4.1 Transfektionssteigerung durch erhöhten pH-Wert intrazellulärer
4.1.2 Inhibitoren von Ansäuerungsprozessen in HepG2- und A549-Zellen
4.1.2.1 Zink und DIDS
In dem Transfektionsassay erzielte Zink nach 22 h in HepG2 bei einer niedrigeren Konzentration (1 µM) als in Hefe (50 µM) eine signifikante Transfektionssteigerung mit einem vergleichbaren Faktor von 2,9 (Abb. 17). Bei den verschiedenen geteste-ten Konzentrationen ließ sich keine Dosis-Wirkung-Relation erkennen, d. h. es war keine steigende bzw. abfallende Wirkung in Abhängigkeit der getesteten Konzentra-tionen ersichtlich.
Der in Hefe erzielte Effekt war in HepG2 nicht reproduzierbar. In A549 scheint es, dass Zink keine Wirkung auf die Transfektionseffizienz hat (Abb. 17).
0,0 0,0
1,2
2,0 2,9*
2,1*
1,1 1,3 1,0
0,3 0
1 2 3 4 5 6
0,1 1 10 100 500 1000
Zinkchlorid [µM]
Transfektionsfaktor [-]
HepG2 A549
Abbildung 17: Transfektionsfaktoren [-] von Zinkchlorid in verschiedenen Konzentrationen als Faktor in HepG2 und A549.
Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05.
Das Hefe-Modell unterscheidet sich zum Säugermodell in der Verwendung des DEAE/Dextran-Komplexes. Der Komplex erleichtert in dem Säugerzellmodell die Aufnahme der Plasmid-DNA, indem er mit dieser aufgrund seiner positiven
Ladun-gen interagiert [Schenborn and Goiffon (2000)]. Als Grund für die Nicht-Reproduzierbarkeit kann die Verwendung dieses Komplexes ausgeschlossen wer-den, da auch ohne diesen Komplex keine größere Transfektionssteigerung erzielt werden konnte (Daten nicht dargestellt).
Wie im Hefemodel wurde der Einfluss von Zinkionen in HepG2 überprüft. Dazu wur-den die Wirkungsfaktoren der drei Salze Zinksulfat, Zink- und Magnesiumchlorid in gleicher Molarität (1 µM) miteinander verglichen (Tab. 4-5). Im Hefemodel zeigte sich, dass Zinkionen für den Effekt verantwortlich sind. In HepG2 ließ sich jedoch nur ein leichter Trend der Zinkionen vermuten. Die zweiwertigen negativ geladenen Sulfationen scheinen, sich negativ auf den Zinkeffekt auszuwirken. An dieser Stelle werden keine weiteren Ausführungen gemacht, da diese auf Spekulationen beruhen würden.
Tabelle 4-5: Vergleich der Transfektionseffizienz von Zinkchlorid, -sulfat und Magnesium-chlorid in HepG2 (Konzentration: 1 µM)
Substanz [1 µM] Transfektionsfaktor [-]
ZnCl2 2,8 ± 0,1
ZnSO4 2,1 ± 0,1
MgCl2 1,8 ± 0,1
DIDS, welches wie Zink Ansäuerungsprozesse perturbiert, erhöhte signifikant die Transfektionseffizienz in Hefe. In Abb. 18 sind die Transfektionsfaktoren von ver-schiedenen DIDS-Konzentrationen in HepG2 und A549 dargestellt.
0,5
1,0 1,2 1,2 1,1
0,2*
1,5*
2,4 1,6 1,8*
0 1 2 3 4 5 6
480 100 10 1 0,1 0,01
DIDS [µM]
Transfektionsfaktor [-]
HepG2 A549
Abbildung 18: Transfektionsfaktoren [-] von DIDS in verschiedenen Konzentrationen in den Zelllinien HepG2 und A549.
Der Stern symbolisiert signifikante Werte mit p ≤ 0,05.
In HepG2 ließ sich eine leichte, jedoch signifikante Transfektionssteigerung mit den Faktoren 1,8 und 1,5 bei den Konzentrationen 10 µM bzw. 0,1 µM erkennen. Bei den geringen Veränderungen der Transfektionseffizienzen war ein leichter Dosis-Wirkung-Zusammenhang ersichtlich. In A549 zeigte DIDS wie zuvor Zink keinen Ein-fluss auf die Transfektionseffizienz.
Zink und DIDS erzielten in HepG2 signifikant erhöhte Transfektionseffizienzen, in A549 jedoch nicht. Ein Grund dafür könnte in nicht optimalen Inkubationszeiten lie-gen. Die gemeinsame Inkubationszeit von Zelle und Substanzen beträgt im Stan-dardassay 2,5 h. Nach 21,5 h weiterer Inkubation (insgesamt 24 h) wird dann die Transfektionseffizienz bestimmt. In dem Hefemodell sind die Additive während der gesamten Inkubationszeit von 22 h im Medium präsent. Um auszuschließen, dass den Additiven zur Interaktion mit der Zelle Zeit fehlen könnte, oder dass die gesamte Inkubationszeit für die Zelllinien nicht optimal sei, wurde im Folgenden die Inkubati-onszeit in Gegenwart der Substanz mit der Gesamt-InkubatiInkubati-onszeit gleichgesetzt und variiert.
In Abb. 19 und Tabelle 4-6 sind die prozentuale Transfektionseffizienzen in Gegen-wart der Substanzen Zink (1 µM) und DIDS (10 µM) in HepG2 dargestellt. Bis zu ei-ner Gesamtinkubationszeit von 10 h stieg die Transfektionseffizienz durch beide Substanzen. Anschließend fiel diese wieder ab. Zink zeigte dabei einen stärkeren Einfluss auf die Transfektionseffizienz als DIDS.
50 100 150 200 250
0 5 10 15 20 25
Inkubationszeit [h]
Transfektionseffizienz [%]
HepG2 - ZnCl2 HepG2 - DIDS
Abbildung 19: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von ZnCl2 (1 µM) und DIDS (10 µM) in HepG2-Zellen im Vergleich zur Kontrolle ohne Substanz (100 %) in Prozent
Die Transfektionseffizienzen nach 2,5 h Inkubationszeit in Gegenwart des Additivs sind nicht mit denen des Standardassays gleichzusetzen, da hier der Zellaufschluss bereits nach 2,5 h und nicht nach 24 h erfolgte. Da aber nach Beendigung des As-says nach 2,5 h eine geringere Transfektionseffizienz als nach einer 24 h Inkubation erreicht wurde, kann daraus abgeleitet werden, dass die Additive oder der Transfek-tionsprozess selbst mehr Zeit als 2,5 h benötigen, um genügend Einfluss auf den Transfektionsprozess ausüben zu können. Durch eine Verlängerung der Inkubati-onszeit in Gegenwart von Zink (1 µM) oder DIDS (10 µM) von 2,5 h auf 10 h, jedoch eine Verkürzung der Gesamtinkubation von 24 h auf 10 h ließ sich mit den Faktoren 2 oder 1,7 kein größerer Transfektionsfaktor als beim Standardassay (Faktoren ca.
2,9 oder 1,8) erzielen (Tabelle 4-6).
Tabelle 4-6: Transfektionseffizienz in Abhängigkeit der Inkubationszeit in Gegenwart von Zinkchlorid (1 µM) oder DIDS (10 µM) in HepG2-Zellen in [%]; ohne Substanz entspricht 100%
Substanz Zeit in [h] 2,5 h 5 h 10 h 15 h 22 h Faktor in
[%] 108 152 201 146 117
ZnCl2 (1 µM)
Stabw ± 8 ± 8 ± 50 ± 14 ± 15
Faktor in
[%] 100 128 173 131 103
DIDS (10 µM)
Stabw ± 7 ± 33 ± 47 ± 10 ± 10
Die Transfektionseffizienzen von HepG2 waren nach 24 h Gesamtinkubation bei ei-ner Einwirkdauer der Additive von nur 2,5 h höher als bei permanenter Gegenwart der Additive. Dies lässt darauf schließen, dass Zink und DIDS auf Dauer ihren Ein-fluss auf den Transfektionsprozess verlieren. Dies könnte aus einer Abwehr gegen die Additive seitens der Zelle herrühren. Die Daten von Zink und DIDS der gleichen Versuche mit den variierten Inkubationszeiten in A549 sind im Anhang 2 zu finden.
Sie verhalten sich ähnlich wie die von HepG2.
Im Hefemodell konnte mittels Lucifer Yellow-Färbung und Deletionsstamm-Analyse für Zink eine Wirkung auf die Endozytose belegt werden. Für die Untersuchungen in den Säugerzellen HepG2 (Abb. 20) und A549 wurde ein Assay verwendet, der den Gehalt von dem fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in der Zelle zu be-stimmten Zeitpunkten erfasst. Der Farbstoff wird per Endozytose aufgenommen und schließlich zum Lysosom transportiert. Er soll in diesem Assay mit der
transportier-ten Plasmid-DNA gleichbedeutransportier-tend sein. Die Datransportier-ten zu A549 verhaltransportier-ten sich ähnlich wie die von HepG2 und sind im Anhang 3 und 4 dargestellt.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0 5 10 15 20 25
Zeit [h]
AFU [-] Kontrolle
Zink DIDS
Abbildung 20: Akkumulierung des fluid phase-Endozytose-Markers Lucifer Yellow in HepG2-Zellen.
Der Lucifer Yellow-Gehalt stieg mit der Inkubationszeit bis zu 15 h und nahm dann wieder ab (Abb. 20). In Gegenwart von Zink und DIDS war zu jedem Zeitpunkt mehr Lucifer Yellow in der Zelle als in der Kontrolle ohne Additiv (mit Wasser). Die Test-substanzen verhelfen Lucifer Yellow demnach, in der Zelle zu akkumulieren. Diese Ergebnisse bestätigen einen Einfluss der Testsubstanzen auf die Endozytose, wie er zuvor in Hefe festgestellt wurde.
Tabelle 4-7: Akkumulation vom fluid phase-Endozytose Marker Lucifer Yellow in HepG2-Zellen in Abhängigkeit der Inkubationszeit und den Additiven ZnCl2 (1 µM) und DIDS (10 µM)
Inkubationszeit [h]
Substanz
2,5 5 10 15 22
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 100 100 100 100 100 ohne
Stabw. [%] 19,9 14,6 0,2 7,1 10,0
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 135,6* 137,7 153,2 146,8 128,5*
ZnCl2
(1 µM)
Stabw. [%] 20,2 10,8 0,1 4,9 0,1
Akkumulation
von Lucifer Yellow [%] 122,3* n. t. 129,7 132,5 118,4 DIDS
(10 µM)
Stabw. [%] 17,6 n. t. 0,1 5,4 7,2
Betrachtet man die prozentuale Steigerung des akkumulierten Lucifer Yellows in Gegenwart der Additive im Verhältnis zu der Kontrolle ohne Additiv, stellt man fest, dass die maximale Steigerung in der Inkubationszeit von ca. 10-15 h liegt (Tabelle 4-7). Dieses Ergebnis korreliert mit dem aus dem zeitabhängigen Transfektionsassay, in dem die maximale Transfektionseffizienz nach 10 h erreicht wurde.
Um herauszufinden, an welchem Ort sich der Farbstoff in der Zelle befindet, bzw.
um den endozytotischen Prozess zu visualisieren, wurden HepG2-Zellen mit Lucifer Yellow gefärbt und nach den Zeitpunkten 4 h und 22 h photographisch dokumentiert (Abb. 21).
Inkubationszeit Substanz Fluoreszenz Phasenkontrast
Kontrolle (ohne ZnCl2)
A A1
4 h
ZnCl2
(1 µM)
B B1
Kontrolle (ohne ZnCl2)
C C1
22 h
ZnCl2
(1 µM)
D D1
Abbildung 21: Färbung von HepG2 Zellen mit dem fluid phase-Endozytose-Marker Lucifer Yellow mit und ohne ZnCl2 (1 µM); Größenmarker: 50µm
Endosomen
Lysosomen
Nach 22 h Inkubation konnte im Vergleich zu der vierstündigen Inkubation eine Stei-gerung der Akkumulation von Lucifer Yellow verzeichnet werden. Dabei war deutlich zu erkennen, dass in der Gegenwart von Zink (1 µM) sowohl nach 4 h (Abb. 21 B) als auch nach 22 h (Abb. 21 D) mehr Farbstoff in einer höheren Anzahl von Endo-somen akkumuliert als ohne Zink (Abb. A+C). Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen aus den Fluoreszenz-Messungen von Lucifer Yellow überein.
Zusammenfassend kann vermerkt werden, dass Zink und DIDS in der Säugerzellli-nie HepG2 signifikante Transfektionssteigerungen bewirken, in A549 nicht. Die in beiden Zelllinien anfänglich positive Wirkung der Stoffe auf den Transfektionspro-zess, geht nach einer bestimmten Zeit ca. 10-15 h zurück. Zink und DIDS verhelfen in beiden Zelllinien zur Akkumulation von Lucifer Yellow.