Experimentelle Untersuchungen zur Wirksamkeit rekombinanter Antikörperfragmente
gegen Eimeria tenella-Infektionen beim Huhn
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Julia Wedel aus Bielefeld
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. G. Glünder
Klinik für Geflügel
Prof. Dr. A. Daugschies
Institut für Parasitologie
Universität Leipzig
1. Gutachter: PD Dr. G. Glünder Prof. Dr. A. Daugschies
2. Gutachter: Prof. Dr. G. von Samson-Himmelstjerna
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2009
Meiner Familie
The enormous unexplored biosphere within us and around us renders this effort worthwhile (WÖRN 2001).
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 13
2 LITERATURÜBERSICHT... 15
2.1 Kokzidiose des Huhnes...15
2.1.1 Taxonomie und Entwicklungszyklus der Eimerien ...15
2.1.2 Epidemiologie: Spezifität und Tenazität der Eimerien ...19
2.1.3 Erscheinungsformen der Kokzidiose und Bekämpfungsmethoden ...21
2.2 Immunität gegenüber Eimerien...27
2.2.1 Zelluläre Immunität...28
2.2.2 Humorale Immunität ...30
2.3 Möglichkeiten der passiven Immunisierung gegen Eimerien ...35
2.3.1 Passive systemische Immunisierung durch Verabreichung von Antiseren..36
2.3.2 Passive systemische Immunisierung durch maternale Antikörper...38
2.3.3 Passive lokale Immunisierung durch orale Verabreichung von monoklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten ...41
2.4 Rekombinante Antikörpertechnologie ...45
2.4.1 Antikörperformate...46
2.4.2 Antikörperexpression...49
2.4.3 Antikörperstabilität...55
3 MATERIAL UND METHODEN ... 60
3.1 Antikörper...60
3.2 Versuchstiere ...63
3.2.1 Herkunft...63
3.2.2 Tierschutz und Haltung ...63
3.2.3 Futter und Wasser...65
3.2.4 Temperatur und Licht ...65
3.2.5 Reinigung und Desinfektion ...66
3.3 Kokzidienstamm...66
3.3.1 Herkunft und Charakteristika...66
3.3.2 Gewinnung und Reinigung von E. tenella-Oozysten ...66
3.3.3 Gewinnung und Aufreinigung von Sporozoiten ...68
3.3.4 Zählung und Dosierung von Oozysten und Sporozoiten ...69
3.4 In vitro-Untersuchungen ...70
3.4.1 PCR zur Überprüfung der Reinheit des Oozystenmaterials ...70
3.4.2 ELISA zur Bestimmung des BA11-Antikörpergehalts in Futter- und Fäzesproben ...72
3.5 Anordnung der Tierstudien...74
3.5.1 Vorversuch zur retrograden caecalen Applikation ...74
3.5.2 Wahlversuch zum Mahlgrad von Futtererbsen...75
3.5.3 Vorversuch zur Fütterung antikörperhaltiger Erbsen ...77
3.5.4 Vorversuche zu verschiedenen Infektionsdosen ...78
3.5.5 Screeningtests zum Vergleich verschiedener Antikörperfragmente ...79
3.5.6 Wirksamkeitsstudie AB28...81
3.5.7 Wirksamkeitsstudie Fab28 ...84
3.5.8 Wirksamkeitsstudie AB28-di-ckappa...85
3.6 Durchführung der Tierstudien ...86
3.6.1 Ermittlung der Körpergewichte ...86
3.6.2 Methoden der Applikation von Kokzidien und Antikörperpräparaten...86
3.6.3 Beurteilung der Blutbeimengungen im Kot ...89
3.6.4 Gewinnung und Untersuchung von Kotproben...89
3.6.5 Untersuchung der Einzelkotproben nach der McMaster-Methode ...90
3.6.6 Bestimmung der Oozystenzahlen aus den Blinddärmen...91
3.6.7 Hämatokritbestimmung ...92
3.6.8 Pathologisch-anatomische Untersuchung ...92
3.7 Statistische Auswertung ...93
4 ERGEBNISSE ... 96
4.1 Oozystengewinnung ...96
4.2 In vitro - Untersuchungen ...97
4.2.1 PCR zur Überprüfung der Reinheit des Oozystenmaterials ...97
4.2.2 ELISA zur Bestimmung des BA11-Antikörpergehalts in Futter- und Fäzesproben ...98
4.3 Vorversuche zu den Tierstudien...102
4.3.1 Vorversuch zur retrograden caecalen Applikation ...102
4.3.2 Wahlversuch zum Mahlgrad von Futtererbsen...104
4.3.3 Vorversuch zur Fütterung antikörperhaltiger Erbsen ...105
4.3.4 Vorversuche zu verschiedenen Infektionsdosen ...107
4.4 Screeningtests zu verschiedenen Antikörperfragmenten...111
4.4.1 Screeningtest 1 ...111
4.4.2 Screeningtest 2 ...113
4.4.3 Screeningtest 3 ...114
4.5 Wirksamkeitsstudie AB28 ...117
4.5.1 Abschnitt 1: Versuch mit caecaler Infektion und Antikörperapplikation ...117
4.5.2 Abschnitt 2: Versuche mit oraler Infektion und Antikörperapplikation...123
4.5.3 Abschnitt 3: Versuche mit oraler Infektion und Antikörperapplikation über das Futter...127
4.6 Wirksamkeitsstudie Fab28 ...135
4.7 Wirksamkeitsstudie AB28-di-ckappa...144
4.8 Einfluss der eingesetzten Infektionsdosen ...154
4.8.1 Gewichtszunahmen...155
4.8.2 Hämatokritwerte ...156
4.8.3 Blutbeimengungen in den Fäzes...157
4.8.4 Blinddarmläsionen...158
4.8.5 Oozystenzahlen...159
4.9 Wechselbeziehungen von Darmläsionen und Oozystenzahlen...161
4.9.1 Abhängigkeit der Blinddarmläsionen von der Oozystenproduktion ...161
4.9.2 Korrelation von Oozystenzahlen in den Blinddärmen und im Kot...162
5 DISKUSSION... 164
5.1 Kokzidienstamm...164
5.1.1 Oozystengewinnung...164
5.1.2 Sporozoitengewinnung und Aufreinigung...164
5.1.3 PCR zur Überprüfung der Reinheit des Oozystenmaterials ...165
5.2 Methodik der Tierstudien ...166
5.2.1 Auswahl der Versuchstiere...166
5.2.2 Retrograde caecale Verabreichung von Sporozoiten und Antikörpern...168
5.2.3 Oozystenzählung nach der McMaster-Methode...169
5.3 Einfluss der Infektionsdosen ...172
5.3.1 Gewichtszunahmen...172
5.3.2 Hämatokritwerte ...173
5.3.3 Blinddarmläsionen...174
5.3.4 Oozystenzahlen...175
5.4 Wechselbeziehungen der Untersuchungsparameter...178
5.5 Wirksamkeit der getesteten Antikörperfragmente ...179
5.5.1 Screeningtests ...179
5.5.2 AB28 ...180
5.5.3 Fab28 ...180
5.5.4 AB28-di-ckappa...181
5.6 Ursachen der eingeschränkten Antikörperwirksamkeit in vivo...182
5.6.1 Dosierung und Aufnahme der Antikörper ...182
5.6.2 Stabilität und Bindungsaktivität der Antikörperfragmente ...183
5.6.3 Die Rolle von Antikörpern zur Eimerienbekämpfung ...185
5.7 Schlussfolgerungen und Ausblick ...186
6 ZUSAMMENFASSUNG... 190
7 SUMMARY ... 192
8 LITERATURVERZEICHNIS... 194
9 ANHANG ... 212
9.1 zu Material und Methoden ...212
9.2 zu Ergebnisse...216
Abkürzungen
Ag Antigen
AK Antikörper
ANOVA Analysis of Variance, einfaktorielle Varianzanalyse BHK-Zellen Baby Hamster Kidney-Zellen
CD cluster of differentiation
CDR complementarity determining regions
CH konstante Region der schweren Antikörperkette CL konstante Region der leichten Antikörperkette d Tag
et al. und andere
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Fab „fragment antigen binding“, monovalentes, durch Papainverdau gewonnenes Antikörperfragment (~45 kDa), bestehend aus der leichten Antikörperkette (VL + CL), die durch eine Disulfidbrücke mit einem Teil der schweren Kette (VH + CH1) verbunden ist Fv „fragment variable“, monovalentes Antikörperfragment aus den
variablen Regionen der leichten und schweren Antikörperketten g
g
Gravitationskraft Gramm
h Stunde(n) Ig
IgA IgG IgM
Immunglobulin Immunglobulin A Immunglobulin G Immunglobulin M
IgY Immunglobulin Y
log log10, Logarithmus einer Zahl zur Basis 10 KG Körpergewicht
LT Lebenstag
mAb, mAB, mAk vollständiger bivalenter, monoklonaler Antikörper MDBK-Zellen Madin and Darby Bovine Kidney - Zellen
min Minute(n)
NK Negativkontrolle
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der statistischen Analyse der Ähnlichkeit von Datengruppen
PCR Polymerasekettenreaktion
PBS „phosphate buffered saline“ – Phosphatpufferlösung p.i. post infectionem
PK Positivkontrolle RT Raumtemperatur
scFv „single chain fragment variable“, monovalentes Antikörper- fragment (~26-29 kDa), bestehend aus den mit einem Linkerpeptid verbundenen variablen Teilen der schweren und leichten Antikörperketten (VL + VH)
SDS „sodium dodecyl sulfate“ – Natriumdodecylsulfat Sek. Sekunde(n)
VH variable Region der schweren Antikörperkette VL variable Region der leichten Antikörperkette
WAAVP World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology
w/v weight/volume – Gewicht/Volumen
z.T. zum Teil
Ø Durchmesser
1 EINLEITUNG
Die von Parasiten der Gattung Eimeria hervorgerufene Kokzidiose des Huhnes ist eine der bedeutendsten Geflügelkrankheiten weltweit. Durch den Entwicklungszyklus der Eimerien und die damit einhergehenden Schädigungen des Darmes wird bei Lege- und Zuchthennen die Legeleistung herabgesetzt, während es bei Broilern zu einer Minderung der täglichen Gewichtszunahmen kommt. Die daraus resultierenden wirtschaftlichen Schäden für die Geflügelindustrie machen eine systematische Bekämpfung dieser Krankheit im Rahmen der intensiven Geflügelhaltung unverzichtbar. Diese stützt sich bisher vor allem auf die Verabreichung von Antikokzidia als Futtermittelzusatz und auf die Impfung mittels attenuierter und nicht attenuierter Lebendvakzinen (WILLIAMS 1999; SHIRLEY et al. 2005).
Der routinemäßige Einsatz von Antikokzidia wird aufgrund von Resistenzen, neuen gesetzlichen Regelungen und der Kritik von Seiten der Verbraucher zukünftig wahrscheinlich eingeschränkt werden. Die aktive Immunisierung der Tiere stellt in der Broilermast aufgrund der zeitlich verzögert einsetzenden Wirkung oft keine ökonomisch vertretbare Alternative dar (BHOGAL et al. 1992; SHIRLEY 1992;
DANFORTH 1998; HAFEZ 2008; HAUG et al. 2008). Deshalb könnte die passive Immunisierung der Tiere durch Antikörper in Zukunft als alternative Bekämpfungsstrategie an Bedeutung gewinnen. Erfolge bei der Übertragung eines passiven Immunschutzes gegen Eimerien wurden in der Vergangenheit in Versuchen mit systemischer Verabreichung von Antiseren (LONG et al. 1963; HERLICH 1965;
ROSE 1971) und bei der Erzeugung maternaler Antikörper zum Schutz der Nachkommen verzeichnet (WALLACH et al. 1992; SMITH, N. C. et al. 1994;
WALLACH et al. 1995; WALLACH 1997). Eine weitere Methode stellt die orale Verabreichung spezifischer Antikörper zur lokalen Bekämpfung von Erregern im Darmlumen dar, die bereits erfolgreich zur Kontrolle verschiedener enteraler Infektionskrankheiten eingesetzt wird (BERGHMAN et al. 2005; HAGEMANN 2006).
Dabei liegt ein neuer Ansatz für die Bekämpfung von Eimeria tenella in der Herstellung spezifischer Antikörperfragmente mit Hilfe der rekombinanten Antikörpertechnologie in Pflanzen. Die in den Samen von Erbsenpflanzen
exprimierten Antikörper könnten dem Futter zukünftig in Form von Erbsenschrot direkt zugegeben werden, so dass sie ihre antikokzidielle Wirkung lokal im Digestionstrakt entfalten.
Ziel dieser Arbeit war es, die Wirksamkeit ausgewählter, rekombinanter Antikörperfragmente zur lokalen passiven Immunisierung gegen Eimeria tenella in vivo zu überprüfen. Dabei handelte es sich um die vier Single-chain-Fragmente AA28, AB28, AD10 und AB09, das Fab-Fragment Fab28 und einen neu entwickelten Dikappa-Body, den AB28-di-ckappa. Während der Fab28 in E. coli-Bakterien produziert wurde, konnten die übrigen Fragmente bereits durch transiente Expression in Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) und im Falle des AB28 aus einer transgenen Erbsenlinie (Pisum sativum) gewonnen werden. Die Wirksamkeit der Antikörper- fragmente gegen die infektiösen Stadien von E. tenella sollte nun mittels der Parameter der Gewichtszunahmen, Hämatokritwerte, Blutbeimengungen im Kot, Blinddarmläsionen sowie Oozystenzahlen in den Blinddärmen und im Kot der Tiere beurteilt werden. In den Screeningtests und den ausführlichen Wirksamkeitsstudien wurden die Antikörperfragmente dabei caecal, oral und über das Futter verabreicht.
Neben der Beurteilung der Antikörperwirksamkeit sollten zusätzlich Erkenntnisse über den Einfluss der gewählten Infektionsdosen und über die Wechselbeziehungen der einzelnen Untersuchungsparameter gewonnen werden.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Kokzidiose des Huhnes
Die Kokzidiose des Huhnes wird durch parasitierende Einzeller der Gattung Eimeria hervorgerufen. Durch die Besiedlung verschiedener Darmabschnitte mit infektiösen Stadien der Parasiten kommt es beim Wirt zu entzündlichen Veränderungen, zur Zerstörung von Darmzellen und zu Diarrhoe. Folgen sind Durchfallerkrankungen unterschiedlichen Schweregrades, die zur Malabsorption und damit zu einer verminderten Futterverwertung durch die Tiere führen. Während bei Zucht- und Legehennen eine reduzierte Legeleistung Gewinneinbußen für die Geflügelwirtschaft bedeutet, sind es bei Masttieren vor allem verminderte Gewichtszunahmen. Hinzu kommen hohe Kosten für den regelmäßigen Einsatz von Antikokzidia und Impfstoffen (SHIRLEY et al. 2005). Schon 1995 beliefen sich allein im Vereinigten Königreich die Kosten für Antikokzidia auf über 6 Mio. Pfund, der gesamte ökonomischen Schaden durch die Kokzidiose auf rund 40 Mio. Pfund. Obwohl der jährliche weltweite Schaden für die Geflügelwirtschaft nur schwer zu kalkulieren ist, stellt die Kokzidiose des Huhnes zweifellos eine der bedeutendsten Erkrankungen im Rahmen intensiver Geflügelhaltung dar (WILLIAMS 1999). Zu ihrer Bekämpfung könnten neue Methoden der molekularen Immunologie und Biotechnologie sowie der rekombinanten Antikörpertechnologie einen wertvollen Beitrag leisten (WALLACH et al. 1990; WÖRN 2001; STOGER et al. 2002; REFEGA et al. 2004).
2.1.1 Taxonomie und Entwicklungszyklus der Eimerien
Die Kokzidiose des Huhnes wird verursacht durch intrazellulär parasitierende Einzeller der Gattung Eimeria, welche nach dem Zoologen Theodor Eimer (1843- 1898) benannt wurde. Die aktuelle Taxonomie von Eimeria tenella ist in Tabelle 1 dargestellt (DYACHENKO 2006). Dem Unterstamm der Apikomplexa angehörend, bilden die infektiösen Sporozoiten einen so genannten Apikalkomplex aus, der aus dem Polarringkomplex, dem Konoid, subpellikulären Mikrotubuli, Mikronemen, Rhoptrien, Mikroporen sowie den dichten Granula besteht. Diese einzelnen
Organellen ermöglichen die Invasion des Parasiten in die Wirtszelle (SHIRLEY 1992;
KLOTZ 2005; SCHUBERT 2005; DYACHENKO 2006).
Tabelle 1: aktuelle Taxonomie von Eimeria tenella
Beim Huhn (Gallus gallus domesticus) sind zur Zeit sieben Eimeria-Arten bekannt, die alle ubiquitär verbreitet zu sein scheinen (WILLIAMS 1998, 1999). Die Übertragung auf den Wirt erfolgt hierbei auf dem fäkal-oralen Infektionsweg. Die Eimerien vollführen einen komplexen Lebenszyklus, der eine endogene Phase in der intestinalen Mucosa des Wirtes und eine exogene Phase in der Außenwelt umfasst (siehe Abbildung 1). Dabei findet die Vermehrung je nach Entwicklungsstadium asexuell oder sexuell statt (WALLACH 1997), wie im Folgenden kurz für Eimeria tenella beschrieben werden soll.
Mit E. tenella infizierte Hühner scheiden nach Ablauf einer Präpatenzzeit von 5-6 Tagen mit dem Kot unsporulierte Oozysten aus. Diese sind widerstandsfähige Dauerformen von einer Größe von ca. 22 x 18 µm (CHAPMAN u. SHIRLEY 2003), die innerhalb von 24 Stunden einen asexuellen Teilungsprozess in der Außenwelt durchlaufen, die Sporogonie. Die sporulierte Oozyste enthält daraufhin vier Sporozysten mit jeweils zwei Sporozoiten.
Nachdem die sporulierte Oozyste von einem Huhn oral aufgenommen wurde, wird sie in dessen Muskelmagen mechanisch und enzymatisch aufgeschlossen. Die Freisetzung der Sporozoiten aus den Sporozysten geschieht erst im Dünndarm unter dem Einfluss von Wärme, CO2 und Gallensäuren (ECKERT et al. 2005; SCHUBERT 2005).
Stamm ALVEOLATA
Unterstamm APICOMPLEXA
Klasse COCCIDEA
Ordnung EIMERIIDA
Familie EIMERIIDAE
Gattung EIMERIA
Art E. tenella
Abbildung 1: Entwicklungszyklus von Eimeria tenella, modifiziert nach LUCIUS und LOOS-FRANK (2008)
Nach der Exzystation invadieren die Sporozoiten von Eimeria tenella zunächst Epithelzellen an den Zottenspitzen im mittleren Teil der Blinddärme, wo sie eine parasitophore Vakuole ausbilden. Abgesehen von den Organellen des Apikalkomplexes (siehe oben) besitzen E. tenella-Sporozoiten Oberflächenantigene, die durch einen Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-Anker angekoppelt sind und in die Gruppen A (EtSAG 1-12) und B (EtSAG 13-23) eingeteilt werden können (TABARES et al. 2004). Nach der Invasion der Sporozoiten findet eine Migration durch das Bindegewebe der Zotten statt, wobei noch kontrovers diskutiert wird, ob dazu
Sporozoit
Merogonie I-III in der Blinddarmmucosa
Gamogonie in der Blinddarmmucosa Makrogamet
Mikrogamet
Zygote Sporont
Sporogonie in der Außenwelt
Aufnahme der sporulierten Oozyste durch das Huhn
Merozoit
Ausscheidung der
unsporulierten Oozyste
ausschließlich intraepitheliale Lymphozyten als Transportvehikel genutzt werden oder ob die Sporozoiten auch unabhängig wandern (DASZAK 1999).
In den Kryptenepithelzellen der Blinddarmmucosa findet die erste Merogonie, eine besondere Form der Schizogonie, statt, bei der durch viele Kernteilungen und nachfolgende Differenzierung des Zytoplasmas Merozoiten entstehen, die weitere Epithelzellen befallen. Die erste und zweite Generation von Meronten sind beim E. tenella-Houghton-Stamm 48 bzw. 84 Stunden post infectionem in den Caeca nachzuweisen (CHAPMAN u. SHIRLEY 2003). Junge Meronten der zweiten Generation wandern in das subepitheliale Gewebe ein und vollführen eine weitere Merogonie, bei der es zu einer massiven Zerstörung von Gewebe einschließlich seiner versorgenden Kapillaren kommt. Durch die ausgeprägten Hämorrhagien und die Malabsorption bestimmt diese Phase des Entwicklungszyklus das Krankheitsbild (KLOTZ 2005; DAUGSCHIES 2006) und kann bis zum Tod der Tiere führen. Eine dritte Merogonie, deren Meronten beim Houghton-Stamm 108 Stunden nach der Infektion erscheinen, schließt sich häufig an (CHAPMAN u. SHIRLEY 2003). Die Anzahl der insgesamt durchgeführten Merogonien variiert allerdings bei den verschiedenen Eimerienspezies: Bei Eimeria tenella umfasst der Entwicklungszyklus in der Regel drei Merogonien, wobei die einzelnen Parasitenstadien sich oft asynchron entwickeln (MCDONALD u. ROSE 1987).
Die endogene Entwicklung der Eimerien schließt mit der sexuellen Vermehrung in den Epithelzellen der Caeca ab: Die Mehrzahl der Merozoiten entwickelt sich zu einkernigen, großen Makrogameten, während wenige Merozoiten zu Mikrogamonten werden, die sich wiederum in viele begeißelte Mikrogameten teilen. Bei der Syngamie eines Mikrogameten mit einem Makrogameten entsteht dann eine Zygote, das einzige diploide Stadium der Eimerien. Damit bietet diese Entwicklungsphase die Möglichkeit der genetischen Rekombination, die bei der Anpassung des Parasiten an seine Umgebung und bei der Entstehung von Arzneimittelresistenzen eine entscheidende Rolle spielt (BLAKE et al. 2006b). Die ersten Gametozyten erscheinen beim Houghton-Stamm 114 Stunden p.i., die ersten unsporulierten Oozysten werden 132 Stunden p.i. ausgeschieden (CHAPMAN u. SHIRLEY 2003).
Innerhalb einer widerstandfähigen Oozystenhülle entwickelt sich die Zygote zum Sporonten weiter, so dass von Neuem die asexuelle Entwicklung mit einem meiotischen Teilungsprozess beginnen kann: Da die Sporogonie in der Außenwelt stattfindet, bleibt sie unabhängig vom Selektionsdruck, der sich durch das Immunsystem des Wirtes und Chemotherapie aufbaut (BLAKE et al. 2006b).
2.1.2 Epidemiologie: Spezifität und Tenazität der Eimerien
Die einzelligen Parasiten der Gattung Eimeria sind hochgradig wirtsspezifisch (SHIRLEY 1992; YUN u. LILLEHOJ 2000). Beim Huhn sind zurzeit sieben verschiedene Spezies als valide anerkannt, die sich in ihrer Pathogenität unterscheiden und verschiedene Abschnitte des Digestionstrakts besiedeln (siehe Tabelle 2). Aufgrund der unterschiedlich ausgeprägten Organspezifität, können einige Eimerienspezies ihre Entwicklung in mehreren Darmabschnitten vollziehen, während andere nur einen Darmabschnitt besiedeln (AUGUSTINE 1999; HAFEZ 2008).
Tabelle 2: Eimerienspezies des Huhnes, modifiziert nach DAUGSCHIES (2006) und nach Pathogenität absteigend geordnet
Die Spezies Eimeria tenella ist in ihrem Entwicklungszyklus auf die Blinddärme des Huhnes beschränkt. Andere beim Huhn auftretende Spezies, wie z.B. E. acervulina und E. maxima, können, wenn Sporozoiten dieser Spezies ins Caecum injiziert werden, dort keinen vollständigen Entwicklungszyklus durchlaufen (HORTON-SMITH u. LONG 1966). Daher kann die Organspezifität der Parasiten bei ihrer Vermehrung
Spezies Mortalität Morbidität Lokalisation
E. necatrix +++ +++ mittleres Jejunum
E. tenella +++ +++ Caeca
E. maxima ++ +++ mittleres Jejunum
E. brunetti ++ ++ Ileum, Caeca, Rectum
E. acervulina + +++ Duodenum, proximales Jejunum
E. mitis + + distales Jejunum, Ileum
E. praecox - - Duodenum, proximales Jejunum
zur Reinerhaltung der Stämme genutzt werden: Um Verunreinigungen mit anderen Eimerienspezies weitgehend zu vermeiden, werden Eimeria tenella-Oozysten direkt aus dem Blinddarminhalt- und Gewebe und nicht aus den Fäzes isoliert (SHIRLEY 1995).
Die Tatsache, dass die verschiedenen Eimerienspezies bei Vögeln auf die Zellen eines spezifischen Darmabschnittes begrenzt sind, lässt vermuten, dass bestimmte, einzigartige Voraussetzungen erfüllt sein müssen, um eine erfolgreiche Invasion zu ermöglichen. Die Gründe, weshalb Sporozoiten der Gattung Eimeria spezifische Darmabschnitte und Zelltypen zumindest in vivo bevorzugen, sind jedoch noch nicht eindeutig geklärt (AUGUSTINE 2001). Auch ist die Organspezifität von E. tenella nicht als absolut zu betrachten. Zu Ausnahmen kommt es nicht nur in vitro, sondern auch unter natürlichen Bedingungen, wie schon 1969 von LEATHEM belegt wurde:
Die späten Stadien des Entwicklungszyklus, Meronten der zweiten Generation und Gametozyten, wurden nicht nur in den Blinddärmen, sondern auch in Dünn- und Dickdarmgewebe histologisch nachgewiesen. Eine Besiedlung dieser Darmabschnitte mit frühen Stadien des Parasiten fand jedoch nur unter experimentellen Bedingungen bei vorheriger chirurgischer Entfernung der Caeca statt. Waren die Blinddärme als bevorzugter Entwicklungsort dieser Eimerienspezies nicht vorhanden, konnte ein vollständiger endogener Entwicklungszyklus auch in Dünn- und Dickdarm vollzogen werden.
Die Verbreitung von Eimerien und das Auftreten klinischer Erkrankungen in Geflügelhaltungen sind von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Auf der einen Seite ist die hohe Tenazität der Eimerien selbst ein wesentlicher Faktor. Denn sporulierte Oozysten bleiben als Dauerstadien über mehrere Monate hinweg bis zu einem Jahr infektiös und erweisen sich als sehr widerstandsfähig gegenüber chemischer Desinfektion (SCHUBERT 2005; DAUGSCHIES 2006; HAFEZ 2008).
Auf der anderen Seite spielen die Haltungsbedingungen beim Geflügel in Form von Hygiene- und Managementfaktoren eine wesentliche Rolle: Je höher die Feuchtigkeit in der Einstreu und je näher die Temperatur an einem optimalen Bereich von 28-32 °C liegt, desto günstiger sind die Sporulationsbedingungen für den Parasiten und desto stärker wird der Infektionsdruck für den Wirt (ECKERT et al.
2005; DAUGSCHIES 2006; HAFEZ 2008). Darüber hinaus zeigen sich Einflüsse der Haltungsdichte und der Altersstruktur der Tiere. In extensiven Geflügelhaltungen mit gemischtaltrigen Tiergruppen stellt sich in der Regel ein enzootisches Gleichgewicht ein, bei dem neu eingestallte Tiere nach Durchlaufen einer moderaten natürlichen Infektion einen belastbaren Immunschutz gegen Reinfektionen aufbauen. Werden jedoch z.B. im Rahmen der intensiven Broilermast große Gruppen gleichaltriger, empfänglicher Tiere auf engem Raum gehalten, können schwere Krankheitsverläufe mit einer hohen Mortalität auftreten (KLOTZ 2005; SHIRLEY et al. 2005). In der Bodenhaltung muss darüber hinaus davon ausgegangen werden, dass auch im Falle einer sorgfältiger Reinigung und Desinfektion eine initiale Kontamination der Ställe mit einigen Oozysten immer vorliegt (DAUGSCHIES 2006). Deshalb kommt der Bekämpfung von Eimerieninfektionen vom ersten Lebenstag der Tiere an große Bedeutung zu, wobei der Einsatz von Antikokzidia sowie die aktive und die passive Immunisierung der Hühner unterschiedliche Strategien darstellen.
2.1.3 Erscheinungsformen der Kokzidiose und Bekämpfungsmethoden
Eimeria tenella-Infektionen manifestieren sich in der intensiven Geflügelhaltung in unterschiedlicher Form: Bei der klinischen Kokzidiose treten eine hohe Morbidität und Mortalität, Diarrhoe und blutige Fäzes als deutliche Krankheitsanzeichen auf.
Durch Verbesserungen in der Geflügelhaltung und der Tierernährung sowie durch den regelmäßigen Einsatz von Antikokzidia sind klinische Ausbrüche der Kokzidiose in den letzten Jahren jedoch eher selten geworden. Bei der subklinischen Kokzidiose dominieren hingegen reduzierte Gewichtszunahmen und eine verminderte Futterverwertung das Infektionsgeschehen, so dass die Leistung der Tiere zurückgeht und finanzielle Einbußen für die Geflügelindustrie entstehen. Diese Form der Kokzidiose ist sehr häufig und stellt eine der bedeutendsten Geflügelerkrankungen weltweit dar. Im Gegensatz dazu sind bei Eimerieninfektionen mit sehr geringen Oozystenzahlen teilweise gar keine negativen Effekte auf die Gesundheit und die Leistung der Tiere zu beobachten. Durch die Ausbildung einer (partiellen) Immunität haben solch milde Infektionen sogar positive Auswirkungen auf die Widerstandsfähigkeit der Tiere (SALISCH et al. 1989; WILLIAMS 1999; HAUG et
al. 2008). Die Balance zwischen der Entstehung einer subklinischen Kokzidiose mit Leistungsrückgang und einer milden Infektion zur Ausbildung einer belastbaren Immunität ist jedoch schwer zu halten: Beispielsweise birgt die Verabreichung nur wenig effektiver Arzneimittel oder effektiver Antikokzidia in suboptimalen Dosen stets das Risiko eines verlustreichen Kokzidioseausbruchs, und auch der Verzicht auf Chemotherapeutika mit dem Ziel einer Durchseuchung des Bestandes kann beim Versagen der notwendigen Hygiene- und Managementmaßnahmen schwerwiegende Folgen haben (SHIRLEY et al. 2005).
Unter den gegebenen Umständen der intensiven Geflügelhaltung durchläuft jedes Huhn während seines Lebens mindestens eine Eimerieninfektion, so dass eine wirksame Prophylaxe unumgänglich erscheint. Diese stützt sich bei Broilern derzeit auf eine kontinuierliche, prophylaktische Verabreichung von Antikokzidia über das Futter (HAUG et al. 2008). Die zugelassenen Präparate müssen jedoch unter Einhaltung der vorgeschriebenen Wartezeiten einige Tage vor der Schlachtung abgesetzt werden. Verwendung finden Antikokzidia aus unterschiedlichen Wirkstoffgruppen, wie z.B. Diclazuril als Triazinderivat und Salinomycin aus der Gruppe der ionophoren Polyäther-Antibiotika, die seit den 1970er Jahren die medikamentelle Kokzidiosebekämpfung dominieren. Trotz ihres Einsatzes in verschiedenen Rotations- und Shuttle-Systemen breiten sich allerdings Resistenzen von Eimerien gegenüber einzelnen oder mehreren antikokzidiellen Wirkstoffen immer mehr aus, so dass eine ständige, kostenintensive Weiterentwicklung der Antikokzidia erforderlich ist (CRANE et al. 1991; SHIRLEY 1992; CHAPMAN 1998; KLOTZ 2005).
Während beispielsweise zur Entwicklung einer Resistenz gegenüber Chinolonen eine einzige Passage des Parasiten ausreicht, entwickelt sich eine Resistenz gegenüber Ionophoren erst nach einigen Eimeria-Entwicklungszyklen, da wahrscheinlich mehrere Mutationen des Parasiten notwendig sind (BLAKE et al.
2006b). Neben der Resistenzentwicklung limitieren weiterhin die Gesetzgebung und die wachsende Sorge des Verbrauchers vor Arzneimittelrückständen den Einsatz von Arzneimitteln beim Huhn als lebensmittellieferndes Tier (SHIRLEY 1992; HAFEZ 2008; HAUG et al. 2008). So sollen auf Basis der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 Kokzidiostatika, „Stoffe zur Abtötung oder Wachstumshemmung von Protozoen“, ab
dem Jahr 2012 nicht mehr als Futtermittelzusatzstoffe verwendet werden. Die Zulassungen der entsprechenden Präparate wurden auf 10 Jahre begrenzt, so dass die Auswahl an verfügbaren Wirkstoffen weiter eingeschränkt wird und in absehbarer Zeit alternative Strategien zur Bekämpfung der Kokzidiose verfolgt werden müssen.
Eine Möglichkeit zur wirksamen Bekämpfung von Eimerieninfektionen stellt die Immunisierung der Tiere dar. Während sich eine passive Immunisierung mittels Antikörpern noch in der experimentellen Phase befindet (siehe 2.3.3), sind verschiedene Vakzinen zur aktiven Immunisierung von Geflügel gegen Eimerien bereits im Handel erhältlich und in weltweitem Einsatz. Die ersten Vakzinen gegen die Kokzidiose des Huhnes wurden aus Wildtypisolaten hergestellt und kamen schon vor über 50 Jahren auf den Markt. Allerdings bestand damals noch eine relativ hohe Gefahr von Krankheitsausbrüchen durch die Impfstämme (SHIRLEY et al. 2005).
Heute gehören zur Gruppe der konventionellen Kokzidienimpfstoffe nicht attenuierte und attenuierte Lebendvakzinen. Eine Impfung mit Lebendvakzinen bietet dabei die Vorteile, dass eine einmalige Vakzinierung zur Ausbildung einer protektiven Immunität ausreicht und dass die Vermehrung der Erreger in mehreren Entwicklungszyklen und die daraus resultierenden Reinfektionen zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen (CRANE et al. 1991; LILLEHOJ u.
LILLEHOJ 2000; SHAMS 2005).
Bei den nicht attenuierten Lebendvakzinen, wie z.B. Immucox® und Coccivac®, die ein Gemisch von Eimerienoozysten unterschiedlicher Spezies und Pathogenität enthalten, besteht weiterhin die Gefahr von Kokzidioseausbrüchen. Die Balance zwischen einer ausreichend hohen Infektionsdosis zur Induktion einer starken Immunantwort und einer zu hohen Pathogenität der Parasitenstadien einzelner enthaltener Spezies ist nur schwer zu halten (LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000;
SHIRLEY et al. 2005). Deshalb schritt die Entwicklung dieser nicht attenuierten Vakzinen weiter fort und neue Produkte, wie z.B. Nobilis CoxATM®, ADVENT® und Inovocox® sind seit Kurzem auf dem Markt (HAFEZ 2008). Im Vergleich dazu haben sich attenuierte Lebendvakzinen, wie z.B. Livacox® und die einzigen derzeit in Deutschland beim Huhn zugelassenen Eimerienimpfstoffe Paracox 5® und Paracox 8®, als besonders sicher und effizient erwiesen. Durch mehrfache Passagierung
wurden im Zuge der Herstellung frühreife Eimerien mit verkürztem Lebenszyklus und niedrigem Reproduktionspotenzial selektiert, die genetisch stabil sind und eine hohe Immunogenität besitzen, ohne dass es zu Reversionen kommt (LILLEHOJ u.
LILLEHOJ 2000; SHIRLEY et al. 2005; HAFEZ 2008).
Die Anwendung von Lebendvakzinen hat sich in Deutschland bislang vor allem in der Haltung von Zuchttieren und Legehennen durchgesetzt. Bezogen auf die Lebensdauer der Tiere ist eine Vakzinierung hier rentabel. Außerdem ist die Immunität der Tiere gegen Eimerieninfektionen während der Legeperiode wichtig, da in diesem Zeitraum keine Kokzidiostatika mehr angewendet werden dürfen (SHIRLEY et al. 2005). Bei Broilern hingegen ist die aktive Immunisierung aufgrund des höheren Kostenaufwands im Vergleich zur Verabreichung von Kokzidiostatika noch wenig verbreitet. Etwa 12 % der in Europa kommerziell produzierten Broiler werden allein durch aktive Immunisierung vor Kokzidieninfektionen geschützt (HAFEZ 2008). Durch die Impfung mit einer nicht attenuierten Lebendvakzine kann es, wie Versuche mit Immucox® zeigen (DANFORTH 1998), allerdings zu einem initialen Rückgang der Gewichtszunahmen - wahrscheinlich aufgrund des Entwicklungszyklus des Parasiten - kommen. Dass dieser durch die Tiere erst nach etwa vier Wochen wieder aufgeholt wird, ist insbesondere für die Kurzmast (32-34 Tage) von Nachteil. Die kombinierte Anwendung von Antikokzidia mit einem Impfstoff, der antikokzidia-resistente Eimerienstämme enthält, kann hier eine Lösung darstellen (DANFORTH 1998). Mit Lebendimpfstoffen immunisierte Tiere scheiden weiterhin Oozysten aus, so dass es zu deren Anreicherung im Stall kommen kann.
Dadurch können behandlungsresistente Parasitenstämme von den Impfstämmen verdrängt und deren Ausscheidung deutlich vermindert werden (HAFEZ 2008).
Trotzdem auftretende Feldinfektionen mit entsprechend geringen Oozystenzahlen sind sogar erwünscht, weil sie die Immunität der Tiere gegenüber diesen lokal vorhandenen Stämmen aufrechterhalten (SHIRLEY et al. 2005). Einen Nachteil des Einsatzes von Lebendimpfstoffen stellt der hohe Kostenaufwand für deren Produktion dar: Die Herstellung ist vor allem deshalb sehr teuer, weil die Impfstoffe Oozysten verschiedener Eimerienspezies enthalten müssen, die in ausreichender Zahl nur durch in ovo-Kultivierung oder durch Passagierung im Huhn gewonnen
werden können (KLOTZ 2005). Durch die hohe immunologische Diversität der einzelnen Stämme einer Eimerienspezies und deren unterschiedliche geographische Verteilung kann durch die produzierten Vakzinen eine protektive Immunität aller geimpften Tiere gegenüber Feldinfektionen dennoch nicht garantiert werden (DANFORTH 1998; JENKINS 1998; SHIRLEY et al. 2005).
Diesen Problemen versucht man durch die Entwicklung einer Generation neuartiger Impfstoffe zu begegnen, zu denen Subunit-, DNA-, und Vektor-Vakzinen sowie rekombinante Impfstoffe gehören (SHAMS 2005). Als Subunit-Vakzine wurde z.B.
kürzlich CoxAbic®, ein auf einem Gametozytenantigen von E. maxima basierender Impfstoff zur Immunisierung von Elterntieren, in den Handel gebracht (HAFEZ 2008).
DNA-Vakzinen bieten wiederum die Vorteile, dass sie sehr stabil sind, nicht gekühlt werden müssen und sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort induzieren. Die rekombinante DNA-Technologie eröffnet dabei theoretisch die Möglichkeit zu einer effektiven Expression immunodominanter Antigene (KLOTZ 2005; SHAMS 2005). Allerdings stellt die Identifizierung geeigneter Antigene zur Induktion einer protektiven Immunität gegenüber verschiedenen Entwicklungs- stadien, Stämmen und Spezies bei Eimerieninfektionen eine kritische Hürde dar (JENKINS 1998; LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; SHIRLEY et al. 2005), die zur Entwicklung neuartiger Vakzinen überwunden werden muss. Deshalb sollte eine wirksame rekombinante Eimerienvakzine z.B. Antigene aus verschiedenen Entwicklungsphasen des Parasiten beinhalten, wobei hier besonders die an der Invasion beteiligten Antigene der frühen Entwicklungsstadien im Mittelpunkt der Forschung stehen: Dazu gehören Proteine des Apikalkomplexes und Oberflächenproteine, die direkt mit der Wirtszelle interagieren (JENKINS 1998;
LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; KLOTZ 2005). Mit Hilfe fünf neu charakterisierter, monoklonaler Antikörper ist es beispielsweise CONSTANTINOIU et al. (2003) gelungen, Antigenepitope des Apikalkomplexes verschiedener Eimerienspezies des Huhnes zu identifizieren. Einige dieser Epitope waren bei mehreren Spezies vorhanden, und einer der eingesetzten monoklonalen Antikörper (mab 8E-1) konnte sogar an die Sporozoiten aller beim Huhn bekannten Eimerienspezies binden. Die beschriebenen Antigene stellen somit Kandidaten für eine rekombinante Vakzine dar,
die eine Kreuzimmunität gegen mehrere Eimerienspezies auslösen könnte. Auch das Antigen GX3262 konnte bei Immunisierungsversuchen eine Kreuzimmunität der Hühner gegen Parasiten der Spezies Eimeria tenella und Eimeria acervulina hervorrufen, so dass infizierte, immunisierte Tiere weniger Darmläsionen ausbildeten als nicht immunisierte Kontrolltiere (BHOGAL et al. 1992). Ebenso führte eine Immunisierung von Hühnern mit dem in E. coli exprimierten Fusionsprotein CheY- SO7’, das auf einem Antigen von E. tenella basiert, zu einer Kreuzimmunität gegen die heterologen Spezies E. acervulina, E. maxima und E. necatrix (CRANE et al.
1991). Die genannten Beispiele legen nahe, dass die Entwicklung einer wirksamen, monovalenten Vakzine gegen mehrere Eimerienspezies nicht unmöglich ist.
Andererseits haben Immunisierungsversuche mit einzelnen Antigenen bisher gezeigt, dass viele von diesen nur zur Ausbildung einer partiellen Immunität gegenüber den zugehörigen homologen und/oder heterologen Spezies führten (CRANE et al. 1991; BHOGAL et al. 1992; LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; SHIRLEY et al. 2005). Beispielsweise applizierten KIM et al. (1989) Hühnern per os einen E. coli-Stamm als Vektorvakzine: Dieser enthielt ein Plasmid zur Codierung eines E. acervulina-Oberflächenantigens, das auf diese Weise dem Immunsystem des Wirts präsentiert wurde. Die Tiere bildeten jedoch nur eine partielle Immunität aus, die bei einer Belastungsinfektion zur Reduzierung der Oozystenausscheidung um etwa 50 % führte. Das Erreichen solch einer partiellen Immunität durch neuartige Vakzinen kann allerdings bisher nicht mit dem Schutz konkurrieren, der durch eine Immunisierung mittels Lebendvakzinen oder die Anwendung von Antikokzidia beim Broiler gewährleistet wird.
Für die Broilermast gibt es somit zwar interessante neue Forschungsansätze zur Kokzidienbekämpfung, jedoch noch keine konkurrenzfähigen Alternativen zum Einsatz von Antikokzidia. Neben der Weiterentwicklung der aktiven Immunisierung mittels Lebendvakzinen oder rekombinanten Impfstoffen könnte sich in Zukunft auch die lokale passive Immunisierung zu einer solchen alternativen Bekämpfungsstrategie entwickeln, wie im folgenden Kapitel erläutert werden wird.
2.2 Immunität gegenüber Eimerien
Der komplexe Entwicklungszyklus der Eimerien ruft eine ebenso komplexe Immunantwort von Seiten des infizierten Wirtes hervor. Allgemein sind die Empfänglichkeit gegenüber Kokzidieninfektionen und die Entwicklung einer protektiven Immunität von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, zu denen einerseits die Genetik, das Alter und die Immunkompetenz des Wirtes sowie andererseits die Eimerienspezies, die Inokulationsdosis und die Virulenzfaktoren des Parasiten gehören (LILLEHOJ u. RUFF 1987; LILLEHOJ 1988; SHIRLEY et al. 2005).
In Bezug auf die Genetik des Wirtes ließen sich schon im Mausmodell unterschiedliche Mäusestämme als besonders empfänglich bzw. resistent gegenüber Infektionen mit E. vermiformis klassifizieren, wobei Unterschiede in der Länge der Patenzzeit und in der Höhe der Oozystenausscheidung nur bei Primärinfektionen auftraten (ROSE et al. 1984). Verschiedene Hühnerlinien zeigten in Infektionsversuchen mit den sieben beim Huhn bekannten Eimerienspezies deutlich variierende Muster der Oozystenausscheidung und eine unterschiedlich hohe Gesamtausscheidung an Oozysten (BUMSTEAD u. MILLARD 1992; YUN u. CHOI 2000). Gerade bei Untersuchungen zur Entwicklung der Immunität gegenüber verschiedenen Stämmen einer Eimerienspezies unterschieden sich einzelne Hühnerlinien in der Oozystenproduktion erheblich (SMITH, ADRIAN L. et al. 2002).
Die Eimerienspezies beeinflusst die Reaktionen des Immunsystems in hohem Maße: Hierbei besteht unter Wissenschaftlern weitgehende Einigkeit, dass eine erworbene, vollständig protektive Immunität nur gegenüber derjenigen Spezies erreicht wird, mit der bereits eine immunologische Auseinandersetzung in Form einer Primärinfektion stattgefunden hat (ROSE 1971). Außerdem rufen die einzelnen Eimerienspezies verschiedene Immunreaktionen hervor, so dass eine Kreuz- immunität kaum entstehen kann (JENKINS 1998), besonders weil nur wenige kreuzreaktive Epitope bei den einzelnen Spezies konserviert sind (SHIRLEY et al.
2005). Schon 1971 (ROSE) stellte sich heraus, dass auch der schützende Effekt des Serums immunisierter Tiere nur gegenüber der zur Immunisierung eingesetzten Eimerienart besteht.
Durch aktive Immunisierung kann ebenfalls ein vollständiger Schutz gegenüber einer homologen Belastungsinfektion ausgebildet werden, so dass die Oozystenproduktion der Tiere unterbunden wird. Gegenüber heterologen Eimerieninfektionen wird dagegen ein solch umfassender Schutz nicht ausgebildet (BLAKE et al. 2005).
Allerdings gibt es in Bezug auf die mögliche Ausbildung einer Kreuzimmunität gegenüber mehreren Eimerienspezies einige Untersuchungen (DANFORTH u.
AUGUSTINE 1983; AUGUSTINE 2001), bei denen Antikörperreaktionen mit Epitopen zu beobachten waren, die während der Evolution der Eimerien offenbar bei verschiedenen Spezies konserviert wurden (siehe auch 2.3.3).
Nach den beteiligten Strukturen und Mechanismen des Immunsystems lässt sich bei Eimerieninfektionen sowohl zwischen einer angeborenen und einer erworbenen Immunität als auch zwischen unspezifischen und antigen-spezifischen Immunmechanismen unterscheiden (PLACHY et al. 2003; SHIRLEY et al. 2005).
Durch unterschiedliche Beteiligung dieser einzelnen Anteile differiert wiederum die Immunantwort bei einer Primärinfektion mit Eimerien von der Immunantwort, die bei Reinfektionen ausgelöst wird. Im Folgenden soll ein kurzer Überblick zu einigen wichtigen Aspekten der Immunitätsbildung bei Eimerieninfektionen gegeben werden, wobei ein großer Teil der aufgeführten Erkenntnisse aus Untersuchungen am Mausmodell stammt.
2.2.1 Zelluläre Immunität
Der zellulären Immunabwehr durch T-Lymphozyten kommt bei der Bekämpfung von Kokzidieninfektionen eine herausragende Bedeutung zu (LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; YUN u. LILLEHOJ 2000; SHIRLEY et al. 2005). Um die Rolle der einzelnen T- Zellpopulationen näher zu beleuchten, wurden zahlreiche Studien durchgeführt, bei denen entweder immunsuppressive Wirkstoffe, wie z.B. Cyclosporin A, die T-Zellen hemmten oder eine Depletion bestimmter T-Zell-Subpopulationen mittels spezifischer Antikörper durchgeführt wurde. Dabei erhöhte vor einer Primärinfektion appliziertes Cyclosporin A die Empfänglichkeit der Hühner für E. tenella signifikant. Eine Suppression der T-Zellen während einer Reinfektion führte sogar zum völligen Erliegen des protektiven Immunschutzes (LILLEHOJ 1987; LILLEHOJ u. LILLEHOJ
2000). Durch diese Ergebnisse wird die Bedeutung von T-Lymphozyten sowohl bei Primär- als auch bei Reinfektionen mit Eimerien unterstrichen. Intestinale- intraepitheliale Lymphozyten (IEL) tragen beim Huhn CD3-, CD4- und CD8-Antigene, die mit denen von Mäusen und Menschen vergleichbar sind. Dabei ist phänotypisch eine Unterteilung der Lymphozyten in CD4+- und CD8+-Subpopulationen möglich (CHAN et al. 1988; YUN u. LILLEHOJ 2000). Bei der lokalen Abwehr von Eimerien im Darm scheinen beide Subpopulationen beteiligt zu sein: CD4+-Zellen treten insbesondere bei Primärinfektionen vermehrt auf und kontrollieren diese maßgeblich.
Denn eine Depletion von CD4+-Zellen zieht z.B. bei Primärinfektionen mit E. tenella eine Steigerung der Oozystenausscheidung nach sich. Die Entwicklung einer protektiven Immunität gegenüber Reinfektionen wird durch einen Mangel an CD4+- Lymphozyten jedoch nicht beeinträchtigt (ROSE et al. 1992; TROUT u. LILLEHOJ 1996). Die Subpopulation der CD8+-Lymphozyten ist dagegen vor allem an der Abwehr von Reinfektionen beteiligt. Ihre Depletion führt bei Mäusen zu einer Erhöhung der Oozystenzahlen bei einer Reinfektion (ROSE et al. 1992). Außerdem wurden CD8+-Lymphozyten in direktem Kontakt mit Eimerien-infizierten Epithelzellen gesehen, so dass ihnen eine cytotoxische Effektorfunktion zugesprochen wird (LILLEHOJ u. TROUT 1994). Diese erworbene, antigen-spezifische Immunität gegenüber Eimerien ist lang anhaltend, wobei stets eine Reziprozität zwischen dem jeweiligen Immunstatus des Huhnes und seiner Oozystenausscheidung besteht (WILLIAMS 1998; SHIRLEY et al. 2005).
Neben der spezifischen Abwehr durch T-Lymphozyten sind auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen als Teil der angeborenen Immunabwehr an der Bekämpfung von Eimerieninfektionen beteiligt (LILLEHOJ u. TROUT 1994).
NK-Zellen stellen eine Subpopulation von Lymphozyten dar, deren Cytotoxizität nicht an die Präsentation spezifischer Antigene gebunden ist. Ihre vermehrte Aktivität im Darmepithel und in den Lymphknoten von Tieren mit Eimerieninfektionen spricht für ihre Beteiligung an der Elimination der Parasiten im Zuge von Primärinfektionen (LILLEHOJ 1989; SMITH, A. L. u. WAKELIN 1994). Während eine Depletion der NK- Zellen im Mausmodell bei Infektionen mit E. vermiformis keinen deutlichen Einfluss auf den Verlauf der Infektion nahm (SMITH, A. L. u. WAKELIN 1994), führte diese
bei Infektionsversuchen mit E. papillata zu einer erheblichen Steigerung der Oozystenausscheidung durch die Tiere (SCHITO u. BARTA 1997). Der inhibitorische Effekt, den NK-Zellen bei Primärinfektionen ausüben, scheint dabei an deren Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) gekoppelt zu sein. Dieses Lymphokin ist ein wichtiger immunmodulierender Mediator bei Eimerieninfektionen (LAURENT et al.
2001; SHIRLEY et al. 2005). Nach Primärinfektionen mit E. tenella konnte eine signifikant erhöhte IFN-γ-Expression in Lymphozyten der Caecaltonsillen und des Darmepithels nachgewiesen werden (YUN u. CHOI 2000). LAURENT et al. (2001) stellten sogar eine 300-fach erhöhte Expression von IFN-γ bei Eimerieninfektionen fest, wobei die Menge an IFN-γ-codierender messenger-RNA allein in intraepithelialen CD3+-Lymphozyten um ein 27-faches erhöht war. Im Mausmodell wurde eine Inhibition von Eimeria-Sporozoiten durch IFN-γ bereits bewiesen, weil sowohl die Invasion der Sporozoiten als auch deren intrazelluläre Weiterentwicklung gehemmt wurden. Diese Hemmung war von der IFN-γ-Dosis und der Dauer der Vorinkubation des Lymphokins mit den Darmepithelzellen abhängig (ROSE et al.
1991). Auch bei der Immunantwort gegenüber Eimerieninfektionen des Huhnes wird ein inhibitorischer Effekt von IFN-γ postuliert (LILLEHOJ u. TROUT 1994; PINARD- VAN DER LAAN et al. 2003; LILLEHOJ et al. 2004).
2.2.2 Humorale Immunität
Antikörper werden als Anteil der humoralen Immunität des Huhnes von B-Zellen produziert und unterliegen einem Selektions- und Diversifikationsprozess in der Bursa Fabricii (PLACHY et al. 2003). Zu ihren vielfältigen Aufgaben gehört es, die Anhaftung und Invasion von Pathogenen zu unterbinden, das Komplementsystem zu aktivieren sowie die Phagocytose und Cytotoxizität durch zelluläre Anteile des Immunsystems zu initiieren. Weiterhin können sie Mikroorganismen agglutinieren und hemmend auf deren Motilität, Stoffwechsel und Wachstum einwirken (LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; BERGHMAN et al. 2005). Als Antikörperklassen sind beim Huhn zurzeit IgM, IgA und IgY anerkannt (SHARMA 1997; YEGANI u. KORVER 2007): Während im Serum von Hühnern Antikörper aller drei großen Klassen zu finden sind (TREES et al. 1985), dominieren in intestinalen Sekretionsprodukten vor
allem IgA und IgM als sekretorische Immunglobuline (LILLEHOJ u. TROUT 1996).
Das IgY des Huhnes wird in der älteren Literatur häufig noch als IgG bezeichnet. Es unterscheidet sich vom IgG der Säugetiere jedoch sowohl strukturell, da seine schwere Kette z.B. ein höheres Molekulargewicht besitzt, als auch funktionell, weil es beim Vogel nicht nur der wichtigste Serumantikörper zur Bekämpfung systemischer Infektionen ist, sondern auch anaphylaktische Reaktionen herbeiführen kann.
Deshalb wird das IgY von Vögeln, Reptilien und Amphibien als evolutionärer Vorläufer des IgG und IgE von Säugetieren betrachtet (WARR et al. 1995;
CAMENISCH et al. 1999).
Von den 1970er Jahren bis heute wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um die Bedeutung der humoralen Immunität durch Antikörper bei den Eimerieninfektionen des Huhnes aufzuklären. Zur Methodik der Untersuchung des humoralen Immunsystems und der Wirksamkeitsprüfung von Antikörpern nennt CASADEVALL (2004) folgende Kriterien:
1. Die Empfänglichkeit für die untersuchte Infektion muss bei Defiziten der humoralen Abwehr steigen.
2. Es muss eine positive Korrelation zwischen der Anwesenheit spezifischer Antikörper und der Resistenz gegenüber der entsprechenden Infektion bestehen.
3. Verabreichte Seren oder Antikörper müssen einen empfänglichen Wirt vor der betreffenden Infektion schützen.
Aus Versuchen mit hormonell bursektomierten Küken geht hervor, auf welche Weise sich Defizite des humoralen Abwehrsystems auf den Verlauf von primären und sekundären Eimerieninfektionen auswirken: Wie erwartet waren die B-Zellfunktion und der Immunglobulinspiegel dieser Tiere deutlich verringert bzw. nicht vorhanden.
Bei Infektionen mit E. maxima waren die klinischen Symptome der Hühner im Vergleich zu nicht bursektomierten Kontrolltieren ausgeprägter und ihre Oozystenausscheidung um ein Anderthalb- bis Zweifaches erhöht (ROSE u.
HESKETH 1979). Bei Primär- und Reinfektionen mit E. tenella wurde jedoch weder eine Verlängerung der Präpatenz oder Patenz noch eine Erhöhung der
Oozystenausscheidung - verglichen mit nicht bursektomierten Kontrolltieren - beobachtet. Allerdings war die Mortalität in der bursektomierten Versuchsgruppe deutlich erhöht (LILLEHOJ 1987). Die Resistenz der bursektomierten Hühner gegenüber Reinfektionen mit den beiden Eimerienspezies war dagegen gar nicht oder nur in geringem Maße vermindert, so dass der Einfluss von Antikörpern besonders bei der Bekämpfung von primären Eimerieninfektionen gegeben scheint (ROSE u. HESKETH 1979; LILLEHOJ 1987).
Nach einer Infektion mit Eimeria tenella erreichen Antikörper der IgY-Klasse die höchsten Antikörpertiter im Serum der Hühner, gefolgt von IgM und IgA (TREES et al. 1985). Dabei erscheinen spezifische IgM-Antikörper ca. 5-9 Tage p.i. im Serum.
Der IgY-Anstieg folgt dann 9-13 Tage p.i., wobei der höchste Titer zwischen dem 11.
und 21. Tag p.i. erreicht wird. IgA ist häufig noch etwas eher als IgY im Serum nachzuweisen, dies jedoch nur unregelmäßig und in sehr viel geringeren Mengen.
Ein langsamer Abfall der Antikörpertiter im Serum ist nach Primärinfektionen bereits ab der dritten Woche p.i. zu beobachten (TREES et al. 1985; MOCKETT u. ROSE 1986; GILBERT et al. 1988). Die Haltung infizierter Tiere auf Einstreu resultiert in einer kontinuierlichen Rezirkulation von Oozysten und in Reinfektionen der Tiere, bei denen signifikant höhere Antikörpertiter im Serum nachzuweisen sind als bei Tieren, die sich wegen einer Haltung auf Gitterböden nicht reinfizieren können. Auch experimentelle sekundäre oder tertiäre Belastungsinfektionen boostern die Antikörperantwort signifikant und führen insbesondere zu einer deutlichen Erhöhung des Serum-IgY-Titers, dessen Abfall außerdem verzögert wird (MOCKETT u. ROSE 1986; CONSTANTINOIU et al. 2008). Eine Korrelation zur Oozystenausscheidung weist der Serum-IgY-Titer bei geimpften Hühnern auf, bei denen ein deutlicher IgY- Anstieg in den ersten Wochen p.i. zu beobachten ist. Trotzdem findet zu Beginn eine Ausscheidung von Eimerienoozysten statt, die jedoch bei geimpften Herden rückläufig ist. Hohe Antikörperspiegel beruhen demnach auf einer wiederholten Auseinandersetzung mit dem Parasiten, die wiederum zur Ausbildung einer protektiven Immunität und einem Rückgang der Oozystenausscheidung führt (GUZMAN et al. 2003). Weil sich der Antikörperspiegel im Serum außerdem parallel zur zellulären Immunität zu entwickelt, kann seine Bestimmung Hinweise auf diese
gleichzeitig stattfindende Abwehr und auf den Grad der Eimerien-Exposition geben:
Hohe Infektionsdosen führen verglichen mit niedrigen Dosen zu höheren Antikörpertitern innerhalb einer kürzeren Reaktionszeit, so dass auch Infektionsdosis und Antikörpertiter korrelieren (GILBERT et al. 1988).
Dass durch Serumantikörper ein Schutz empfänglicher Tiere erlangt werden kann, ergibt sich aus einer Reihe von Versuchen (LONG et al. 1963; HERLICH 1965;
ROSE 1971), in denen Sera auf empfängliche Tiere übertragen und deren klinische Symptome und Oozystenausscheidung gegenüber ungeschützten Kontrolltieren vermindert waren (zur passiven Immunisierung durch Seren siehe auch 2.3.1).
Dabei besteht z.T. eine gute Korrelation zwischen der Menge und Reaktivität der verabreichten Antikörper und der passiven Protektion der Tiere gegenüber Eimerieninfektionen, welche sich in einer Hemmung der Oozystenausscheidung manifestiert (WALLACH et al. 1994). Eine solche Korrelation lässt sich jedoch nicht aus allen Untersuchungsergebnissen ableiten (DAVIS et al. 1978).
Neben Serumantikörpern, die vor allem der systemischen Bekämpfung von Infektionen dienen, sind auch lokale Antikörper aus dem Lymphgewebe des Verdauungstraktes Teil der humoralen Immunantwort. YUN und LILLEHOJ (2000) betonen, dass dem Lymphgewebe des Digestionstrakts, GALT (gut associated lymphoid tissues), eine besondere Rolle bei der Bekämpfung von Darmparasiten durch Antikörper zukommt, weil der Darmtrakt 70 bis 80% aller antikörper- produzierenden Zellen des Organismus beherbergt. Ein Großteil des intestinalen Lymphgewebes ist beim Huhn auf die Caecaltonsillen konzentriert, die zu 45-55%
aus B-Zellen bestehen (REFEGA et al. 2004). Die B-Zellen des Verdauungstraktes bilden im Verlauf einer Eimerieninfektion spezifisches IgA, IgM und IgY zur lokalen Sekretion an der Darmschleimhaut, wobei IgA mengenmäßig dominiert.
Immunhistologische Untersuchungen zeigen, dass die IgA-produzierenden B-Zellen in der Submucosa der Blinddärme gegenüber IgM- und IgY-bildenden Zellen stark überwiegen. Sekretorisches IgA wird von ihnen als Komplex mit einer sekretorischen Komponente mittels Exocytose an die Oberfläche des Darmepithels gebracht und besitzt die Fähigkeit zur Polymerisierung (DAVIS et al. 1978; LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000).
Mögliche Wirkungsweisen des spezifischen sIgA bestehen in einer Bindung an die Kokzidienoberfläche, einer Hemmung der Invasion von Sporozoiten und Merozoiten sowie der Beeinträchtigung der intrazellulären Entwicklung des Parasiten (LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000; YUN u. LILLEHOJ 2000). Anhaltspunkte dafür sind Untersuchungen, bei denen hohe, lokale Konzentrationen von sIgA in den Regionen des Digestionstrakts, die mit Eimerien belastet waren, gefunden wurden (GIRARD et al. 1997). Außerdem konnte sIgA-haltiger Blinddarminhalt von Hühnern mit Eimerieninfektionen in vitro die Invasion von Sporozoiten in Darmzellen unterbinden (DAVIS et al. 1978). Weiterhin wurden spezifisches IgA und IgM sowohl nach Erst- als auch nach Reinfektionen mit E. tenella in der Galle nachgewiesen, wobei die höchsten Konzentrationen etwa an Tag 9-10 p.i. erreicht wurden (MOCKETT u.
ROSE 1986). Tiere mit hohen biliären sIgA-Werten wiesen nach experimenteller Infektion niedrigere intestinale Sporozoitenzahlen auf als Tiere mit einer geringeren biliären sIgA-Sekretion. Ein hemmender Effekt der hohen biliären sIgA-Werte auf die spätere Oozystenausscheidung der Hühner konnte jedoch nicht beobachtet werden (ROSE u. HESKETH 1987). DAVIS und PORTER (1979) postulieren bei der lokalen Eimerienbekämpfung durch das Immunsystem des Darms einen Synergismus zwischen sekretorischen Antikörpern und unspezifischen Faktoren im Darminhalt.
Denn eine Inkubation von infektiösen Sporozoiten mit Antikörpern hemmt effektiv deren Invasion in Darmepithelzellen. Außerdem führt die Inkubation von Sporozoiten mit Darminhalt allein schon zu einer deutlichen Hemmung der späteren Parasitenentwicklung. Ein effektives, lokales Abwehrsystem könnte somit darin bestehen, dass sekretorische Antikörper spezifisch das Eindringen von Sporozoiten in Darmepithelzellen hemmen, während unspezifische Faktoren im Darminhalt die Parasiten lysieren und ihre Entwicklungsfähigkeit zerstören.
Die oben aufgeführten Studien verdeutlichen, dass ebenso wie die zelluläre Immunabwehr auch das humorale Immunsystem bei Eimerieninfektionen aktiviert wird. Doch wie groß ist die Bedeutung zirkulierender oder lokaler Antikörper für den Immunschutz der Tiere? Diese Frage wird weiterhin kontrovers diskutiert (siehe auch 5.6.3) und ist Gegenstand zahlreicher Forschungsprojekte (LILLEHOJ u. LILLEHOJ 2000).
2.3 Möglichkeiten der passiven Immunisierung gegen Eimerien Die passive Immunisierung könnte als alternative Bekämpfungsstrategie gegen die Kokzidiose des Huhnes in den kommenden Jahren an Bedeutung gewinnen. Denn die intensiven Haltungsbedingungen beim Geflügel, sich entwickelnde Resistenzen gegen routinemäßig eingesetzte Kokzidiostatika und die gesetzliche Einschränkung des Einsatzes von Arzneimitteln bei lebensmittelliefernden Tieren machen neue immunologische Bekämpfungsstrategien dringend notwendig (WALLACH 1997;
BLAKE et al. 2005; HAFEZ 2008). Wie bereits erwähnt (2.1.3), ist die aktive Immunisierung als alleinige Alternative zur Kokzidiostatikabehandlung bei Broilern wegen der kurzen Mastdauer nicht so gut geeignet. Bei dieser Methode tritt eine schützende Immunität nämlich erst nach einer zeitlichen Verzögerung auf, so dass zuvor bereits Produktionsausfälle durch den Leistungsrückgang der Tiere aufgrund der Parasitenentwicklung zu verzeichnen sind (BHOGAL et al. 1992; SCHUBERT 2005). Eine passive Immunisierung durch Antikörper, die einen Immunschutz der Tiere vom ersten Lebenstag an gewährleistet, scheint daher ein sinnvoller Ansatz zu sein.
Die Erfolge einer passiven Immunisierung durch Antikörper gegen verschiedene Krankheitserreger des Verdauungstraktes werden durch eine Reihe von Untersuchungen aufgezeigt, von denen einige hier exemplarisch genannt werden sollen: So konnten z.B. Forellen mit Hilfe von intraperitoneal appliziertem IgY vor Infektionen mit Yersinia ruckeri geschützt werden (LEE et al. 2000). Ferkel, die aufgrund einer Infektion mit enterotoxischen E. coli an Diarrhoe litten, konnten durch antikörperhaltiges Eidotter-Lyophylisat immunisierter Hühner erfolgreich behandelt werden (WIEDEMANN et al. 1991). Ebenso konnte aus Eidotter isoliertes IgY mongolische Gerbils vor Infektionen mit Helicobacter pylori schützen und Läsionen der Magenschleimhaut verringern (SHIN et al. 2002). Weitere erfolgreiche Anwendungsmöglichkeiten der lokalen passiven Immunisierung sind aus der Humanmedizin bekannt: Beispielsweise verhindert ein monoklonaler Antikörper bei Patienten eine Wiederbesiedlung mit dem kariesauslösenden Streptococcus mutans (MA et al. 1990). Die orale Verabreichung spezifischer, humaner Serum-
immunglobuline führt bei immundefizienten Patienten zu einer Komplexbildung mit Rotaviren im Gastrointestinaltrakt und könnte daher ein wirkungsvolles Mittel zu deren Bekämpfung darstellen (LOSONSKY et al. 1985). Die ausgewählten Beispiele verweisen auf das große Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten einer passiven Immunisierung mittels Antikörpern in der Human- und Veterinärmedizin, zu denen auch BERGHMAN et al. (2005), KLOTZ (2005) und SCHADE et al. (2005) einen Überblick geben. Die Bekämpfung von Eimerieninfektionen beim Geflügel könnte eine weitere Anwendungsmöglichkeit der passiven Immunisierung darstellen. Als Methoden stehen dabei grundsätzlich eine systemische Immunisierung, z.B. durch Antiseren oder maternale Antikörper, und eine lokale Immunisierung, z.B. durch prophylaktische Antikörperverabreichung über das Futter, zur Verfügung (HAGEMANN 2006). In den folgenden Abschnitten werden diese zwei Alternativen näher beschrieben.
2.3.1 Passive systemische Immunisierung durch Verabreichung von Antiseren Die Übertragung einer passiven systemischen Immunität mittels Serum immunisierter Tiere oder rekonvaleszenter Patienten wurde als „Serumtherapie“ von Behring und Kitasato schon 1890 begründet. Durch ihren Beweis, dass eine passive Immunität durch Blutserum auf empfängliche Tiere übertragen werden kann, schufen sie eine Basis für die Entwicklung der Immuntherapie und des ersten, ab 1893 kommerziell erhältlichen Immunserums gegen Diphtherie (zitiert nach BERGHMAN et al. 2005).
In Bezug auf die Kokzidiose des Huhnes wurden seit den sechziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts vermehrt Studien mit dem Ziel durchgeführt, die Wirkung von Serum immunisierter Tiere auf den Verlauf einer Infektion mit Oozysten, Sporozoiten oder Merozoiten verschiedener Eimerienstämme bei empfänglichen Tieren zu untersuchen. Dabei sollte festgestellt werden, ob Antikörper eine schützende Wirkung gegenüber dem infektösen Agens in vitro und in vivo entfalten, welche weiteren Serumkomponenten eine Rolle spielen und ob eine protektive humorale Immunität auf empfängliche Tiere zu übertragen ist. Einige grundlegende Erkenntnisse aus diesen Versuchen werden im Folgenden kurz dargelegt.
LONG et al. (1963) inkubierten infektiöse Stadien von Eimeria tenella mit frischen Immunsera, erhitzten Immunsera sowie erhitzten Immunsera, denen Komplement hinzugefügt wurde. Wichtige Ergebnisse dieser Studien sind, dass das frische Serum immunisierter Tiere E. tenella-Sporozoiten und -Merozoiten lysiert, während es bei erhitztem Serum nur nach Zugabe von Komplement zur Lyse dieser Eimerienstadien kommt. Hitzeinaktiviertes Serum allein hat dennoch einen Effekt auf die Sporozoiten, indem es zu einer Änderung ihrer Form und einer Verringerung ihrer Infektiosität führt. In vivo zeigt sich die schützende Wirkung der getesteten frischen Immunsera in Form einer Reduktion der Oozystenausscheidung der Hühner. HERLICH (1965) untersuchte die Auswirkungen verschiedener Sera und Gewebsextrakte auf Oozysten, Sporozoiten und Merozoiten von E. tenella und E. acervulina in vitro und in vivo. Die Infektiosität von sporulierten Oozysten wurde durch die Inkubation mit Seren und Gewebsextrakten nicht verringert. Im Falle der Sporozoiten und Merozoiten kam es jedoch durch die Inkubation mit dem Serum hyperimmunisierter Tiere in vitro zwar nicht zu einer Lyse, jedoch zu einer Immobilisierung der Stadien sowie in vivo zu einer Reduktion der Oozystenzahlen in den Caeca. Da diese Effekte bei der Inkubation der Parasiten mit Darmgewebsextrakten nicht zu beobachten waren, stammen spezifische Antikörper wahrscheinlich aus der Zirkulation und dem retikuloendothelialen System und sind nicht lokal im Darmgewebe gespeichert.
ROSE (1971) schaffte es schließlich in Versuchen mit Eimeria maxima, durch intravenöse und intraperitoneale Injektion von Serum immunisierter Hühner empfängliche Tiere zu schützen und deren Oozystenausscheidung zu hemmen: Je größer die verabreichte Serummenge desto geringer fiel die Oozystenausscheidung der Tiere aus, wobei aber kein vollständiger Schutz im Sinne einer sterilen Immunität erlangt werden konnte. Die Oozystenausscheidung war außerdem abhängig von der gewählten Infektionsdosis der Belastungsinfektion: Schwächere Infektionen mit geringen Oozystenzahlen wurden durch Serumgaben stärker gehemmt als solche mit höheren Dosen. Der Zeitpunkt der Serumgaben war ebenfalls von Bedeutung:
Am wirksamsten waren die Serumgaben, wenn die Applikation schon einige Tage vor Infektion begann und über mehrere Tage hinweg fortgesetzt wurde. Die Antikörperdosis und das Verabreichungsschema sind auch heute noch wichtige
Faktoren, die bei der passiven Immunisierung von Tieren berücksichtigt werden müssen (CASADEVALL 2004). Für ihren Einsatz im Rahmen der intensiven Geflügelhaltung müssen große Mengen an spezifischen Antikörpern kostengünstig produziert werden und einfach zu verabreichen sein (BERGHMAN et al. 2005). Diese Voraussetzungen werden von der Methode der Serumgewinnung aus immunisierten Spendertieren und der intravenösen Applikation des Serums bei jedem Einzeltier sicher nicht erfüllt. Weitere Nachteile sind die durch die systemische Applikation gegebene Gefahr der Übertragung von Krankheitserregern und die schwankenden Antikörpergehalte des Serums, von denen spezifische Antikörper nur einen geringen Anteil bilden (CASADEVALL 2004; HAGEMANN 2006). Deshalb wird diese Methode der passiven Immunisierung bei der Kokzidienbekämpfung nicht praktiziert.
2.3.2 Passive systemische Immunisierung durch maternale Antikörper
Antikörper aus dem Eidotter immunisierter Hühner sind gekühlt über Jahre hinweg stabil, können non-invasiv gewonnen und in großen Mengen einfach produziert werden (CAMENISCH et al. 1999; YEGANI u. KORVER 2007). Daher stellt ihre Isolierung und Verabreichung für viele Geflügelkrankheiten eine potentiell kosteneffektive Behandlungsmöglichkeit dar. Diese Antikörper könnten Pathogene binden und immobilisieren sowie Wachstum und Replikation der Erreger reduzieren oder verhindern. Die Variabilität von Antikörpermengen im Eidotter und die Stabilität der Antikörper im Gastrointestinaltrakt im Falle einer oralen Applikation sind allerdings kritische Punkte, die es jeweils zu untersuchen gilt (YEGANI u. KORVER 2007).
Eine einfachere, natürliche Anwendungsmethode für maternale Antikörper ist daher die direkte Übertragung der passiven systemischen Immunität auf die sich im Ei entwickelnden Nachkommen: Maternale Antikörper werden über das Eidotter von der Henne in großen Mengen an das sich entwickelnde Küken weitergegeben.
Konzentrationen von 20-40 mg IgY/ml Eidotter wurden im Hühnerei nachgewiesen (SCHADE et al. 2005; YEGANI u. KORVER 2007), wobei eine Henne insgesamt rund 100 g Antikörper pro Jahr produzieren kann (BERGHMAN et al. 2005). Im Eidotter treten dabei Antikörper verschiedener Antikörperklassen auf: Von IgA und
IgM, die trotz einer entsprechenden aktiven Immunisierung der Legehenne nicht eimerienspezifisch zu sein scheinen, finden sich nur Mengen im Mikrogrammbereich.
Dagegen wird IgY im Eidotter in großen Mengen angereichert (Milligrammbereich) und korreliert stark mit einer spezifischen Immunität der Nachkommen gegenüber Eimerieninfektionen (SMITH, N. C. et al. 1994).
Durch Immunisierung von Hühnern mittels aufgereinigter Gametozytenantigene von Eimeria maxima erzeugten WALLACH et al. (1992) ebenfalls hohe Titer spezifischer maternaler Antikörper im Eidotter. Die Nachkommen der immunisierten Tiere zeigten - im Vergleich zu den Nachkommen nicht immunisierter Elterntiere - eine Hemmung der Oozystenausscheidung von 83% bei einer homologen Belastungsinfektion. Eine immer noch um 25% reduzierte Oozystenausscheidung zeigten solche Nachkommen, die 4 Monate nach Immunisierung der Elterntiere schlüpften. Dabei bestand eine deutliche Abhängigkeit zwischen den Antikörpertitern im Eidotter und der Reduktion der Oozystenausscheidung (WALLACH et al. 1992). Eine positive Korrelation zwischen Serum- und Eidotter-Antikörpertitern und der Reduktion der Oozystenausscheidung bei den Nachkommen bestätigen SMITH, N.C. et al. (1994).
In weiteren Studien zur Immunisierung von Elterntieren durch Gametozytenantigene von E. maxima stellte sich heraus, dass eine Kreuzimmunität gegenüber E. tenella und E. acervulina erzeugt werden konnte. Im Falle der homologen Belastungs- infektion mit E. maxima wurde bei diesen Experimenten eine Hemmung der Oozystenproduktion von 63% erreicht, während es bei den heterologen Erregern E. tenella und E. acervulina immerhin noch 45-60% waren (WALLACH et al. 1995).
Die Immunisierung von Elterntieren mit einigen spezifischen, aufgereinigten Eimerien-Gametozytenantigenen erweist sich somit als ein wirksames Instrument zur Kontrolle der Hühnerkokzidiose durch Übertragung einer passiven systemischen Immunität auf die Nachkommen. Insbesondere kann die Oozystenausscheidung während der ersten drei Lebenswochen soweit reduziert werden, dass eine Ansammlung von Oozysten in der Einstreu bis zur 5. Lebenswoche unterbleibt und der Infektionsdruck gering gehalten wird. Durch die wenigen vorhandenen Oozysten kann es sogar zu einer zusätzlichen aktiven Immunisierung der Küken kommen. Bei der Immunisierung von Elterntieren ist offenbar durch das Vorhandensein
konservierter Epitope der Schutz der Nachkommen gegenüber mehreren Eimerienarten gegeben (WALLACH et al. 1995; WALLACH 1997). Eine auf den untersuchten Gametozytenantigenen basierende Subunit-Vakzine, CoxAbic®, ist seit Kurzem im Handel (HAFEZ 2008).
Neben der beschriebenen Kreuzimmunität gegenüber mehreren Eimerienarten und der signifikanten Reduktion der Oozystenausscheidung ergeben sich weitere Vorteile der Immunisierung von Elterntieren zur Übertragung einer passiven systemischen Immunität auf die Nachkommen: Die Methode ist kosteneffektiv, da durch die Impfung einer Zuchthenne ungefähr 100 Broiler während der ersten Lebenswochen geschützt werden können. Weiterhin wird eine hohe Praktikabilität dadurch gewährleistet, dass die Immunisierung der Zuchthennen leicht in das ohnehin existierende Impfprogramm in den Zuchtbetrieben eingegliedert werden kann (WALLACH 1997). Somit ist diese Methode ein vielversprechendes Instrument zum Schutz der Küken während der ersten Lebenswochen und damit zur Kontrolle der Kokzidiose des Huhnes unter Feldbedingungen (WALLACH 1997; LILLEHOJ u.
LILLEHOJ 2000; GUZMAN et al. 2003). Im Hinblick auf die Frage nach der Bedeutung von Antikörpern in der Kokzidienbekämpfung (siehe 2.2.2) beweisen die oben genannten Studien, dass die Übertragung einer passiven, zumindest partiellen Immunität auf empfängliche Nachkommen durch maternale Antikörper möglich ist.
Nichtsdestotrotz birgt die Methode der maternalen Immunisierung auch Nachteile:
Maternale Antikörper gegen Eimerien werden im Organismus der Küken abgebaut, wobei deren Abfall im Serum der Tiere einer logarithmischen Funktion folgt und es darüber hinaus durch das schnelle Wachstum beim Broiler zu einer Art Verdünnungseffekt kommt. Dadurch geht die Hemmung der Oozystenausscheidung von 91 % in der 1. Lebenswoche auf 58 % in der 2. Lebenswoche zurück (SMITH, N.
C. et al. 1994). In der 3. Lebenswoche verschwinden die letzten maternalen Antikörper, so dass die maternale Immunität zu diesem Zeitpunkt keinen ausreichenden Schutz gegenüber Neuinfektionen mehr bietet (GILBERT et al. 1988;
SMITH, N. C. et al. 1994).
