4.1 Transfektionssteigerung durch erhöhten pH-Wert intrazellulärer
4.1.1 Inhibitoren von Ansäuerungsprozessen in Hefe
4.1.1.1 Zink
Zink ist wurde bisher nicht mit einer Wirkung auf die Endozytose oder den Transfek-tionsprozess in Verbindung gebracht. Es verhindert die Ansäuerung von endozytoti-schen Vesikeln in Mäuse-Fibroblasten [Yamashiro et al. (1983)] und Lysosomen [Ohkuma et al. (1982)]. Ein funktionaler Ansäuerungprozess kann durch den Farb-stoff Quinacrin sichtbar gemacht werden, da dieser nur in sauren Kompartimenten akkumuliert. Besteht ein Defekt im Ansäuerungsprozess des Kompartiments, ist es nicht sauer, und Quinacrin kann nicht akkumulieren, so dass es nicht visualisiert werden kann. Auch in Hefe wurden die Kompartimente in Gegenwart von Zink nicht
mit Quinacrin gefärbt (Abb. 9 B). Ohne Zinkchlorid hingegen waren die Vakuolen visuell gut sichtbar (Abb. 9 A). Die Wirkung von Zinkchlorid in Mäuse-Fibroblasten konnte mittels der Quinacrinfärbung in Hefe bestätigt werden. Demnach verhindert Zinkchlorid (100 µM) auch in Hefe die Ansäuerung der Vakuolen.
Quinacrin-Färbung
Fluoreszenz Phasenkontrast
Kontrolle (ohne ZnCl2)
A A1
Zinkchlorid (100 µM)
B B1
Abbildung 9: Visualisierte Ansäuerung der Vakuole mit und ohne Zinkchlorid (100 µM) in Hefe BY4741; Größenmarker: 10 µm
Da Ansäuerungsprozesse intrazellulärer Kompartimente mit dem endozytotischen Prozess in Verbindung stehen [Khalil et al. (2006)], wurde der endozytotische Ver-lauf mittels Lucifer Yellow-Färbung visualisiert und in Abb. 10 dargestellt.
Lucifer Yellow- Färbung FM4-64-Färbung
Substanz Fluoreszenz Phasenkontrast Fluoreszenz Phasenkontrast
Kontrolle (ohne ZnCl2)
A A1 C C1
ZnCl2
(300 µM)
B B1 D D1
Abbildung 10: Färbung mit Endozytose-Marker Lucifer Yellow und Membran-Marker FM4-64 mit/ohne Zinkchlorid (300 µM) nach 3,5 h; Größenmarker: 10 µm
Vakuole
Vakuole
Vakuolen-verband
Vakuole Endosomen
Endosom
tot
Ohne Zinkchlorid (300 µM) befand sich der Endozytose-Marker nach 3,5 h bereits hauptsächlich in der Vakuole (Abb. 10 A). In Gegenwart von Zinkchlorid waren ü-berwiegend Zellen zu finden, in denen hauptsächlich Endosomen gefärbt waren (Abb. 10 B). Dabei sind vollständig fluoreszierende Zellen tote. Da in Gegenwart von Zinkchlorid auch Zellen mit gefärbten Vakuolen sichtbar waren, war der Weitertrans-port des Farbstoffes von den Endosomen zur Vakuole jedoch nicht in allen Zellen blockiert.
Da der verzögerte endozytotische Transport u. a. durch defekte Fusionsprozesse intrazellulärer Kompartimente bestimmt wird [Khalil et al. (2006)], wurden die Zellen auch mit dem endozytotisch aufgenommen Membranfarbstoff FM4-64 gefärbt (Abb.
10). Hier ist zu erkennen, dass ohne Zinkchlorid nur einzelne größere Vakuolen in der Zelle vorhanden waren (Abb. 10 C), während in Gegenwart von Zinkchlorid (300 µM) Verbände kleinerer Vakuolen vorlagen (Abb. 10 D). Dies ist ein Zeichen für ei-nen durch Zink verursachten Defekt im Vakuolenfusionsprozess, da diese nicht mehr zu einer großen Vakuole fusionieren können.
Ob sich der Einfluss von Zink auf den endozytotischen Transport und auf die Vakuo-lenfusion in dem Transfektionsprozess wiederspiegelt, wurde folgend untersucht.
Die Zugabe von 300 µM Zinkchlorid als Supplement für das Transfektinsmedium re-sultierte in einer maximalen signifikanten Transfektionssteigerung mit dem Faktor 5,3 (Abb. 11).
2,4 2,1
1,2 5,3*
3,4*
3,9*
2,9
0 1 2 3 4 5 6
50µM 100µM 200µM 300µM 400µM 500µM 600µM
Zinkchlorid
Transfektionsfaktor [-]
Abbildung 11: Transfektionseffizienz [-] von Zinkchlorid in verschiedenen Konzentrationen als Faktor in Hefe im Verhältnis zu Proben ohne Zinkchlorid.
Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05.
Auch niedrigere Zinkchlorid-Konzentrationen (100-200 µM) wiesen signifikant erhöh-te Transfektionseffizienzen auf. Konzentrationen ab 400 µM gingen mit geringeren Transfektionssteigerungen einher, was möglicherweise auf geringere Überlebensra-ten zurückzuführen ist (nicht getestet). Die Beobachtung, dass in den Säugerzellli-nien HepG2 und A549 bei höheren Zink-Konzentrationen morphologische Verände-rungen und ein Absterben der Zellen zu beobachten war, war ein weiteres Indiz da-für. Die Transfektionssteigerung durch Zink zeigte sich in einem von der Dosis-Wirkung abhängigen Verhältnis.
Da Zinkchlorid ein Salz ist, wurde untersucht, ob die Wirkung auf Zink- oder Chlorio-nen zurückzuführen war. Dazu wurden die Wirkungsfaktoren der drei Salze Zinksul-fat, Zink- und Magnesiumchlorid in gleicher Molarität miteinander verglichen (Tab. 4-2). Dabei zeigte sich, dass bei der Zugabe von Zinksalzen jeweils ähnliche Transfek-tionsfaktoren resultierten; Magnesiumchlorid jedoch einen niedrigeren Faktor erziel-te. Demnach sind die Zink- und nicht die Chlorionen für den Effekt auf die Endozyto-se und die TransfektionEndozyto-seffizienz verantwortlich. Daher wird im Folgenden häufig nur von Zink anstelle von Zinkchlorid zu lesen sein. Salze wie Natrium- und Ammoni-umchlorid steigerten die Transfektionseffizienz nicht (Daten nicht dargestellt).
Tabelle 4-2: Vergleich der Transfektionsfaktoren [-] von Zink- und Chlorionen Substanz [100 µM] Transfektionsfaktor [-]
ZnCl2 3,1 ± 0,3
ZnSO4 2,9 ± 0,3
MgCl2 1,6 ± 0,3
Die Zelle kann Zink mittels eines ihrer ATP-abhängigen Zinktransporter [Gitan et al.
(1998)] oder mittels ATP-abhängiger Endozytose aus der Umgebung aufnehmen.
Da die Zelle aus Sorbit keine Energie (ATP) gewinnen kann, finden in Gegenwart von Sorbit weder Endozytose noch andere energieabhängige Prozesse statt. Dieser Test dient der Überprüfung, ob Substanzen die Zellmembran permeabilisieren kön-nen. Durch den Sorbit-Test wurde ersichtlich, dass Zink (100 µM) nur in Gegenwart von Saccharose, das u. a. der Energiegewinnung dient, eine transfektionssteigernde Wirkung aufwies (Abb. 12). Somit besitzt Zink keine permeabilisierende Wirkung auf die Zellmembran.
1,0
0
3,6
0 0,0
1,0 2,0 3,0 4,0
Transfektionsfaktor
Saccharose Sorbit Saccharose Sorbit
Kontrolle Zink
Abbildung 12: Transfektionsfaktor [-] in Abhängigkeit von Energie und Zink (100 µM)
Hat die Zelle ausreichend Zink aufgenommen, werden die Zinktransporter per Endo-zytose abgebaut und werden nicht weiter transkribiert [Gitan et al. (1998), Kim et al.
(2004), Wang et al. (2004)]. Dann erfolgt die weitere Zinkaufnahme passiv über die Endozytose. Diese ist unterteilbar in den frühen und den späten Endozytoseweg.
Der frühe Endozytoseweg wird hier durch das Transportprotein Vps21p, das u. a.
den Transport von dem frühen zum späten Endosom ermöglicht, und der späte durch Ypt7p beschrieben, das u. a. den Transport von dem späten Endosom zur Vakuole ermöglicht (Abb. 13) [Schimmöller et al. (1993), Gerrard et al. (2000)].
Abb. 14 zeigt, dass die Transfektionseffizienz von den Deletionsstämmen vps21 und ypt7 mit den Faktoren 20-23 wesentlich höher waren als die des Wildtyps. Ist demnach einer der Transportwege durch das Fehlen des jeweiligen Proteins defekt, verzögert sich die Endozytose und die Transfektionseffizienz steigt. Diese Ergebnis-se bestätigen Neukamm et al (2002).
Abbildung 13: Endozytose.
Die DNA (rundes Plasmid) wird durch Einstülpung der Membran aufgenommen, zum frühen Endosom, weiter mittels Vps21p zum späten Endosom und endlich mittels Ypt7p zur Vakuole transportiert.
Dort wird die DNA abgebaut werden.
Frühe Endosome
Vakuole Späte Endosome
Vps21p
Ypt7p
3,5
23,1
19,9
22,7 26,3
0 5 10 15 20 25 30
100µM Zink H2O 100µM Zink H2O 100µM Zink
WT vps21 ypt7
Transfektionsfaktor [-]
Abbildung 14: Transfektionsfaktoren [-] von Zink in Wildtyp und den Deletionsstämmen vps21 und ypt7
Zink (100 µM) wies keinerlei Effekt in vps21 auf. Jedoch in ypt7 war durch Zink (100 µM) eine additive Transfektionssteigerung zu verzeichnen. Wenn der frühe En-dozytoseweg in vps21 nun blockiert ist, wird die transportierte DNA bereits in den frühen Endosomen aufgehalten. Da Zink keine Wirkung zeigte, wenn die DNA sich im frühen Endosom befindet, kann dort nicht der Wirkungsbereich von Zink liegen.
Wenn jedoch die DNA bis zum späten Endosom transportiert werden konnte (in ypt7), erzielte Zink eine Steigerung der Transfektionseffizienz. Daher liegt es nahe, dass Zink seinen Wirkungsbereich im späten Endozytoseweg hat.
Im Cytosol liegt Zink nicht frei, sondern gebunden in Metallproteinen oder Metall-konjugierten Substanzen wie Glutathion vor. Dieses wird zur Speicherung in die Va-kuole transportiert, von dort aus kann es nach Bedarf wieder freigelassen werden.
Zrt3p, Zrc1p und Cot1p sind als Zinktransporter in der Vakuolenmembran lokalisiert.
Abbildung 15: Darstellung der Funktion und Lokalisation von den Zink-transportern Zrt3p, Zrc1p und Cot1p.
Vakuole
Zrc1p Cot1p Zrt3p
[Zn2+]
Metalloproteine &
Kompartimente
Zrt3p mobilisiert eingelagertes Zink und exportiert es aus der Vakuole, während Zrc1p und Cot1p für die Zink-Toleranz zuständig sind und Zink zur Entgiftung in die Vakuole importieren (Abb. 15) [MacDiarmid et al. (2000), MacDiarmid et al. (2002), Eide (2006)]. Die Vakuole gilt als Kompartiment von Entgiftungsprozessen [Rebbeor et al. (1998)].
Durch einen Defekt im Zink-Import in die Vakuole ( zrc1 und cot1) ließ sich in Ge-genwart von Zink (100 µM) keine Steigerung der Transfektionseffizienz erzielen (Ta-belle 4-3). Wurde der Export von Zink aus der Vakuole in zrt3 gehindert, ging die transfektionserhöhende Wirkung von Zink verloren.
Tabelle 4-3: Transfektionsfaktoren [-] von Stämmen mit defekten Zinktransportern in Ge-genwart von ZnCl2 (100 µM)
Stamm Transfektionsfaktor [-]
Wildtyp 3,2 ± 0,3 zrc1 2,4 ± 0,6
cot1 4,3 ± 1
zrt3 1,1 ± 0,5
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Zinkionen Ansäuerungs- und Fusionsprozesse des späten Endozytoseweges in Hefe perturbieren. Dies findet sich in einer leicht verzögerten Endozytose und einer signifikant erhöhten Transfek-tionseffizienz, die eine Dosis-Wirkung-Relation vorweist, wieder. Zink wirkt wahr-scheinlich im Cytosol, an und nicht in der Vakuole.