszweck

Medium Bestandteile pro Liter

Verwendungs-zweck LB+

(nach Qiagen® Plasmid Purifica-tion Handbook)

10 g Trypton, 5 g, Hefeextrakt, 10 g Natriumchlorid, pH 7,4 mit

Natronlauge + 100 µg Ampicillin/ ml Anzucht von E.coli

YE

[Neukamm et al. (2002)]

5 g Hefeextrakt, 20 g Glucose, pH 6,3 Anzucht von Hefen

YEPD

[Neukamm et al. (2002)]

20 g Trypton und 10 g Hefeextrakt in 900 ml Wasser + 100 ml

20 % Glukoselösung Anzucht von Hefen

WMIX

[Neukamm et al. (2002)]

10 g Natriumglutamat und 0,075 g meso-Inosit in 830 ml Wasser lösen. Je 10 ml von MgCl2 (6 H2O, 25 g/l), CaCl2 (2 H2O, 10 g/l)

und MgSO4 (7 H2O, 55 g/l) hinzugeben und autoklavieren.

An-schließend 40 ml Kaliumphosphat-Puffer (bestehend aus zwei Lösungen, die den pH 6,5 einstellen: 0,5 M KH2PO4- und 0,5 M

K2HPO4-Lösung), 100 ml 20%ige Glukoselösung, 4 ml 250x

Spurenelemente (437,5 mg/l ZnSO4 x 7 H2O, 125 mg/l FeSO4 x

7 H2O, 25 mg/l CuSO4 x 5 H2O, 25 mg/l MnCl2 x 4 H2O und 25

mg/l Na2MoO4 x 2 H2O in 10 mM EDTA lösen, mit Wasser

auf-füllen, sterilfiltrieren und bei 4 °C lagern), 4 ml 250x Vitamine ( 2,5 g/l Nicotinsäure, 6,25 g/l Pyridoxin, 2,5 g/l Thiamin, 0,625 g/l Biotin und 12,5 g/l Calcium-Phanthotenat lösen bei pH 5-6 in Wasser, sterilfiltrieren und bei 4 °C lagern) und folgende Amino-säuren hinzugeben: 40 mg/l Leucin, 100 mg/l Histidin, 60 mg/l Methionin und 1 g/l Casaminosäuren.

Minimalmedium für verwendete Hefe im Transfek-tionsassay

3.1.3 Puffer, Lösungen, Verbrauchsmaterial

Als Verbrauchsmaterial wurden Spitzen und Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2 ml) von Eppen-dorf (Hamburg, D), Reaktionsgefäße größeren Volumens, Petrischalen oder Multi-Well-Platten von Greiner Bio-One (Frickenhausen, D) verwendet. Generell wurden folgende Puf-fer verwendet (Tabelle 3-5).

Tabelle 3-5: Liste der generell verwendeten Puffer und Lösungen

Puffer / Lösung Komponenten pH-Wert

10 x PBS 1,8 l: 40,21 g Na2HPO4 * 7 H2O, 4,08 g KH2PO4 157,79 g NaCl pH 7,5 PBS+/+ (für die Säugerzellfärbung) 2 l: 16 g NaCl, 0,32 g KH2PO4, 0,32 g KCl, 2,4 g Na2HPO4 pH 7,4 1x TAE

(Gebrauchslösung für die Ge-lelektrophorese)

20 mM Natriumacetat, 40 mM Tris und 2 mM EDTA

pH 8,3

mit Eises-sig

1x TE-Puffer

(Isolierung genomischer DNA) 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA pH 8.0

Lysepuffer

(Isolierung genomischer DNA)

2% Triton X-100, 1% SDS,

100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 PEG-Lösung

(E.coli Transformation)

8% PEG 2000, 0,2 M NaCl, 10 mM Tris,

1 mM EDTA pH 7,6

3.1.4 Verwendete Lösungen und Substanzen in der Zellkultur

Die verwendeten Substanzen und Lösungen sind in Tabelle 3-5 dargestellt:

Tabelle 3-6: Liste der verwendeten Substanzen und Lösungen

Substanz/Lösung Hersteller Substanz/Lösung Hersteller

Anti Rabbit

HRP-Antikörper Dako, Hamburg, D

Luciferase Assay

Inklusive Cell Culture Lysis Puffer

Promega GmbH, Mannheim, D Bisacrylamid Armesco, Solon,

O-hio Magermilchpulver

Carl Roth, Karlsruhe, D Bradford-Assay Bio-Rad, München, D β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich,

Steinheim, D DEAE/Dextran Sigma-Aldrich,

Stein-heim, D Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich, Steinheim, D DMEM (1 g/l Glukose; 3,7 g/l NaHCO3 pH 7,4) Sigma-Aldrich, Stein-heim, D Rab5a Antikörper + siRNA

Santa Cruz Bio-technology, CA, USA

DMSO Sigma-Aldrich,

Stein-heim, D TEMED

Serva, Heidel-berg, D

Fetal Calf Serum Gibco/Invitrogen,

Karlsruhe, D Trypsin

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Fugene HD Roche Diagnostics,

Kulmbach, D Tween 20

Merck, Darm-stadt, D

GAPDH-siRNA Bioneer, Korea Vectashield mit DAPI

Vector Laborato-ries, Burlingame, CA

3.1.5 Plasmide

Hefe-Transfektions-Assay:

YEp24 oder pFL1 (Botstein et al. (1979)): Vektor für E. coli und S. cerevisiae (7,769 kb). Der Vektor enthält die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgene, den Replikationsursprung von

E. coli, Hefe 2 µm DNA und das URA3 Gen aus Hefe.

HepG2- und A549-Transfektions-Assay:

pBluescript SK(+) mit dem CMV-Promotor, dem Luciferase-Gen und der SV-Poly (A)-Region (4,716 kb). Der Vektor trägt eine Ampicillin-Resistenz. Das Plasmid wurde mit verschiede-nen Restriktionsansätzen (30 µl-Ansatz: 1 µg DNA, 1 µl Enzym (10 u), 3 µl Puffer und der Rest Wasser; Inkubation bei 37 °C 2 Stunden oder über Nacht) überprüft.

3.2 Methoden

3.2.1 Allgemeine Techniken 3.2.1.1 Gefrierkultur

1 ml einer Kultur aus der stationären Wachstumsphase (Bakterien oder Hefe) wurde mit 300 µl Glycerin in einem Gefrierkulturröhrchen (GreinerbioOne GmbH, Frickenhausen, Deutsch-land) versetzt und bei -80 °C aufbewahrt.

3.2.1.2 Kultivierung

Aus einer Hefe-Gefrierkultur wurde mittels Impföse Kulturlösung auf eine Agarplatte mit ge-eignetem Medium (Selektionsmedium bei Plasmid tragenden Kulturen, Vollmedium bei allen anderen) ausgestrichen und für 2-3 Tage bei 28 °C (bei Bakterien beträgt die Temperatur 37°C) bebrütet. Mit einer Einzel-Kolonie wurden 20 ml YEPD- (für Hefen) und LB+- Medium (für Bakterien) angeimpft. Diese Vorkultur wurde 2-3 Tage lang kultiviert und diente zum Animpfen der Hauptkultur (100 ml). Flüssigkulturen ab 20 ml wurden auf Reziprokschüttlern bei 120 U/min und 28 °C (für Hefen und 37 °C für Bakterien) geführt. Das Verhältnis von Füllmenge zu Fassungsvolumen der verwendeten Erlenmeyerkolben betrug 1:5.

3.2.1.3 E.coli Transformation

E. coli Zellen werden in 20 ml LB+-Medium ca. bis zu einer OD600= 0,4 wachsen gelassen

(ca. 2 h.15 min.). Im Anschluss wird die Zellsuspension für 10 min. auf Eis gestellt und bei 3500 g für 4 min. abzentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 5 ml eis-kaltem 10 mM Tris, 100 mM MgCl2 pH 7,6 resuspendiert (Überführung in ein 15 ml