4.2 Transfektionssteigerung durch cytosolischen Stress
4.2.2 Oxidative Stress-Induktoren in HepG2- und A549-Zellen
Die in Hefe getesteten oxidativen Stress-Induktoren Diamid und Wasserstoffperoxid wurden auch in den Säugerzelllinien HepG2 und A549 auf ihre transfektionsstei-gernde Wirkung untersucht. In Abb. 27 sind die Transfektionsfaktoren bei Verwen-dung verschiedener Konzentrationen von Diamid dargestellt.
0,6
1,1 1,1 1,1 1,0 1,1
2,9 4,8*
4,1*
3,0* 2,9*
3,4*
0 1 2 3 4 5 6
400 100 10 1 0,1 0,01
Diamid [µM]
Transfektionsfaktor [-]
Hepg2 A549
Abbildung 27: Einfluss von Diamid in verschiedenen Konzentrationen auf die Transfektion-seffizienz der Zelllinien Hepg2 und A549.
Der Stern symbolisiert die signifikanten Werte mit p ≤ 0,05
In A549 zeigte Diamid keinen Einfluss auf die Transfektionseffizienz. In HepG2 hin-gegen konnte beim Einsatz von 100 nM Diamid eine maximale und signifikante Stei-gerung der Transfektionseffizienz um den Faktor 4,8 erzielt werden. Diamid zeigte einen leichten Dosis-Wirkung-Zusammenhang, da höhere und niedrigere Diamid-Konzentrationen in geringeren Transfektionsfaktoren resultierten.
Um die Versuchsbedingungen zu optimieren und denen des Hefemodells anzupas-sen, wurde die Inkubationszeit der Zellen in Gegenwart von Diamid mit der Gesamt-inkubation gleichgesetzt und variiert. Die Transfektionseffizienzen nach 2,5 h Inku-bationszeit sind nicht mit denen des Standardassays gleichzusetzen, da hier der Zellaufschluss bereits nach 2,5 h und nicht nach 24 h erfolgte (Tabelle 4-11). Die Transfektionsfaktoren nach 2,5 h in HepG2 und A549 lagen hier mit 1,1 deutlich un-ter dem des Standardassays mit 4,1 für HepG2 und 1,5 für A549.
Tabelle 4-11: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von Diamid (1 µM) in HepG2- und A549-Zellen in [%]; ohne Substanz entspricht 100%. Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05
Zelllinie Zeit in [h] 2,5 h 5 h 10 h 15 h 22 h Faktor in
[%] 107 150 205 162 130
HepG2
Stabw ± 13 ± 39 ± 60 ± 40 ± 21
Faktor in
[%] 108 98 130 120 125
A549
Stabw ± 11 ± 4 ± 28 ± 15 ± 22
Die Transfektionsfaktoren stiegen in beiden Zelllinien bis zu einer Gesamtinkubati-onszeit von 10 h. Danach nahm die Transfektionseffizienz wieder ab. In A549 war mit der Präsenz von Diamid und der Verkürzung der Gesamtinkubation auf 10 h mit dem Faktor 1,3 eine Zunahme der Transfektionseffizienz im Vergleich zum Standar-dassay (Faktor 1,1) zu erzielen. In HepG2 ließ sich durch eine Verlängerung der In-kubationszeit in Gegenwart von 1 µM Diamid, jedoch bei Verkürzung der Gesamtin-kubation kein größerer Transfektionsfaktor erzielen als bei einer 2,5 h Additiv- Inku-bation mit einer GesamtinkuInku-bationszeit von 24 h. Die Transfektionseffizienzen von HepG2 waren nach 24 h Gesamtinkubation bei einer Einwirkdauer der Additive von nur 2,5 h höher als bei permanenter Gegenwart der Additive. Dies lässt darauf schließen, dass Diamid auf Dauer seinen Einfluss auf den Transfektionsprozess in HepG2 verliert.
0,90,6
1,4 1,9*
2,1* 2,6*
3,3*
1,5 1,5
0 1 2 3 4 5 6
400 100 10 1 0,1
H2O2 [µM]
Transfektionsfaktor [-]
HepG2 A549
Abbildung 28: Einfluss von H2O2 in verschiedenen Konzentrationen auf die Transfektionsef-fizienz der Zelllinien HepG2 und A549.
Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05.
Auch mit dem zweiten Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid konnte eine signifikante Transfektionssteigerung in den Experimenten des Standardassays in HepG2 festge-stellt werden (Abb. 28). Von den getesteten Konzentrationen war 100 µM H2O2 mit dem signifikanten Faktor von 3,3 die wirksamste. Auch in A549 konnte eine um ca.
50 % erhöhte Transfektionseffizienz verzeichnet werden. 400 µM H2O2 wirkte auf beide Zelllinien toxisch, was an der veränderten Morphologie der Zellen mikrosko-pisch zu beobachten war. Ein Dosis-Wirkung-Zusammenhang war in Gegenwart von H2O2 nicht zu erkennen.
In Hefe konnte gezeigt werden, dass Diamid die Endozytose und H2O2 die Fusions-prozesse der Kompartimente in der Zelle beeinflusst (s. Kapitel 4.2.1). Der Einfluss auf die endozytotische Aufnahme bzw. die Endozytose lässt sich mittels fluid phase-Endozytose-Markers Lucifer Yellow einfach quantifizieren bzw. visualisieren. Gene-rell stieg die Akkumulation des Farbstoffes in HepG2-Zellen bis zu 15 h Inkubation und fiel später wieder ab (Abb. 29), ohne den genauen Akkumulationsort an dieser Stelle zu definieren. Mit den Zusätzen Diamid (1 µM) und H2O2 (100 µM) erhöht sich die Akkumulation von Lucifer Yellow im Vergleich zur Kontrolle ohne Additiv deutlich.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0 5 10 15 20 25
Zeit [h]
AFU [-] Kontrolle
Diamid H2O2
Abbildung 29: Einfluss von Diamid (1 µM) und H2O2 (100 µM) auf die Akkumulierung vom fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen.
Die prozentuale durchschnittliche Steigerung des Lucifer Yellow-Gehaltes im Ver-gleich zur Kontrolle hielt sich innerhalb von 10 h Inkubation in Gegenwart von Dia-mid (1 µM) mit 38,4 % nahezu konstant (Tabelle 4-12). Anschließend nimmt die pro-zentuale Akkumulation des Farbstoffes ab, erzielt aber dennoch eine Steigerung von
21 % im Vergleich zur Kontrolle. Dies könnte von einem Abwehrmechanismus ge-gen Diamid herrühren, dessen Wirkung auf den Transfektionsprozess nach ca. 10 h ersichtlich wird.
Tabelle 4-12: Akkumulation vom fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit und den Additiven Diamid (1µM) und H2O2 (100 µM).
Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05.
Inkubationszeit [h]
Substanz
2,5 5 10 15 22
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 100 100 100 100 100 ohne
Stabw. [%] 19,9 14,6 0,2 7,1 10,0
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 140,6* 131,2 143,4 120,0 122,7*
Diamid (1 µM)
Stabw. [%] 26,3 16,0 0,1 5,9 10,5
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 114,0 125,6* 130,0 135,5 125,1*
H2O2
(100 µM)
Stabw. [%] 20,5 16,9 0,1 5,3 0,7
Vergleicht man den prozentualen Wirkungsfaktor von Diamid in dem Transfekti-onsprozess (Tabelle 11) mit dem in der Lucifer Yellow-Akkumulation (Tabelle 4-12), ist festzustellen, dass Diamid nach 10 h Inkubationszeit den größten Einfluss auf die Transfektionssteigerung und auf die endozytotische Farbstoffakkumulation ausübt. Doch aus Tabelle 4-11 und Tabelle 4-12 wird zu Beginn des untersuchten Zeitraumes (2,5 h und 5 h) ersichtlich, dass eine zeitliche Verzögerung bezüglich der Auswirkung auf die Transfektionseffizienz und auf den endozytotischen Transport von Diamid auftrat.
Die Wirkung von H2O2 erreichte ihren Höhepunkt mit einer Steigerung des Farbstoff-gehaltes in der Zelle von 35,5 % im Vergleich zur Kontrolle ohne Additiv nach 15 h (Tabelle 4-12). Die Ergebnisse der Experimente zur Bestimmung der Akkumulation des Endozytose- Markers verhalten sich in A549 ähnlich und sind in Anhang 8 und 9 dargestellt.
Um den endozytotischen Prozess zu visualisieren, wurden HepG2-Zellen mit Lucifer Yellow gefärbt und nach den Zeiträumen 4 h und 22 h photographisch dokumentiert (Abb. 30). Diamid (1 µM) und H2O2 (100 µM) verhalfen in HepG2 zur Akkumulation des fluid phase-Markers. Nach bereits 4 h, aber auch nach 22 h Inkubation waren mehr Endosomen gefärbt als in der Kontrolle ohne Additiv. Mit der längeren
Inkuba-tionszeit von 22 h war ein leichter Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten. Dieser Umstand spiegelt sich in den Ergebnissen der Fluoreszenzmessung wieder.
Inkubationszeit Substanz Fluoreszenz Phasenkontrast
Kontrolle
Diamid (1 µM) 4 h
H2O2 (100 µM)
Kontrolle
Diamid (1 µM) 22 h
H2O2 (100 µM)
Abbildung 30: Färbung von HepG2 Zellen mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow; Größenmarker: 50µm
Zusammenfassend kann vermerkt werden, dass Diamid und H2O2 die Transfektion-seffizienz in HepG2 signifikant steigern. Auch in A549 konnte durch Diamid eine um
10 % und durch H2O2 eine um 50 % bessere Effizienz festgestellt werden. Dies kann auf einen durch die Additive Diamid und H2O2 verzögerten endozytotischen Trans-port zurückzuführen sein, der sich in einer in besonders Endosomen vermehrten Ak-kumulation des fluid phase-Markers Lucifer Yellow äußert.