Perturbation des Ansäuerungsprozesses

Omeprazol, Chloroquin, DIDS und Zinkchlorid wurden als Medium-Supplemente verwendet. Sie perturbieren Ansäuerungsprozesse intrazellulärer Kompartimente.

Generell kann mittels lysosomotropher Reagentien der Abbau von endozytierter DNA durch Inhibierung lysosomaler Enzyme und der Fusion von Lysosom oder Va-kuole mit Endosomen vermieden werden [Ciftci and Levy (2001)].

Omeprazol ist ein Vertreter der Protonen-Pumpen-Inhibitoren (Luciani et al. [2004]).

Krebszellen werden mit diesen Inhibitoren zur Sensibilisierung für Anti-Krebs-Medikamente vorbehandelt, was eine Erhöhung des pH-Wertes in den Lysosomen zur Folge hat. Während Omeprazol die Transfektionseffizienz in Hefe steigert (Ta-belle 4-1), erzielt es in den Säugerzelllinien HepG2 und A549 keinen positiven Ef-fekt. Da nur durch eine 24-stündige Vorbehandlung mit Omeprazol eventuelle Resis-tenzen gegen Anti-Krebs-Medikamente rückgängig gemacht werden können (Luciani et al. [2004]), könnte die Einwirkdauer von Omeprazol mit der Transfektionseffizienz zusammenhängen. Im Hefe-Assay werden die Zellen 22 h lang mit Omeprazol be-handelt, während es im Säuger-Assay nur 2,5 Stunden sind. Daher könnte Omepra-zol mehr Zeit als 2,5 h benötigen, um seine Effektivität unter Beweis zu stellen. O-meprazol ist nicht in Wasser löslich, sondern wird in DMSO solubilisiert. DMSO ist ein Detergenz, das die Zellmembran permeabilisiert [Melkonyan et al. (1996)], und eine ubiquitäre Wirkung in der Zelle aufweist. Daher sind weder DMSO noch in DMSO gelöstes Omeprazol als Wirksubstanz sonderlich geeignet.

Chloroquin

Chloroquin ist ein etablierter Transfektions-Enhancer. Er benötigt für den Eintritt in die Zelle keinen Transporter [Emerson et al. (2002)] und neutralisiert den lysosoma-len pH-Wert [Akinc et al. (2005)]. Dies bringt ein osmotisches Anschwellysosoma-len und Plat-zen des Kompartiments mit sich. Zusätzliche Wirkmechanismen von Chloroquin sind seine Interaktion mit DNA und RNA [Emerson et al. (2002), Katav et al. (2008)].

Auch in den Zelllinen HepG2 und A549 steigert Chloroquin (100 µM) die Transfekti-onseffizienz signifikant. Doch die Effektivität ist sehr unterschiedlich: in HepG2 be-trägt der Faktor 50,6, in A549 hingegen nur 1,7. Dies kann auf eine Zelltyp spezifi-sche Wirkung von Chloroquin oder eine Zelltyp ungeeignete Transfektionsmethode zurückzuführen sein [Dokka et al. (2000)]. Da die DEAE/Dextran-Methode bei A549- [Zhou et al. (1997)] und bei HepG2-Zellen [Neukamm et al. (2006)] gängig verwen-det wird, und in A549 keine effektivere Konzentration als 100 µM gefunden werden konnte, kann die unterschiedliche Transfektionseffizienz auf eine Zelltyp spezifische Wirkung von Chloroquin zurückzuführen sein.

Es können neue Erkenntnisse zu dem Wirkmechanismus von Chloroquin in HepG2 und A549 gewonnen werden: mit der Verlängerung seiner Einwirkzeit erhöht sich die Transfektionssteigerung in beiden Zelllinien bis zum maximalen Faktor von 111,3 nach 22 h Inkubation in HepG2 und von 8,9 nach 15 h Inkubation in A549 stetig (Ta-belle 4-8). Da dieser maximale Chloroquin-Effekt in A549 nach 15 h Inkubation spä-ter wieder abnimmt, muss Chloroquin seine Wirkung nach 15 h Inkubation verlieren.

Dass dies die Folge eines Verfalls der Substanz ist, ist ausgeschlossen, weil die Wir-kung von Chloroquin in HepG2 auch weit nach 15 h noch steigt. Daher kann mit der Zeit der durch Chloroquin ausgelöste Stress in der Zelle steigen. Folglich kann ein Abwehrmechanismus, der ab einem bestimmten Grad des Stresses induziert wird, die Ursache für den Rückgang der Transfektionseffizienz in A549 der Zelle sein, der den Effekt von Chloroquin zu neutralisieren versucht. Das unterschiedliche Verhal-ten von HepG2 und A549 indiziert, dass sie eine unterschiedliche Schwerpunktset-zung in der Abwehr von Chloroquin besitzen. Die Ergebnisse aus beiden Zelllinen lassen erkennen, dass mit der Erhöhung des Stresses (durch Chloroquin) auch die Transfektionseffizienz steigt.

Mit dem Einfluss von Chloroquin auf die Endozytose kann ein zusätzlicher Wirkme-chanismus belegt werden (Tabelle 4-9, Abb. 24). Chloroquin erzielt eine Anreiche-rung von endozytiertem Material in den Endosomen. Mit der Inkubationszeit in genwart von Chloroquin steigt sowohl die Anzahl der Endosomen als auch der Ge-halt des transportierten Materials (Intensität von Lucifer Yellow). Daraus lässt sich eine Blockade der Endozytose ableiten, da die Zelle das Material nicht weiter zum Lysosom transportiert, sondern in den Endosomen akkumuliert. Die vermehrte An-zahl an Endosomen könnte sich durch eine vermehrte Endosomenbildung, deren

Notwendigkeit aus der endozytotischen Blockade entsteht, oder durch eine erhöhte Aufnahmerate der Zelle erklären lassen.

Der Effekt von Chloroquin auf die Transfektionseffizienz kann in beiden Zellinien mit-tels Kombinationen mit oxidativen Stressauslösern wie Diamid und H2O2 oder ande-ren Inhibitoande-ren intazellulärer Ansäuerungsprozesse wie Zinkchlorid und DIDS aus-gebaut werden (Tabelle 4-16). In HepG2 erzielen die Oxidationsmittel Diamid (1 µM) und H2O2 (1 µM) in Kombination mit Chloroquin (100 µM) eine Transfektionssteige-rung von jeweils 115 % und 163 %, in A549 beide hingegen nur jeweils von durch-schnittlich 36 %. Die deutliche Transfektionssteigerung von HepG2 kann durch die Kooperation zweier unterschiedlicher Wirkmechanismen zu erklären sein. Während die Oxidationsmittel cytosolischen Stress verursachen, wirkt Chloroquin in den intra-zellulären Kompartimenten und erhöht den pH-Wert. Zumindest für Diamid kann be-legt werden, dass sich die Wirkweisen nicht überschneiden, da Diamid die Ansäue-rungsprozesse in Hefe nicht perturbiert (s. 4.2.1). Folglich können sich die unter-schiedlichen Mechanismen ergänzen. Der vergleichbar niedrige Effekt von den Kom-binationen in A549 könnte generell von der Stärke des Abwehrmechanismusses, was Diamid und H2O2 stärker entkräften könnte, oder von einer anderen Schwer-punktsetzung oder von einer zelltypischen, durch diese Kombination verlangten Stressantwort gegen oxidativen Stress herrühren. ZnCl2 und DIDS steigern die Transfektionseffizienz in HepG2 durchschnittlich um 52 % und erzielen in A549 mit 48 % Transfektionssteigerung einen ähnlichen Effekt. DIDS und ZnCl2 könnten als Inhibitoren von Ansäuerungsprozessen einen vergleichbaren Wirkmechanismus wie Chloroquin belegen. Trotzdem ist eine Transfektionssteigerung in HepG2 und A549 zu verzeichnen. Dies kann auf einen verstärkten Chloroquin-Effekt oder auf deren zusätzlichen Wirkweisen basieren. DIDS kann als zusätzlichen Mechanismus den Vakuolenfusionsprozess (Abb. 16 D) und wahrscheinlich das Transporterprotein MRP1, das Säugerhomologon zu Ycf1p in Hefe, inhibieren [Rebbeor et al. (1998)].

Auch ZnCl2 bietet mit der Beteiligung an der Generierung von ROS einen weiteren Wirkbereich [Decottignies et al. (1998), Yang and Pon (2003), Baird et al. (2006)].

DIDS

DIDS ist membrandurchlässig und ein Inhibitor von Anionenaustauschkanälen. Da-durch wird in Säugerzelllinien der pH-Wert intrazellulärer Kompatimente neutralisiert und im Cytosol gesenkt [Yamashiro et al. (1983), Rebbeor et al. (1998)], was

gene-rell eine Inhibierung des Endozytose zur Folge haben kann [Khalil et al. (2006)].

Auch in Hefe verhindert DIDS Ansäuerungsprozesse intrazellulärer Kompartimente und inhibiert als neue Erkenntnis den Prozess der Vakuolenfusion (Abb. 16 B+D).

Während DIDS die Exozytose [Dietrich and Lindau (1994)] und die rezeptorvermittel-te Endozytose verzögert [Chan et al. (1988)], kann nun auch sein Einfluss auf die fluid phase Endozytose belegt werden. In Gegenwart von DIDS akkumuliert endozy-tiertes Material in HepG2- und A549-Zellen. Dies deutet auf eine Blockade des en-dozytotischen Transports hin. Diese Effekte tragen gemeinsam dazu bei, dass die Zugabe von DIDS die Transfektionseffizienz sowohl in Hefe (Faktor 4,2) als auch in HepG2 (Faktor 1,8) signifikant erhöht. In A549 ist kein Effekt festzustellen, was vom Zelltyp abhängen kann. Da sowohl die Akkumulation von endozytiertem Material als auch die Transfektionseffizienz einen Höhepunkt erreichen und anschließend wieder abnehmen, könnte DIDS wie Chloroquin eine Form von Stress bis zu einem be-stimmten Punkt in der Zelle aufbauen, bis eine Stressantwort aktiviert wird. Ihre Wir-kung ist erst nach 10-15 h Einwirkzeit von DIDS ersichtlich. Dann gleichen sich der endozytotische und der Transfektionsprozess der Kontrolle ohne DIDS an. Auch an dieser Stelle wird eine Korrelation von Stress mit der Einflussnahme auf die Endozy-tose und den Transfektionsprozess postuliert. Doch der Einfluss von DIDS ist in ei-ner permanenten Gegenwart geringer als nur in eiei-ner anfänglichen für 2,5 h. Dies könnte ebenso auf eine erhöhte Stressantwort, die durch die permanente Gegenwart von DIDS notwendig sein könnte, zurückzuführen sein.

DIDS besitzt als weiteren Angriffspunkt außer dem Ansäuerungsprozess in der Zelle das vakuoläre Membranprotein Ycf1p [Rebbeor et al. (1998)], der der Zelle Resis-tenzen gegen Glutathion konjugierte Schwermetalle vermittelt [Li et al. (1996)]. Die-ses Protein nimmt im Gegensatz zu DIDS keine pH-Wert regulierende Funktion in-trazellulärer Kompartimente ein. Die Vakuolen des Deletionsstammes ∆ycf1 sind normal angesäuert (Daten nicht dargestellt). Doch weisen die Vakuolen vom Wild-typ, unter Einfluss von DIDS, und ∆ycf1 die gleiche Morphologie auf: sie sind stark fragmentiert (Abb. 16 und Abb. 36). Folglich rührt der Effekt von DIDS, den Vakuo-lenfusionsprozess zu perturbieren, von der Inhibierung von Ycf1p her.

Um einerseits zwei Effekte miteinander zu kombinieren und anderseits Substrate für Transporter ausfindig zu machen, wurde der Effekt von DIDS in den Export-Mutanten snq2 und pdr5 untersucht. Wenn DIDS eine höhere als additive Wir-kung in dem Deletionsstamm erzielt, ist dies ein Indiz dafür, dass DIDS den Stress in

der Zelle erhöht, weil es nicht exportiert werden kann. Dies bedeutet, dass DIDS von diesem Transporter-Protein in funktionaler Form exportiert werden würde. Der Effekt von DIDS fiel in snq2 jedoch kleiner als im Wildtyp aus. Dies deutet auf eine Kom-pensation beider Mechanismen oder eine gegenseitige Beeinflussung von DIDS und Snq2p hin. DIDS beeinträchtigt nachweislich Prozesse in den intrazellulären Kom-partimenten, und Snq2p ist gleichzeitig an der Plasmamembran lokalisiert. Wegen der räumlichen Trennung der Wirkorte ist es daher unwahrscheinlich, dass Snq2p und DIDS gegenseitig Angriffspunkte darstellen. Da in den Deletionsstämmen snq2 und pdr5 kein zusätzlicher Effekt zum eigentlichen DIDS-Effekt auftritt, ist DIDS kein Substrat von Snq2p oder Pdr5p.

Durch eine simultane Zugabe von DIDS und Diamid in deren wirksamsten Konzent-rationen (je 10 µM) kann im Wildtyp kein additiver Effekt in der Transfektionseffizienz erzielt werden (Daten nicht dargestellt). Dies ist unerwartet, da für DIDS und Diamid unterschiedliche Wirkmechanismen prognostiziert werden. Während DIDS Ansäue-rungsprozesse intrazellulärer Kompartimente perturbiert, ist Diamid ein Oxidations-mittel im Cytosol. Daher sollten sich die Wirkmechanismen ergänzen und die Trans-fektionseffizienz auf zwei verschiedenen Wegen positiv beeinflussen. Dies ist in die-sem Fall jedoch nicht möglich. Daher ist es wahrscheinlich, dass sich beide Effekte von Diamid und DIDS kompensieren. In dem Wirkmechanismus von DIDS findet sich ein Zusammenspiel von Blockade eines resistenzvermittelnden Transporters, des Ansäuerungs- und Fusionsprozesses wieder.

Zink

Intrazellulärer Zinkgehalt wird durch Zinktransport, Lagerung in intrazellulären Kom-partimenten oder in Zinkosomen und Bindung an Proteine reguliert [Tang et al.

(2001)]. Die Verwendung von Zinkchlorid (300 µM) erhöht die Transfektionseffizienz um einen Faktor von 5,3 in Hefe signifikant. Zink nimmt zelllinien-spezifisch nur in HepG2 (Faktor von 2,9) und nicht in A549 Einfluss auf den Transfektionsprozess (Abb. 17). Sein Effekt ist auf den Anteil der Zinkionen zurückzuführen.

Die Wirkung von Zink äußert sich in Hefe wie im Säuger in der Perturbation des in-trazellulären Ansäuerungsprozesses (Abb. 9) [Yamashiro et al. (1983)]. Als neue Erkenntnis stört Zink auch Fusionsprozesse und blockiert die Endozytose in Hefe und im Säuger. Dies wird durch eine Akkumulierung des transportierten Materials und eine erhöhte Anzahl von Endosomen belegt (Abb. 10 B+ 20+21). Die vermehrte

Anzahl an Endosomen könnte sich durch eine vermehrte Endosomenbildung, deren Notwendigkeit aus der endozytotischen Blockade entsteht, oder durch eine erhöhte Aufnahmerate der Zelle erklären lassen. Dabei übt Zink eine größere Wirkung als DIDS auf die Endozytose aus.

Der Wirkort von Zink ist wahrscheinlich das Cytosol und nicht das Innere des Kom-partimentes, da sein Export aus der Vakuole nicht versperrt sein darf (Tabelle 4-3), um seine Wirkung zu entfalten. Man könnte sagen, dass Zink nicht im entgifteten Zustand wirken kann. Zur näheren Bestimmung des Wirkortes wurde der frühe (vom frühen zum späten Endosom) und der späten (vom späten Endosom zur Vakuole) Endozytoseweg untersucht. Ist der frühe Weg unterbrochen, kommt die Wirkung von Zink nicht zur Geltung (Abb. 14). Daher lässt sich schlussfolgern, dass die zu unter-suchende DNA in die sauren Kompartimente wie Vakuole oder spätes Endosom für eine Einflussnahme von Zink gelangen muss. Demnach beeinflusst Zink Prozesse im späten Endozytoseweg.

Die Wirkung von Zink basiert nicht auf einer spezifischen Interaktion mit einem An-griffspunkt, sondern ist vielschichtig. Zu den oben genannten Eigenschaften stellen Ypt7p [Seals et al. (2000)], welches eine tragende Rolle für den Transport vom spä-ten Endosom zur Vakuole und im Transfektionsprozess einnimmt, Ccz1p, welches ähnliche Funktionen wie Ypt7p aufweist [Kucharczyk et al. (2000)], Kex2p [Podsialdo et al. (2004)], welches wichtig für den Transfektionsprozess ist [Riechers (2007)] und Luv1p [Conboy and Cyert (2000)], welches u. a. notwendig für eine normale Vakuo-lenmorphologie ist, Angriffspunkte von Zink dar. Sogar Proteine, die in Phospholi-pidtranslokationen von Membranen involviert sind, nehmen eine Funktion in der Ver-teidigung gegen Zink ein [Pomorski et al. (2003)]. Doch die Permeabilität der Plas-mamembran wird durch die Zugabe von Zink nicht verändert (s. 4.1.1.1).

Generell löst Zink in der Zelle Stress aus [Decottignies et al. (1998)], was deren Vi-taltität beeinträchtigt. In den Säugerzelllinien HepG2 und A549 konnte bei höheren Zink-Konzentrationen ab 500 µM morphologische Veränderungen und ein Absterben der Zellen beobachtet werden. Da der Einfluss auf die Endozytose mit der Zeit in Gegenwart von Zink steigt, und dies mit der Zunahme des Stresses korrelieren kann, kann beim Sinken des Einflusses ein Abwehrmechanismus einsetzen. Ab ei-ner Einwirkzeit von 12 h induziert Zink in der Säugerzelllinie J774 durch die Synthe-se von u. a. antioxidativem Metallothionein einen Schutzmechanismus [Baird et al.

(2006)]. Da hier nach 10 h Inkubation die endozytotische Akkumulation abnimmt,

könnte in HepG2 eine Induktion der Stressantwort bereits nach 10 h eintreten. Bei permanenter Gegenwart von Zink werden allgemein nach 22 h Gesamtinkubation schlechtere Transfektionsfaktoren als bei nur anfänglicher 2,5 h Behandlung erzielt.

Dies könnte auf eine Stressantwort zurückzuführen sein, die speziell bei höherem Stress induziert wird, weil der Stress in permanenter Gegenwart eines Stressfaktors gestiegen sein sollte. Die Verwendung von Zink indiziert, dass eine Transfekti-onssteigerung durch cytosolischen Stress erfolgt.

Ergänzend ist die Wirkung von Zink mit der Bildung von oxidativem Stress verbun-den und kann von einer ROS-Generierung herrühren [Tang et al. (2001), Wiseman et al. (2007)]. Zink kann Kupfer und Eisen in metallbindenden Domänen von Protei-nen ersetzen [Decottignies et al. (1998)]. Da Kupfer und Eisen sehr redoxaktiv sind, kann schnell eine Bildung von ROS erfolgen. Durch oxidativen Stress brechen die Lysosomen auf [Baird et al. (2006)], was eine Steigerung der Transfektionseffizienz zur Folge haben sollte. Zink besitzt die Möglichkeit sowohl im Säuger als auch in der Hefe in Zinkosomen zu akkumulieren. Bevor Zink exportiert wird, werden gegen Zink Abwehrmechanismen wie die Synthese von Metallothionein aktiviert [Eide (2006)].