4.2 Transfektionssteigerung durch cytosolischen Stress
4.2.3 Defekte Stressantwort in Hefe
4.2.3.2 Einfluss von zellulären Entgiftungsprozessen auf den Transfektionsprozess68
FM4-64-Färbung Stamm
Fluoreszenz Phasenkontrast
WT- Kontrolle
A A1
gsh1
B B1
Abbildung 33: Visualisierte Vakuolenmembran in gsh1 und im Wildtyp nach 3,5 h;
Größenmarker: 10 µm
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass oxidativer Stress durch Deleti-onsstämme, die einen Defekt in der antioxidativen Antwort aufweisen, simuliert wer-den kann. Durch das Fehlen einzelner Schlüsselproteine in der oxidativen Stress-abwehr wie Glutathion oder Thioredoxin 2 wird eine Transfektionssteigerung erzielt.
Diese kann im Fall eines Thioredoxin-Mangels auf eine Verzögerung der Endozyto-se zurückgeführt werden.
4.2.3.2 Einfluss von zellulären Entgiftungsprozessen auf den Transfektionsprozess
4-Nitro-Quinolin-N-Oxid (4NQO) zu exportieren [Decottignies et al. (1995)]. 4NQO stellt auch für das Protein Atr1p ein Substrat dar [Coleman et al. (1997)], welches nach der Transporteigenschaft von Aminotriazol benannt ist [Hirata et al. (1994)]. Das Protein Pdr5p wird wie Snq2p durch die gleichen Transkriptionsfaktoren Pdr1p und Pdr3p reguliert und transportiert mit Snq2p (teilweise auch mit Ycf1p) identische a-ber auch verschiedene Substrate [Decottignies et al. (1995), Michalkova-Papjova et al. (2000), Wehrschütz-Sigl et al. (2004), Srikanth et al. (2005)]. Ihm wird durch den Transport Phosphatidylethanolamin eine Membran regulierende Funktion zuge-schrieben [Cui et al. (1998), Decottignies et al. (1998)].
Abbildung 34: Zusammenhang zwischen den Genen der oxidativen Stressantwort und de-nen der Entgiftungsprozesse I
Im Gegensatz zu Snq2p, Pdr5p und Atr1p, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, befindet sich das ABC-Transporterprotein Ycf1p an der Vakuolenmembran und befreit das Cytosol beispielsweise von Cadmium und Glutathion-Konjugaten [Li et al.
(1996), Prasad and Panwar (2004)]. Diese Proteine spielen auf unterschiedlichen Wegen eine Funktion in der Entgiftung des Cytosols.
Der Deletionsstamm snq2 erhöhte signifikant die Transfektionseffizienz um den Faktor 5,8, pdr5 um 4,1 und ycf1 um 3,2 (Abb. 35). Zum ersten Mal kann eine transfektionssteigernde Wirkung durch Proteine dokumentiert werden, die keinen bekannten unmittelbaren Einfluss auf den endozytotischen Transport ausüben. Da-gegen zeigte der Deletionsstamm atr1 keinen Unterschied zum Wildtyp.
Anhand der Färbung mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow wurde ersichtlich, dass der Farbstoff nach 3,5 h Inkubation im Wildtyp bereits die Vakuolen erreicht hatte (Abb. 35 A), während er in den Deletionsstämmen snq2, pdr5 und ycf1 noch in den Endosomen verweilte (Abb. 35 B+C+D). Dies bedeutet, dass Pro-teine, die bislang nicht mit dem endozytotischen Transport im Zusammenhang
ste-Gene der oxidativen Stressantwort
TRX2 GSH1 GSH2
Gene von Entgif-tungsprozessen I
SNQ2 PDR5 YCF1 ATR1
Trans- kriptions-
Faktor:
Yap1p
hen, eben diesen beeinflussen können. An dieser Stelle kann festgehalten werden, dass die Endozytose durch die Verhinderung des Transportes von durch die Zelle selbst produzierter Metabolite verlangsamt wird und somit der Transfektionsprozess gesteigert werden kann, da keine bekannten Substrate der untersuchten Transporter supplementiert wurden.
Lucifer Yellow- Färbung Stamm Transfektionsfaktor
[-] Fluoreszenz Phasenkontrast
WT-
Kontrolle 1 ± 0,7
A A1
∆snq2 5,8* ± 1,4
B B1
∆pdr5 4,1* ± 2,7
C C1
∆ycf1 3,2* ± 1,4
D D1
Abbildung 35: Transfektionsfaktoren und Visualisierung der Endozytose von snq2, pdr5 und ycf1 im Verhältnis zum Wildtyp; Größenmarker: 10 µm. Der Stern sym-bolisiert die signifikanten Werte mit p ≤ 0,05.
Auch in dem Fusionsverhalten der Vakuole waren mittels FM4-64 Färbung Unter-schiede zum Wildtyp zu erkennen. Der Wildtyp wies vereinzelte große Vakuolen auf (Abb. 36 A). Der Deletionsstamm ycf1 zeigte hingegen im Vergleich zum Wildtyp stark fragmentierte Verbände kleiner Vakuolen (Abb. 36 C). Auch in snq2 waren kleine Vakuolenverbände erkennbar (Abb. 36 B). Ein Defekt in einem in der Plas-mamembran lokalisierten Protein Snq2p inhibierte sogar Prozesse der Vakuolenfu-sion geringfügig. In dem Deletionsstamm pdr5 ist eine leichte Fragmentierung der Vakuole sichtbar (Anhang 13). Es ist aber nahezu kein Unterschied zu erkennen.
FM4-64-Färbung Stamm
Fluoreszenz Phasenkontrast
WT- Kontrolle
A A1
∆snq2
B B1
∆ycf1
C C1
Abbildung 36: Färbung von ∆snq2 und ycf1 und Wildtyp mit dem Membran-Marker FM4-64; Größenmarker: 10 µm
Die Deletionsstämme snq2, pdr5 und ycf1 verzeichneten mittels Quinacrine-Färbung keine Besonderheiten im Ansäuerungsprozess der intrazellulären Kompar-timente auf (Daten nicht dargestellt).
Transportproteine, die bislang nicht mit dem endozytotischen Transport im Zusam-menhang stehen, können diesen und den Transfektionsprozess beeinflussen. Ein Grund dafür muss in der physiologischen Funktion des Proteins zu finden sein. Die Hauptaktivität der Proteine besteht aus dem Transport von Stoffen, um die Zelle kei-nem Stress auszusetzen. Als weitere mögliche physiologische Funktion von mul-tidrug-Transportern wird auch die Flippase-Aktivität in Lipidtranslokation angesehen [Prasad and Panwar (2004), Jungwirth and Kuchler (2006)]. Der Deletionsstamm snq2 kann kein Snq2p exprimieren, welches einer Regulation der Lipidzusammen-setzung der Zelloberfläche verdächtigt wird [Mahé et al. (1996)]. Dadurch fehlen die-ses Protein und seine Funktion in der Plasmamembran. Da dies die Membranbe-schaffenheit beeinträchtigen könnte, wurde mittels Sorbitoltests ein möglicher Ein-fluss dieser Aktivität oder der Anwesenheit des Proteins auf die Permeabilität der Plasmamembran untersucht. Ohne Energie, also in Gegenwart von Sorbitol, konnte keine Transfektion stattfinden (Daten nicht dargestellt). Dies bedeutet, dass die ver-änderte Oberflächenbeschaffenheit durch die bloße Abwesentheit oder durch die
verloren gegangene Aktivität von Snq2p nicht die Permeabilität der Membran erhöh-te. Es lässt aber keine Aussage zu, ob Snq2p überhaupt eine Lipid-Flippase-Aktivität besitzt. Da auch in pdr5 mit Sorbitol anstelle von Saccharose keine Transfektion erfolgen konnte, ist offenbar die Permeabilisierung der Membran nicht von seiner Membran regulierenden Funktion als Lipid-Translokator tangiert (Daten nicht darge-stellt) [Prasad and Panwar (2004)].
Da ein Zusammenhang zwischen der Expression von Hexose-Transportern und dem Resistenzverhalten der Substanz 4NQO gegenüber existiert [Nourani et al. (1997)], könnte eine Verbindung zwischen der Zuckeraufnahme und dem Resistenzverhalten der Zelle eine Erklärung für das unterschiedliche Transfektionsverhalten von Wildtyp und Deletionsstamm sein. Ob der Wildtyp und snq2 ein unterschiedliches Verhal-ten in der Zuckeraufnahme zeigen, wurde in drei unabhängigen Versuchen mit zwei Doppelbestimmungen unter Transfektionsbedingungen (34% Saccharose) unter-sucht. Dabei konnten weder in der Saccharose- noch in der Glukoseaufnahme Un-terschiede zwischen dem Wildtyp und dem Deletionsstamm snq2 festgestellt wer-den [Anhang 10 und 11]. Vermutlich war die Zuckerkonzentration im Medium zu hoch, um eventuelle Unterschiede feststellen zu können. An dieser Stelle konnte auch kein stärkerer Stress durch eine erhöhte Zuckerkonzentration im Medium nach-gewiesen werden, da das Wachstum weder vom Wildtyp noch von snq2 einge-schränkt war. Diese Stressuntersuchung wird im Abschnitt 4.2.3.3 wieder aufgegrif-fen.
Snq2p, Pdr5p, Atr1p und Ycf1p sind nicht die einzigen Proteine, die an Entgiftungs-prozessen beteiligt sind. Weitere ABC-Transporter mit resistenz-vermittelnder Wir-kung gegen viele Fremdstoffe sind Bpt1p, Pdr10p, Pdr12p und Yor1p. Aber auch Proteine der MFS- (Qdr1p, Qdr2p und Qdr3p) oder CDF-Familie (Zrc1p und Cot1p) weisen entgiftende Charaktereigenschaften auf (Abb. 37).
Das Protein Bpt1p ist in der Vakuolenmembran lokalisiert und ist homolog zu Ycf1p [Sharma et al. (2002)]. Es nimmt ebenso wie Ycf1p eine Funktion in der Entgiftung der Zellen von Cadmium ein. Beide weisen identische aber auch verschiedene Transport-Substrate auf. Die Transkription von Bpt1p wird jedoch nicht von Yap1p reguliert [Srikanth et al. (2005)]. Andere Transporter der Vakuolenmembran sind Cot1p und Zrc1p. Diese sind hauptsächlich für die Zink-Toleranz zuständig und im-portieren zur Entgiftung Zink in die Vakuole [MacDiarmid et al. (2002), Eide (2006)].
Abbildung 37: Zusammenhang zwischen den Genen der oxidativen Stressantwort und de-nen der Entgiftungsprozesse II + III
Dem Protein Yor1p, welches an der Plasmamembran lokalisiert ist, wird durch den Transport von Phosphatidylethanolamin wie dem Protein Pdr5p eine Membran regu-lierende Funktion nachgesagt [Decottignies et al. (1998)]. Auch Pdr12p könnte eine Flippase-Funktion an der Plasmamembran einnehmen. Es transportiert schwache organische Säuren der Kettenlänge C1-C7 [Piper et al. (1998), Holyoak et al. (1999)].
Die Expression des mit Pdr5p verwandten, an der Plasmamembran lokalisierten Pdr10p ist in Gegenwart von den nicht funktionalen Regulatoren Pdr1p und Pdr3p hochreguliert [Parle-McDermott et al. (1996), Decottignies et al. (1998)]. Die MFS-Transporter Qdr1p, Qdr2p und Qdr3p sind in Erscheinung getreten, indem sie das pharmazeutisches Reagenz Quinidin aus der Zelle exportieren können [Vargas et al.
(2004), Tenreiro et al. (2005)]. Diese Transporter haben alle gemein, dass sie über ihre Resistenz vermittelnde Wirkung in dem jeweiligen knock out-Stamm identifiziert wurden.
Die Ergebnisse der Transfektionsexperimente wurden aufgrund der Protein-Lokalisation und ihrer Protein-Familie eingruppiert (Tabelle 4-13). Die untersuchten Stämme, die einen Defekt in an der Vakuolenmembran lokalisierten Transportern aufweisen, verhielten sich unterschiedlich bezüglicher ihrer Transfektionseffizienz.
Während eine Deletion des ABC-Transporter-Gens BPT1 eine Transfektionssteige-rung um den Faktor 7,8 erzielte, erreichte eine Deletion von den
CDF-Transporter-Gene der oxidativen Stressantwort
TRX2 GSH1 GSH2
Gene von Entgif-tungsprozessen I
SNQ2 PDR5 YCF1 ATR1
Trans- kriptions-
Faktor:
Yap1p
Gene von Entgif-tungsprozessen II
BPT1 PDR10, PDR12
YOR1 ABC-
Trans-porter
Gene von Entgif-tungsprozessen III
ZRC1, COT1 QDR1, QDR2, QDR3
Genen ZRC1 lediglich eine Steigerung um den Faktor 2,3 oder von COT1 sogar kei-ne Steigerung. Cot1p beeinflusst den Transfektionsprozess somit nicht.
Tabelle 4-13: Liste verschiedener Stämme mit Defekt im Entgiftungsprozess und deren Transfektionsfaktor in Bezug zum Wildtyp.
Der Stern symbolisiert die signifikanten Werte mit p ≤ 0,05.
Lokalisation Protein-Familie Stamm Transfektionsfaktor [-]
ABC-Transporter bpt1 7,8 ± 14,6
zrc1 2,3 ± 0,5
Vakuole
CDF-Transporter
cot1 0,3 ± 0,1
yor1 72,4 ± 70
pdr12 6 ± 5
ABC-Transporter
pdr10 3,7 ± 3,3
qdr1 6,1* ± 2
qdr2 4,7 ± 1,2
Plasmamembran
MFS-Transporter
qdr3 1,3 ± 1
Die meisten Stämme mit deletierten ABC-Transporterproteinen, die an der Plasma-membran lokalisiert sind, erhöhten die Transfektionseffizienz (Tabelle 4-13). Dabei zeigten die Stämme mit einer defekten pleiotropic drug resistance (Pdr-Proteine) ei-nen durchschnittlichen Wirkungsfaktor von 4,8. Dagegen schien der Deletionsstamm
∆yor1, die Transfektionseffizienz um einen Faktor von 72 drastisch zu erhöhen. Al-lerdings ist dies wegen der hohen Standardabweichung kein signifikanter Wert.
Doch aufgrund einer höheren Transfektionseffizienz, die konstant in jedem Versuch im Vergleich zum Wildtyp festgestellt wurde, kann festgehalten werden, dass eine Deletion im Gen YOR1 den Transfektionsprozess positiv beeinflusste. Auch defekte MFS-Transporter erzielten eine Transfektionssteigerung mit Faktoren von 4,7-6,1.
Unter den MFS-Transportern, die alle das gleiche Substrat Quinidin haben, waren demnach unterschiedliche Wirkfaktoren auf die Transfektionseffizienz erkennbar.
Auch wenn rein rechnerisch nur eine signifikante Transfektionssteigerung in qdr1 erreicht wurde (Tabelle 4-13), war doch ein deutlicher Unterschied zwischen den Deletionsstämmen und dem Wildtyp zu erkennen (außer qdr3 und cot1).
Der Einfluss auf den Transfektionsprozess kann durch den fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow untersucht werden. Dabei wurden nur die Stämme gefärbt, die
eine Transfektionssteigerung erzielten. Nach 3,5 h Inkubation befindet sich der Farb-stoff im Wildtyp bereits hauptsächlich in der Vakuole (Abb. 38 A).
Lucifer Yellow
Stamm Fluoreszenz Phasenkontrast
WT- Kontrolle
A A1
∆bpt1
B B1
∆yor1
C C1
∆pdr12
D D1
∆qdr1
E E1
Der Deletionsstamm bpt1 wies Zellen mit gefärbten Endosomen und Zellen mit ge-färbten Vakuolen vor (Abb. 38 B). Da der Farbstoff bis zur Vakuole transportiert wur-de, scheint es, dass das Protein Bpt1p die Endozytose nur geringfügig beeinflusst.
In den anderen gezeigten Stämmen mit defekten Entgiftungsprozessen yor1, pdr12 und qdr1 ist durch eine vermehrte Anzahl von gefärbten Endosomen und gleichzeitig nicht gefärbte Vakuolen (Abb. 38 C, D und E) eine deutliche Blockade
Abbildung 38: Färbung von Stämmen mit einem Defekt in Entgiftungsprozessen an der Plasmamembran und Wildtyp mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow; Größenmarker: 10 µm
der Endozytose zu erkennen. Der Deletionsstamm pdr10 zeigt im Endozytose-verhalten keinen Unterschied zum Wildtyp (Daten nicht dargestellt).
Stattdessen traten mittels FM4-64-Färbung im Gegen-satz zum Wildtyp (Abb. 39 A) in pdr10 anstelle von ein-zelnen großen Vakuolen Ver-bände kleinerer Vakuolen auf (Abb. 39 B). Der Fusionspro-zess der Vakuolen war in
pdr10 eingeschränkt.
Da über den Transporter Qdr1p wenig bekannt ist und er in der Plasmamembran lokalisiert ist, wurde der Deletionsstamm qdr1 mittels Sorbitoltests auf eine Per-meabilisierung der Plasmamembran und auf einen Defekt im Ansäuerungsprozess untersucht. Damit könnte sich ein Hinweis auf eine membranregulierende Funktion des Proteines ergeben. Aber dies war nicht der Fall, da in der Abwesenheit von Qdr1p der Sorbitoltest auch negativ ausfiel. Dies bedeutet, dass keine Transfektion in der Sorbitollösung erfolgte, und dass der Permeabilsierungsgrad unverändert war (Daten nicht dargestellt). Der Ansäuerungsprozess des Stammes mit dem deletier-ten Gen QDR1 verzeichnete im Vergleich zum Wildtyp keine Anomalie (Dadeletier-ten nicht dargestellt).
Generell zeigten die Stämme mit Deletion in den Genen ATR1, BPT1, PDR10, PDR12, SNQ2, PDR5, YCF1, QDR1 oder YOR1 keine Wachstumsdefizite im Ver-gleich zum Wildtyp im YEPD-Vollmedium (Anhang 12).
Zusammenfassend kann vermerkt werden, dass erstmals ein Zusammenhang zwi-schen der Funktion von Resistenz vermittelnden Transporterproteinen, unabhängig von deren Lokalisation, und der Transfektionseffizienz gezeigt werden konnte. Sind bestimmte Entgiftungsprozesse des Cytosols nicht aktiv, erfolgt eine Simulation von
FM4-64-Färbung
Fluoreszenz Phasenkontrast
WT- Kontrolle
A A1
∆pdr10
B B1
Abbildung 39: Visualisierte Vakuolenmembran von pdr10 und Wildtyp nach 3,5 h;
Größenmarker: 10 µm
cytosolischem Stress und eine Transfektionssteigerung. Dies spiegelt sich bei-spielsweise in der Perturbation des endozytotischen Transports oder von Fusions-prozessen intrazellulärer Kompartimente in diesen Deletionsstämmen wieder. Der Permeabilisierungsgrad der Plasmamembran der Stämme mit einem an der Plas-mamembran lokalisiertem Transport-Defekt ist beispielhaft untersucht worden und nicht beeinträchtigt. Es konnte kein Einfluss auf Ansäuerungsprozesse der Vakuolen nachgewiesen werden.
4.2.3.3 Oxidativer Stress in Stämmen mit defekten Entgiftungsprozessen
Da SNQ2, PDR5 und YCF1 wie die Gene der oxidativen Stressantwort Yap1p als gemeinsamen Transkriptionsfaktor haben, ist es nahe liegend, dass Snq2p, Pdr5p und Ycf1p eine Funktion gegen oxidativen Stress einnehmen könnten.
Wenn der Stamm, der ein einzelnes Protein nicht aufweist, gegen H2O2 sensitiv sein sollte, ist es wahrscheinlich, dass genau dieses Protein eine Abwehrrolle gegen H2O2 einnimmt. Dies sollte für die oben genannten Proteine und auch für Qdr1p mit-tels Stressinduktors, 1 mM H2O2, überprüft werden. In Abwesenheit von H2O2 war in YEPD-Medium kein Wachstumsunterschied zwischen den Deletionsstämmen und dem Wildtyp ersichtlich (Daten nicht dargestellt).
Tabelle 4-14: Oxidativer Stress von verschiedenen Stämmen in verschiedenen Medien in Prozent [%]; der Stern symbolisiert die signifikanten Werte mit p ≤ 0,05.
1 mM H2O2 Medium Stamm Oxidativer Stress [%]
Wildtyp 100 ± 16
pdr5 107 ± 2,8
qdr1 145* ± 21,1 snq2 150* ± 27,1
+
YEPDycf1 174* ± 25,1 2 % Saccharose Wildtyp 100 ± 15,8 34 % Saccharose Wildtyp 134* ± 18,1
pdr5 102 ± 3
qdr1 107 ± 4
snq2 122 ± 2,9
-
34 % Saccharose (Doppelbestimmung)ycf1 128 ± 4,3
In Gegenwart von H2O2 wurde in den Deletionsstämmen snq2, qdr1 und ycf1 im Vergleich zum Wildtyp erhöhter oxidativer Stress ausgelöst. Dieser war signifikant höher als im Wildtyp oder pdr5. Genauere Informationen sind der Tabelle 4-14 zu entnehmen.
Der Einfluss der Proteine in Entgiftungsprozessen tritt meist erst dann in Erschei-nung, wenn die Entgiftung der Zelle notwendig ist. Daher wurde ebenfalls unter-sucht, ob die verwendeten Transfektionsbedingungen oxidativen Stress in der Zelle auslösen. Bei dem Transfektionsmedium handelt es sich um eine reine Saccharose-lösung. Vergleicht man den oxidativen Stress zweier Konzentrationen von Saccha-rose 2 % und 34 % im Wildtyp, wurde mit der höheren SacchaSaccha-rose-Konzentration eine signifikante Zunahme des oxidativen Stresses um 34 % festgestellt (Tabelle 4-14). Die untersuchten Deletionsstämme snq2 und ycf1 wiesen auch unter Trans-fektionsbedingungen (34 % Saccharose) in einer Doppelbestimmung durchschnitt-lich um 25 % (Differenz zwischen Wildtyp und Deletionsstamm) höheren oxidativen Stress als der Wildtyp (34 % Saccharose) auf, qdr1 jedoch nicht. Der Stress unter Transfektionsbedingungen ist generell geringer als unter H2O2. Auch wenn oxidativer Stress nachgewiesen wurde, bedeutet dies nicht, dass die Transfektionsbedingun-gen noch andere Formen von Stress erzeuTransfektionsbedingun-gen.
Mittels FM4-64-Färbung konnte der Einfluss der Saccharose auf die En-dozytose im Vergleich zum Vollmedium YEPD im Wildtyp deutlich vi-sualisiert werden. Wäh-rend im Vollmedium nach 3,5 h Inkubations-zeit bereits die Vakuolen gefärbt waren (Abb. 40 A), waren es in der Sac-charoselösung nur die Endosomen (Abb. 40 B). Da der Farbstoff endozytotisch auf-genommen wird, war die Endozytose offensichtlich durch die hohe Zuckerkonzentra-tion verzögert.
FM4-64-Färbung Medium
Fluoreszenz Phasenkontrast
YEPD
A A1
Saccharose 34 %
B B1
Abbildung 40: Einfluss vom Medium auf die Endozytose im Wildtyp an dem Beispiel der FM4-64-Färbung nach 3,5 h; Größenmarker 10 µm
Zusammenfassend kann vermerkt werden, dass Snq2p, Qdr1p und Ycf1p, aber nicht Pdr5p eine Funktion in der oxidativen Stressantwort einnehmen, und dass un-ter Transfektionsbedingungen oxidativer Stress vorherrscht, der jedoch geringer als der durch H2O2 verursachte Stress ist und die Endozytose verzögert.