Vergleicht man die prozentualen Wirkungsfaktoren an dem Beispiel Diamid in dem Transfektionsprozess (Tabelle 4-11) mit denen in der Lucifer Yellow-Akkumulation (Tabelle 4-12), ist festzustellen, dass Diamid nach 10 h Inkubationszeit den größten Einfluss auf die Transfektionssteigerung und auf die endozytotische Farbstoffakku-mulation ausübt. Demnach beeinflusst Diamid zur gleichen Zeit die Endozytose und den Transfektionsprozess optimal. Doch aus Tabelle 4-11 und Tabelle 4-12 wird zu Beginn des untersuchten Zeitraumes (2,5 h und 5 h) ersichtlich, dass eine zeitliche Verzögerung bezüglich der Auswirkung von dem endozytotischen Transport auf die Transfektionseffizienz auftritt. Diamid übt bereits nach 2,5 h Wirkung auf die Endozy-tose, was sich aber nicht in der Transfektionseffizienz wieder spiegelt. Dieser Um-stand zeigt sich auch bei den Wirkstoffen Chloroquin, Zink und DIDS. Daher lässt sich die Endozytose leichter als der Transfektionsprozesses beeinflussen.
Bei einer Gesamtinkubationszeit von 22 h mit nur 2,5 h Wirkstoffbehandlung wird nur anfänglich Stress ausgelöst. Dieser könnte während der restlichen Inkuabtionszeit wieder abgebaut werden. Obwohl ein Einfluss von einem der oben genannten Wirk-stoffe auf die Endozytose bereits nach 2,5 h erfolgt, wird bei dieser Inkubationsweise ein besseres Transfektionsergebnis als nach einer Gesamtinkubationszeit von 2,5 h erzielt. Demnach benötigt der Transfektionsprozess eine längere Zeit als 2,5 h für eine finale Transfektionseffizienz. Demnach sollte die Gesamtinkubationszeit des Assays nicht auf 2,5 h reduziert werden.
Obwohl die Transfektionseffizienz mittels Chloroquin mit der Zeit steigt, nimmt die Lucifer Yellow-Akkumulation nach 15 h ab. Betrachtet man ebenso die Akkumulation von endozytiertem Material in den Kontrollen ohne Wirkstoffe, stellt man fest, dass auch dort ein Maximum bei 15 h mit anschließendem Abfall auftritt. Zu diesem Zeit-punkt könnte die Transfektionseffizienz am höchsten sein, da zu diesem ZeitZeit-punkt am meisten Transportgut (Lucifer Yellow bzw. Plasmid-DNA) in der Zelle vorhanden
ist. Demgegenüber steigerte sich die Transfektionseffizienz mit der Einwirkdauer der Plasmid-DNA auf die Zellen unabhängig vom Wirkstoff (Daten nicht dargestellt). Die-se Diskrepanz zwischen dem Verhalten des Farbstoffes und der Plasmid-DNA lässt sich mit den unterschiedlichen Stabilitäten von Farbstoff und DNA erklären. In einem Experiment wurde Lucifer Yellow nur 2,5 h zeitgleich mit den Zellen inkubiert. Nach 22 h Gesamtinkubation konnte der Farbstoff nicht mehr nachgewiesen werden (Da-ten nicht dargestellt). Dies lässt auf einen zeitlich beding(Da-ten Abbau / Zerfall des Farbstoffes nach 15 h Inkubationszeit schließen und erklärt den Rückgang der Fluo-reszenz. Dies ist ein Indiz für eine permanente Aufnahme von Lucifer Yellow wäh-rend der Inkubationszeit.
Die wichtigsten Erkenntnise bzgl. des Transfektionsprozesses sind, dass
• cytosolischer Stress die Transfektionseffizienz verbessert, und
• cytosolischer Stress mit und ohne Stressoren, spezifisch und unspezifisch er-reicht sowie gut reguliert werden kann.
Cytosolischer Stress perturbiert dabei hauptsächlich den endozytotischen Trans-portweg (Abb. 47).
Abbildung 47: Einfluss von cytosoli-schem Stress auf den endozytotischen Transportweg; Stresssymbol
Vakuole
6 Zusammenfassung
Es wurden für eine Transfektionssteigerung neue Regulationsmechanismen des nicht-viralen Transfektionsprozesses identifiziert:
• cytosolischer Stress und
• Verlust der Stresstoleranz.
Die Steigerungen der Transfektionseffizienzen beruhen in beiden Fällen hauptsäch-lich auf der Perturbation des endozytotischen Transports. Aber auch Fusions- und/oder Ansäuerungsprozesse können für sie Ursache sein.
Die Mechanismen sind vom gentherapeutischen Interesse, weil
• die identifizierten Stressoren Diamid, H2O2, Zink und DIDS in Hefe sowie in den Säugerzelllinien HepG2 und A549 reversibel wirken und somit gut regulierbar sind. Dies ist auf zelluläre Abwehrmechanismen zurückzuführen. Dabei steigt die Stärke des Zelltyp spezifischen Schutzmechanismuses in folgender Reihenfolge von Hefe, HepG2 bis zu A549. Die Gegenwart dieser Stressoren aktiviert Ab-wehrmechanismen der Zelle, so dass ihre Wirkung mit der Zeit abnimmt. Eine permanente Gegenwart könnte größeren Stress erzeugen. Durch eine spezifisch induzierte, stärkere Verteidigung der Zelle könnte dann eine im Vergleich zu der zeitlich begrenzten Behandlung eine verringerte Transfektionseffizienz erzielen.
• sich Effekte von Stressoren unterschiedlicher Wirkweisen ergänzen lassen.
• cytosolischer Stress durch ein Transporter-Substrat wie Quinidin in einer Zelle, deren Quinidin-Exporter inhibiert ist, für eine effiziente Regulation erzeugt wer-den kann. Wird der Hemmstoff entfernt, ist der Transporter wieder funktional, und Quinidin wird exportiert. Dadurch geht dann auch seine Wirkung verloren.
• ein Verlust der cytosolischen Stress-Toleranz in Form eines Defektes in der (nicht Yap1p induzierten) oxidativen Stressantwort oder in zellulären Entgiftungs-prozessen in Hefe eine gezielte und einfache Regulation ermöglicht, da Inhibito-ren die für die Pharmaforschung neuen Target-Proteine leicht erreichen können und teilweise bereits bekannt sind. Dabei können spezielle Metabolite der Zelle als ein Stressauslöser im Cytosol wirken, wenn ihr Export verhindert wird.
Um auf ubiquitär wirkende Stressoren gänzlich verzichten zu können, aber eine Transfektionssteigerung zu erzielen, können auch einzelne Transportschritte der Endozytose wie der durch Rab5a vermittelte mittels siRNA spezifisch blockiert wer-den.
7 Ausblick
Auf der Suche nach Enhancern zur Transfektionssteigerung von Säugerzellen kann das Hefe-Modell zum Screening von Naturstoffbanken verwendet werden, um eine Vorauswahl für weitere Untersuchungen in Säugerzellen zu treffen. Stoffe mit einem positiven Wirkungsfaktor können mittels ausgewählter Deletionsstämme und Färbe-methoden auf ihren Wirkort im Endozytoseweg oder ihre Wirkweise in der Zelle un-tersucht werden. Dementsprechend können Wirkstoffe sinnvoll kombiniert werden.
Die gut charakterisierten Enhancer und ihre Kombinationen können dann zur Erhö-hung der Effizienz der nicht-viralen Gentherapie eingesetzt werden.
Oxidationsmittel besitzen underschiedliche und vielschichtige Wirkmechanismen, erhöhen aber die Transfektionseffizienz. Um dies besser zu verstehen bzw. verwen-den zu können, könnten noch weitere Klassen von Oxidationsmitteln wie Natrium-chlorit getestet werden [Ingram et al. (2003)]. Da oxidativer Stress den vesikulären Transportweg beeinflusst, gilt es die speziellen Angriffspunkte des Stresses mittels Deletionsstämmen zu identifizieren. Ebenso könnte der Stress mittels defekter Stressantwort simuliert werden, um auf den Einsatz von Stressoren zu verzichten.
Transporterproteine, die an der für Inhibitoren leicht erreichbaren Plasmamembran lokalisiert sind, üben einen negativen Einfluss auf die Transfektionseffizienz aus. Da mancher Kandidat von Ihnen auch in der Anti-Krebs-Therapie stört, sind von ihnen Inhibitoren bereits bekannt. Daher gilt es, diese Inhbitoren bei hohen Zuckerkonzent-rationen vorrangig in Säugerzellen zu testen, da sich die Lokalisationen in Hefe und Säuger unterscheiden können (Beispiel: Ycf1p befindet sich an der Vakuole, wäh-rend das homologe MRP1 an der Plasmamembran lokalisiert ist).
Das Hefetransfektions-System bietet ein großes Potential für die Aufklärung von Re-gulationsmechanismen bei der nicht-viralen DNA-Aufnahme über Endozytose. Dabei können weiterhin neue Targetproteine identifiziert werden, die dann spezifisch im Säuger mittels siRNA herunterreguliert werden können. Dies gilt es weiter auszu-bauen, da diese Methode wegen der zeitlichen Begrenzung gut regulierbar ist.
Weiterhin sollten spezifische Inhbitoren wie Nocodazole [Vendeville et al. (2004)]
und Tuberin [Rodman and Wandinger-Ness (2000)], die den Transport zum späten Endosomen inhibieren, untersucht werden, weil der Vps21p / Rab5 vermittelte Transport ein entscheidender Angriffspunkt für eine Verbesserung des Transfekti-onsprozesses ist.
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