Säugerzell-Kultivierung

3.2.9.1 Zellkultur von HepG2- und A549-Zellen

Die Kultivierung der Zelllinie erfolgt generell bei 37 °C, 5% CO2, in Dulbecco’s MEM-Medium mit 1,5 g/l D-Glucose, 3,7 g/l NaHCO₃(pH 7,4;); Zusatz von 10% (v/v) hitzeinakti-vertem FCS (Fetal Calf Serum), von 100 units Penicillin/ml und von 0,1 mg Streptomycin/ml in 10 cm-Zellkulturschalen. Sind die Zellen konfluent gewachsen, so werden sie einmal mit 7 ml PBS (pH 7,4) gewaschen und durch eine fünfminütige Inkubation mit 2 ml Trypsin-Lösung (PBS, pH 7,4; 0,25% (w/v) Trypsin; 0,2 g/l EDTA) im Brutschrank abgelöst. In die Platte werden 7 ml Medium hinzugegeben, um Trypsin zu inaktivieren. Durch Auf- und Ab-ziehen in der Pipette werden die Zellen vereinzelt. Die Zellen werden bei 800 rpm (Sorvall RT6000D Zentrifuge, Rotor H1000B) abzentrifugiert und in Medium resuspendiert. An-schließend folgt die Zellzahlbestimmung mittels Neubauerkammer. Diese wurde nach Her-stellerangaben durchgeführt. Die Zellen werden wieder in einer geeigneten Verdünnung (0,5-2,5 x10⁶ Zellen /Platte) mit frischem Medium ausgesät.

3.2.9.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Die Zellen einer bewachsenen 10 cm-Zellkulturschale werden mit Trypsin-Lösung (s. o.) abgelöst, für 5 min bei 800 rpm abzentrifugiert und in 3,5x10⁶ Zellen/ml Einfriermedium (90

% FCS; 10 % (v/v) DMSO) resuspendiert. Die Zellsuspension wird in ein Kryoröhrchen überführt, für wenige Stunden bei 20°C gelagert und anschließend über Nacht langsam auf -80°C abgekühlt. Die dauerhafte Lagerung erfolgt in flüssigem Stickstoff.

Zur Rekultivierung werden die Zellen im Kryoröhrchen rasch in einem 37°C Wasserbad auf-getaut, 500 µl DMEM-Medium werden hinzugegeben und in ein Röhrchen überführt. Trop-fenweise werden unter leichtem Schwenken 10 ml DMEM hinzugegeben. Nach

Zentrifugati-on für 5 min bei 800 rpm werden die Zellen in 10 ml Medium resuspendiert. Dieser Vorgang dient dem Herauswaschen des aus dem Einfriermedium stammenden DMSO. Dann werden die Zellen in einer Kulturschale ausgesät. Nach einem Tag in Kultur wird das Medium ge-wechselt.

3.2.9.3 Transfektion von HepG2- und A549-Zellen

Ernten von 1,5x10⁵ HepG2- und 1x10⁵ A549-Zellen / Well (24-Well-Platte) in 500 µl DMEM-Medium mit 10 % FCS und ATB. Es folgt eine „über Nacht“-Inkubation (15 h) bei 37 °C und 5 % CO₂. Danach werden die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen und mit 260 µl Mix-Medium ohne ATB / Well (mit 5µl DNA (0,5µg) / Well und mit 12,5 µl DEAE-Dextran (10 mg/ml)/ Well;

es wurde mit 2x13 Wells gerechnet) versetzt. Als Zugabe wurde ggf. 10 µl Additiv bzw. Was-ser hinzugegeben. Nach 2,5 h Inkubation wird das Medium entfernt, die Zellen mit PBS ge-waschen und in 500 µl Medium ohne ATB (und ggf. mit erneutem Additiv) aufgenommen.

Versuchsabhängig wird entsprechend Additiv erneut hinzugegeben. 24h später werden Zel-len mikroskopiert und mit PBS gewaschen. Die Lyse erfolgt mit 100 µl Cell Culture Lysis Puffer. Dieser wirkt 20 min. auf einem Rund-Schüttler bei 220 rpm ein. Danach waren alle Zellen sichtbar lysiert. Hiernach wurde die Lösung mittels Tischzentrifuge in Eppis abzentri-fugiert (5 min. 10.000 rpm). Die 20 µl Probenentnahme und Analyse erfolgte in 96er Well-Platte (weiss high binding clear Boden; GreinerBio-one) nach dem Luciferase Assay Sys-tem.

Optimierung des Zellkultur-Assays:

Nach Neukamm et al. [2006] wird in dem Transfektionsassay erst nach 48 h detektiert und 1 µg/ml Insulin verwendet. Da die Lumineszenz-Werte nach 24 h Inkubationszeit um den Fak-tor 10⁴ höher sind als nach 48 h Inkubation, beträgt die Inkubationszeit in diesem Transfek-tionsprotokoll 24 h (Daten nicht dargestellt). Da Insulin den endozytotischen Prozess stimu-liert Pitterle et al. [1999], schwer löslich und teuer ist, wird der Zusatz Insulin auf seine Not-wendigkeit in dem Transfektionsprotokoll getestet.

0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 80000000

Kontrolle 100 µM Cloroquine

pFL1-Kontrolle

ALU [-]

ohne Ins ulin mit Insulin

Abbildung 8: Einfluss von Insulin auf die Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen.

Es wird bei Verwendung von HepG2-Zellen nach 24 h Inkubationszeit eine leichte, aber nicht notwendige Stimulanz der Transfektion festgestellt (Abb. 8), die sich jedoch nicht in dem Transfektionsfaktor widerspiegelt: Faktor von 30 ohne Insulin und ein Faktor von 26 in Gegenwart von Insulin. Als Kontrolle für das Readout-System des Assay wird der pFL1-Vektor verwendet, der keine Luciferase codiert. Nach Abbildung 8 funktioniert das Readout-System. Die Lumineszenz nimmt unabhängig von der Zugabe eines Additivs stetig innerhalb von 24 h Inkubationszeit zu. Daher ist es vom Autor empfohlen, die Inkubationszeit nicht zu verringern.

3.2.9.4 Quantifizierung von Lucifer Yellow (LY)

Die Methode basiert in abgeänderter Form auf Croizet-Berger et al. (2002). Es werden 1,5x10⁵ HepG2- und 1x10⁵ A549-Zellen / Well in einer 24-Well-Platte über Nacht angezo-gen. Die toten Zellen werden mit PBS herausgewaschen. Die Additive werden für 1 h mit den Zellen in je 500 µl DME-Medium vorinkubiert. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit LY-DME-Medium (Endkonzentration: 0,8 mg/ml) versetzt. Die Additive werden in jeweiliger Konzentration erneut hinzugegeben. Es folgen 2,5 h, 5 h, 10 h, 15 h und 22 h Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2. Um den Farbstoff zu entfernen, werden die Zel-len dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die ZelZel-len werden mit 120 µl Cell Culture Lyse-Puffer bei 10 rpm für 15 min. auf Eis abgedunkelt lysiert.

In einer Doppelbestimmung werden je 50 µl in einer weißen Mikrotiterplatte (GreinerbioOne;

Kat.Nr. 655074) analysiert (Excitation: 355 nm; Emission: 535 nm). Zur Kalkulation werden die Fluoreszenzeinheiten auf den Proteingehalt bezogen. Der Proteingehalt wurde mittels Bradford-Assays ermittelt. Zum Vergleich als Kontrolle wird ein Teil der Zellen nach 2 h In-kubation mit PBS gewaschen und mit jeweiligen Additiven erneut versetzt. Weiter analysiert werden diese Zellen nach insgesamt 4 h und 24 h Inkubation.

Alle Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Versu-chen.

3.2.9.5 HepG2-Färbung mit Lucifer Yellow (LY)

Als Vorbereitung müssen die Deckgläser gefärbt werden: diese werden mittels Diethylether für 5 min. entfettet. Nachdem sie getrocknet sind, werden sie mit Alician Blue (1 mg/ml in Ethanol) für 10 min. gefärbt. Mit 70 % Ethanol und anschließend mit Wasser werden diese dann gespült. Nun werden die Deckgläser mit Kleenex poliert und autoklaviert.

3,7 *10⁵ Zellen / 2,5 ml DMEM pro Well werden in einer 6-Well-Platte angezogen. Am nächsten Tag werden die Additive hinzugegeben. Deren vorläufige Inkubationszeit beträgt 1 h bei 37 °C und 5 % CO₂. Anschließend werden die Zellen mit PBS gewaschen. Es erfolgt

im Dunkeln die Zugabe von Lucifer Yellow (0,8 mg/ml) und erneut von den Additiven. Nach der Kultivierung der Zellen für 4 h und 22 h unter Zellkulturbedingungen werden diese drei-mal mit eiskaltem PBS^+/+ (s. o.) gewaschen. Mittels Skalpell wird das Deckglas aus der Plat-te entfernt, trocken getupft und auf einen SpitzenhalPlat-ter gelegt. Je 5 min. lang wird das Deckglas mit 70 %, dann 83% und schließlich 96 % Ethanol (je -20 °C) gewaschen. Es folgt eine Trockenphase im Dunkeln. Dann wird das Deckglas auf einen Objektträger mit Vectas-hield (Mounting-Lösung) gegeben und mikroskopiert (Axio Imager M1 von Zeiss).

3.2.9.6 Knock down von Rab5A 3.2.9.6.1 Protein-Nachweis

Die Zellen werden mittels Cell Culture Lysis-Puffer mit 1mM PMSF aufgeschlossen und mit-tels denaturierenden Gels aufgetrennt. U. a. wurde auch der RIPA-Puffer (50 mM Tris/HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton-X-100, 0,4% Deoxycholat und 1% SDS; [Yin und Lazar (2005)]) verwendet. Die verwendeten Puffer zeigten die gleiche Effizienz.

3.2.9.6.1.1 Proteinauftrennung für ca. 30 kDa große Proteine

Tabelle 3-7: Zusammensetzung des Proteingels Trenngel (12 %): Sammelgel (4,5 %):

Bisacrylamid 2,25 ml Bisacrylamid 0,55 ml 4x Trenngelpuffer 1,9 ml 4x Sammelgelpuffer 1,25 ml

Wasser 3,3 ml Wasser 3,14 ml

TEMED 15 µl TEMED 10 µl

10% APS 50µl 10% APS 25 µl

Trenngelpuffer: 1,5 M Tris/HCl; 0,4 % SDS; pH8,8 Sammelgelpuffer: 0,5 M Tris/HCl; 0,4 % SDS; pH6

Das Trenngel wird mit Gemisch von 1:1 aus Wasser / Isopropanol abgeschlossen, um eine gerade Grenze für das Gel zu erlangen. Nach Auspolymerisierung wird das Isopropa-no/Wasser-Gemisch abgegossen; der Rest wird mittels Papier aufgesaugt. Nachdem das Sammelgel gegossen und der Kamm entfernt wurde, werden die Taschen mit Wasser ge-spült, um überschüssige Luft zu entfernen.

Die Probenaufarbeitung besteht aus dem 3 minütigem Kochen der Probe (10 µl) in 4 µl 4x Lämmli- Puffer (0,25 M Tris/HCl pH 6,8; 8 % SDS; 20 % Glycerin; 20 % β-Mercaptoethanol;

Bromphenolblau) und dem anschließendem schnellen Abkühlen auf Eis. Der Rainbow-Marker (97 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, 14,3 kDa) wird auch mit Lämmli-Puffer mitgekocht.

Der Laufstrom des Gels ist 100 V für 1,75 h; 10x Laufpuffer: 144 g Glycin, 30,6 g Tris, 10 g SDS.

3.2.9.6.1.2 Western Blot:

Das Gel wird zwischen 2x4 Whatman–Filter, die in Transferpuffer (3 g Tris, 14 g Glycin, 100 ml Methanol) getränkt wurden, und der Membran (Millipore GmbH, Schwalbach, D; 8,5 cm x 5,5 cm), die durch Ethanol aktiviert wurde, mit 500 mA / Gel für 20 min. geblottet. Das Sam-melgel wurde zuvor weggeschnitten.

Die Banden des Rainbow-Markers werden auf der Membran mit Kuli markiert und beschrif-tet. Über Nacht wird die Membran mit 20 ml Reagenz (3 % BSA + 0,1% Tween 20) bei 4 °C geblockt. Alternativ kann auch für 2 h auf dem Schüttler bei Raumtemperatur (RT) geblockt werden. Die Membran wird anschließend mit 20 ml primärer Antikörperlösung (Rab5A; San-ta Cruz Biotechnology, CA USA; VF 1:1000) in PBS + 3% BSA für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die „primärer-Antikörper“-Lösung kann wieder verwendet werden.

Es folgen drei Waschschritte mit PBS +0,05 % Tween 20 für 15 min. auf dem Schüttler bei RT. Die „sekundärer Antikörper“-Lösung (Anti-Rabbit; VF 1:4000; in 5 % Magermilchpulver in PBS + 0,05 % Tween 20) ist abermals für 1 h bei RT auf der Membran. Es folgen drei Waschschritte mit PBS +0,05 % Tween 20 für 15 min. auf dem Schüttler bei RT. Anschlie-ßend kann die Lösung abgegossen werden. Die Dektion der Meerrettich-Peroxidase-Reaktion erfolgt mittels im Kodak-Imager bei einer Integrationszeit von 2-20 min. mit Hilfe des „Western Lightning“-Systems von Perkin Elmer.

3.2.9.6.1.3 Coomassie-Färbung

Nach dem Blot wird das Gel über Nacht bei Raumtemperatur in Coomassie-Lösung (0,2 % Coomassie Brillant Blue R250, 30 % Methanol, 10 % konz. Essigsäure in Wasser) geschüt-telt. Anschließend wird das Gel mittels Lösung (45 % Methanol, 10 % konz. Essigsäure) für mind. 1 h entfärbt. Die Entfärbelösung wird über einen Aktivkohle-Filter entsorgt. Die Tro-ckenlösung (10 % Glycerin, 30 % Methanol) kann mehrmals verwendet werden und wirkt ca.

30 min. auf das Gel. Das Gel wird dann zwischen vorbehandelten Folien (Promega GmbH, Mannheim, D), die 30 min. in Wasser einweichten, auf einer Plexiglas-Platte für 1-2 Tage zum Trocknen geklemmt.

3.2.9.6.2 siRNA-Reverse- mit anschließender Luciferase-Transfektion

Als Transfektionsreagenz für die siRNA wurde Fugene HD verwendet. Es ist ein Transfekti-onsreagenz und besteht aus einem nicht näher definierten Gemisch aus Lipiden und

ande-ren Bestandteilen, die in 80% Ethanol gelöst sind. Es gilt als sehr effizient und wenig toxisch bei verschiedenen Zellarten [Herstellerangaben].

0,5 x10*⁵ HepG2 Zellen / Well und 0,3x10*⁵ A549 Zellen / Well wurden in 500µl pro Probe in deie Wells einer 24-Well-Platte vorgelegt (DMEM ohne ATB). 100 µl siRNA-Mix pro Probe (6 pmol siRNA + 4 µl Transfektionsreagenz Fugene HD in Wasser) wurde hinzugegeben, nachdem dieser zuvor 20 min. Zeit hatte, bei Raumtemperatur miteinander zu reagieren.

Nach 24 h Inkubation im Brutschrank (bei 37 °C und 5 % CO2) wurde erneut siRNA-Mix hin-zugegeben, um eine effizientere Herunterregulierung der mRNA-Translation zu erreichen.

Nach insgesamt 48 h Inkubation wurden die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen, in 250 µl DMEM ohne ATB „resuspendiert“ und mit dem Transfektionsreagenz für 2,5 h im Brut-schrank bei 37 °C und 5 % CO₂ versetzt (0,5µg DNA und 12,5 µl DEAE-Dextran (10 mg/ml) pro Well). Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 500 µl Medium ohne ATB aufgenommen. 24h später werden Zellen mikroskopiert und mit PBS gewaschen. Die Lyse erfolgt mit 100 µl Cell Culture Lysis Puffer. Dieser wirkt 20 min. auf einem Rund-Schüttler bei 220 rpm ein. Danach waren alle Zellen sichtbar lysiert. Hiernach wurde die Lö-sung in Eppis abzentrifugiert (5 min. 10.000 rpm). Die 20 µl Probenentnahme und Analyse erfolgte in 96er Well-Platte (weiss high binding clear Boden; GreinerBio-one, Frickenhausen, D) nach dem Luciferase Assay System (Promega GmbH, Mannheim, D).

Täglich wurde die Wirksamkeit der siRNA mittels Western Blot-Analyse überprüft. Dazu wur-den die Zellen mit PBS gewaschen, und mit 50 µl Cell Culture Lysis Reagent mit 100 mM PMSF bei Raumtemperatur für 20 min. auf einem Rund- Schüttler bei 220 rpm versetzt. Da-nach waren alle Zellen sichtbar lysiert. HierDa-nach wurde die Lösung in Eppis abzentrifugiert (5 min. 10.000 rpm) und mittels SDS-PAGE analysiert.

Es wurden Rab5a- und GAPDH-siRNA (als negativ-Kontrolle) verwendet.