der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig
Experimentelle Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein: In-vitro- und In-vivo-Entwicklung von Kerntransferkomplexen aus in vitro gereiften Oozyten
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Michael Hölker
aus Vreden
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann 2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2003
Die vorliegende Arbeit wurde durch finanzielle Mittel der DFG gefördert (SFB 265)
Nicht in der Erkenntnis liegt das Glück, sondern im Erwerben der Erkenntnis
Edgar Allan Poe, Schriftsteller (1809-1849)
1 EINLEITUNG--- 1
2 SCHRIFTTUM --- 4
2.1 Biologische Grundlagen --- 4
2.1.1 Keimzellentwicklung beim Schwein--- 4
2.1.2 Physiologie der Befruchtung--- 8
2.1.3 Embryonalentwicklung beim Schwein---11
2.1.4 Relevante Aspekte des Zellzyklus ---15
2.2 Biotechnologische Grundlagen---18
2.2.1 In-vitro-Reifung porziner Oozyten ---18
2.2.2 In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen ---24
2.2.3 Parthenogenetische Entwicklung beim Schwein ---26
2.2.4 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen ---31
2.2.5 Transfer porziner Embryonen auf Empfängertiere ---33
2.3 Genetisch identische Nachkommen ---35
2.3.1 Monozygote Zwillinge durch Blastomeren-Isolierung ---35
2.3.2 Monozygote Zwillinge durch mikrochirurgische Teilung ---37
2.3.3 Genetisch identische Mehrlinge durch Kerntransfer---37
2.4 Technik beim Klonen mittels Kerntransfer---39
2.4.1 Effizienz des Kerntransfers bei verschiedenen Tierarten ---42
2.4.2 Einflußfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers---43
2.4.2.1 Biologischer Status der Spenderzelle---43
2.4.2.2 Biologischer Status der Empfängerzelle---45
2.4.2.3 Einfluß der Zellzyklen von Oozyte und Spenderzelle---46
2.5 Klonen beim Schwein mittels Kerntransfer ---49
2.5.1 Klonen beim Schwein mittels embryonalen Kerntransfers ---49
2.5.2 Klonen beim Schwein mittels somatischen Kerntransfers ---51
2.5.2.1 In vitro Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim Schwein---53
2.5.2.2 In vivo Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim Schwein---56
2.5.2.3 Transgene Schweine aus somatischem Kerntransfer---59
2.5.3 Anwendungsperspektiven für transgene Schweine---61
2.5.4 Normalität geklonter Nachkommen aus somatischem Kerntransfer---62
3 MATERIAL UND METHODEN ---65
3.1 Anfertigung der Pipetten ---66
3.1.1 Transportpipetten---66
3.1.2 Arbeitspipetten ---66
3.2 Medien---69
3.2.1 Selektionsmedien ---69
3.2.2 Reifungsmedien ---69
3.2.3 Arbeitsmedien ---70
3.2.4 Fusions- und Aktivierungsmedien---70
3.2.5 Kulturmedien ---70
3.3 In-vitro-Reifung porziner Oozyten ---71
3.3.1 Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe ---71
3.3.2 In-vitro-Reifung porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU37 ---72
3.3.3 Entkumulierung und Selektion in vitro gereifter Oozyten ---73
3.3.4 Medienzusatz zur optischen Markierung von DNA ---76
3.4 Gewinnung und Präparation der Kernspenderzellen ---77
3.4.1 Herstellung einer Explantatkultur---77
3.4.2 Vorbereitung der Spenderzellen für den Kerntransfer ---79
3.4.3 Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer ---79
3.5 Mikromanipulation ---79
3.5.1 Destabilisierung des Zytoskelettes---79
3.5.2 Aufbau des Mikromanipulators---80
3.5.3 Durchführung der Enukleation ---82
3.5.4 Durchführung des Kerntransfers ---86
3.6 Fusion ---90
3.6.1 Aufbau der Fusionseinheit ---90
3.6.2 Durchführung der Fusion ---91
3.6.3 Bestimmung der Fusionsrate---92
3.7 Artifizielle Aktivierung ---92
3.7.1 Aufbau der elektrischen Aktivierungskammer---92
3.7.2 Aktivierung im elektrischen Feld---93
3.7.3 Aktivierung durch Proteinkinase-Inhibierung ---94
3.8 In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen ---94
3.8.1 In-vitro-Kultur porziner Embryonen ---94
3.8.2 Beurteilung der In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen ---95
3.8.2.1 Bestimmung der Blastozystenrate---95
3.8.2.2 Bestimmung der Kernzahlen der einzelnen Embryonen---95
3.8.2.3 Bestimmung der Teilungsrate--- 95
3.8.2.4 Bestimmung der Durchschnitts-Kernzahl pro Blastozyste---95
3.9 In-vivo-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen ---96
3.9.1 Synchronisation der Empfängertiere ---96
3.9.2 Transfer porziner Kerntransfer-Embryonen im Zygotenstadium---96
3.9.3 Aufrechterhaltung der Trächtigkeit ---97
3.9.4 Beurteilung der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit---98
3.10 Nachweis genetischer Identität der geborenen Ferkel ---98
3.11 Statistische Auswertung ---99
3.12 Versuchsaufbau--- 100
4 ERGEBNISSE --- 101
4.1 Entwicklung eines Kerntransferprotokolls--- 102
4.1.1 Bestimmung der Reifungsrate --- 102
4.1.2 Auswahl des elektrischen Feldes zur Aktivierung --- 102
4.1.3 Auswahl eines geeigneten Kulturmediums --- 103
4.1.4 Auswahl eines geeigneten Arbeitsmediums --- 104
4.1.5 Auswahl einer geeigneten Osmolarität des Arbeitsmediums--- 106
4.1.6 Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls --- 107
4.1.7 Versuche zur Aktivierbarkeit--- 108
4.2 In-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen --- 110
4.2.1 Auswahl eines geeigneten Fusionsmediums--- 110
4.2.2 Fusion von Kerntransfer-Embryonen--- 111
4.2.3 In-vitro-Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen--- 112
4.3 In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen --- 119
4.3.1 Transfer von Kerntransfer-Embryonen auf Empfängertiere --- 120
4.3.2 Bestimmung der genetischen Identität der geklonten Ferkel--- 126
5 DISKUSSION --- 127
5.1 Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls--- 127
5.2 Entwicklungspotential von Kerntransfer-Embryonen --- 132
5.3 Schlußfolgerungen und Ausblick in die Zukunft--- 142
6 ZUSAMMENFASSUNG --- 144
7 SUMMARY --- 148
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS--- 152
9 LITERATURVERZEICHNIS --- 155
10 MEDIENANHANG --- 197
10.1 Kulturmedien--- 197
10.2 Arbeitsmedien --- 198
10.3 Fusions- und Aktivierungsmedien--- 199
10.4 Zellkulturmedium --- 199
11 VERZEICHNIS DER TABELLEN --- 200
12 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN--- 202
1 Einleitung
Das Klonen durch somatischen Kerntransfer ist zur Zeit Gegenstand intensiver Forschungsarbeit und einer ethischen Diskussion. Vor allem durch die mediale Vermarktung des weltweit ersten somatischen Klonschafs „Dolly“ (WILMUT et al.
1997) gelangte das Klonen in das Bewusstsein der breiten Öffentlichkeit. Während es für das von vielen Kritikern befürchtete Klonen von Individuen kaum sinnvolle Anwendungsperspektiven gibt, wird das Klonen von Wissenschaftlern als wichtig für die Grundlagenforschung und als ein potentes Hilfsmittel zur Erstellung transgener Tiere angesehen (NIEMANN u. KUES 2000). Durch den somatischen Kerntransfer kann aus einer einzelnen genetisch modifizierten Körperzelle ein transgenes Tier erzeugt werden, das die genetische Modifikation auf sexuellem Weg an die nächste Generation weitergeben kann (SCHNIEKE et al. 1997; CIBELLI et al. 1998; BAGUISI et al. 1999; PARK et al. 2001a). Das große Potential des Kerntransfers kann vor allem in Kombination mit der „homologen Rekombination“ genutzt werden. Diese ermöglicht gezielte genetische Modifikationen von Kulturzellen (DENNING et al.
2001). Besonders das Schwein steht zur Zeit im Blickpunkt des Interesses für die Generierung transgener Tiere, insbesonders im Kontext der Xenotransplantation (MACHATY et al. 2002; NIEMANN et al. 2003). Die Organe geeigneter transgener Schweine sollen in Zukunft das Defizit, das weltweit in der Zahl geeigneter humaner Spenderorgane besteht, reduzieren. Die größte Hürde hierfür stellt ein Komplement- vermittelter Prozess, die „Hyperakute Abstoßungsreaktion“ (HAR), dar. Die HAR wird ausgelöst durch die Bindung humaner Antikörper an α1,3-Gal Epitope porziner Epithelien, was die Komplement-Kaskade aktiviert (PLATT et al. 1991). Diese Epitope werden in der Schweinezelle durch die α-1,3-Galactosyltransferase produziert, die durch ein einzelnes Gen kodiert wird. Da Menschen dieses Gen fehlt, besitzen sie natürlicherweise Antikörper gegen α1,3-Gal Epitope (GALILI et al. 1988).
Deshalb werden international Anstrengungen unternommen, um α-1,3- Galactosyltransferase-Knockout Schweine zu erzeugen, mit dem Ziel die HAR dauerhaft zu unterbinden. Erreicht werden soll dies in einem ersten Schritt durch die Generierung von α1,3-Gal-Knockout-Zellen, aus denen in einem zweiten Schritt
α1,3-Gal-Knock-out-Schweine durch somatischen Kerntransfer geklont werden sollen. Dies ist kürzlich erstmals bei einem Allel (heterozygot) (DAI et al. 2002; LAI et al. 2002a; RAMSOONDAR et al. 2003), und in einem Fall mit beiden Allelen (homozygot) (PHELPS et al. 2003), gelungen.
Der Kerntransfer selbst besteht aus 5 Hauptschritten; der Enukleation, dem Transfer der Spenderzelle, der Fusion, der Aktivierung der Kerntransferkomplexe und der Kultur der rekonstruierten Embryonen (zum Überblick: COLMAN 2000). Bis heute führte der somatische Kerntransfer bei 9 verschiedenen Tierarten zur Geburt von lebenden Nachkommen. So wurden bisher Schaf (CAMPBELL et al. 1996b), Rind (CIBELLI et al. 1998), Ziege (BAGUISI et al. 1999), Maus (WAKAYAMA et al. 1998), Schwein (POLEJAEVA et al. 2000), Kaninchen (CHESNE et al. 2002), Katze (SHIN et al. 2003), Maultier (WOODS et al. 2003) und das Pferd (GALLI et al. 2003) erfolgreich geklont. Die Technik erreicht jedoch nur geringe Erfolgsraten und führt bei den Nachkommen häufig zu Abnormalitäten, die bei Wiederkäuern unter dem Begriff
„Large Offspring Syndrome“ (LOS) zusammengefasst werden (YOUNG et al. 1998).
Nur beim Rind wird eine Erfolgsrate von 15-20% lebender Nachkommen, bezogen auf alle übertragenen geklonten Embryonen, erreicht. Bei den anderen Tierarten betragen die Erfolgsraten weniger als 3%, wobei die Effizienz beim Schwein sogar unter 1% liegt (zum Überlick: ONISHI 2002; BREM u. KÜHHOLZER 2002). Aufgrund dieser Schwierigkeiten sind die weltweit ersten geklonten Schweine erst im Jahre 2000 zur Welt gekommen (BETTHAUSER et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000;
ONISHI et al. 2000), und bis heute ist es erst wenigen Arbeitsgruppen gelungen, lebensfähige Ferkel aus somatischem Kerntransfer zu erhalten.
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines Projektes zur Erzeugung transgener Schweine für die Xenotransplantation angefertigt. In enger Kooperation mit einer weiteren Dissertation, in der Aspekte der Spenderzellen, sowie deren gezielte Modifikation, erarbeitet wurden (PETERSEN in Vorbereitung, persönliche Mitteilung), war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Entwicklung eines Protokolls zum Klonen von Schweinen mittels somatischen Kerntransfer. Ein solches Kerntransfer-Protokoll soll zukünftig die Generierung transgener Schweine verbessern, was bisher über das Mikroinjektionsverfahren erfolgte (Niemann et al. 2001a). Beweis der Funktionalität
des entwickelten Kerntransfer-Protokolls sollte die Entwicklungsfähigkeit geklonter Embryonen nach Transfer auf Empfängertiere sein. Als Ausgangsmaterial sollten in vitro gereifte Oozyten genutzt werden, da diese, im Gegensatz zu in vivo gereiften Oozyten, in ausreichender Anzahl regelmäßig und kostengünstig verfügbar sind. In der ersten Versuchsphase sollten zur Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls entwicklungsbeeinflussende Parameter für Kerntransfer-Embryonen ermittelt werden.
Hierzu wurden umfangreiche Untersuchungen an parthenogenetischen Embryonen durchgeführt, die als „Modell“ benutzt wurden. Im zweiten Versuchsabschnitt sollte das Protokoll auf KT-Embryonen übertragen und optimiert werden, um eine möglichst weitreichende In-vitro-Entwicklung geklonter porziner Embryonen zu gewährleisten. In der dritten Versuchsphase wurde das optimierte Kerntransfer- Protokoll hinsichtlich der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit so erzeugter Embryonen überprüft. Als Kriterium zur Ermittlung des Entwicklungspotentials der erzeugten Klon-Embryonen sollte der Transfer auf Empfängertiere und die Geburt von Ferkeln dienen.
2 Schrifttum
2.1 Biologische Grundlagen
2.1.1 Keimzellentwicklung beim Schwein
Die Entwicklung der Oozyten beginnt in der frühen Fetalentwicklung: Bereits bei den ersten Furchungsteilungen entsteht in einigen Blastomeren das „germinative Plasma“, aus dem die Primordialkeimzellen (PKZ, Abbildung 1/A) hervorgehen.
Diese Urkeimzellen, die sich durch ihre Größe und ihren kugeligen Kern, sowie dem hohen Gehalt an alkalischer Phosphatase und Glykogen, von den kleineren somatischen Zellen unterscheiden, finden sich beim fetalen Säuger in unmittelbarer Nähe der Allantoisanlage. Sie wandern durch amöboide Eigenbewegung, wobei diese durch chemotaktische Reize der Keimdrüsenanlage unterstützt werden soll, über das Bindegewebe des Enddarms ins Mesenterium und gelangen schließlich über die Nierenanlage in die Genitalleiste (PICTON u. GOSDEN 1995). Hier bilden sie die Oogonien (Abbildung 1/B). Während der Wanderung, sowie in der Keimdrüsenanlage, durchlaufen die PKZ eine Reihe von Mitosezyklen. Wenn sie ihren Bestimmungsort erreicht haben verlieren sie ihre Motilität (SCHNORR 1996).
Die PKZ differenzieren sich in der ersten Wachstumsperiode zu den Oozyten 1.
Ordnung, d.h. zu den primären Oozyten (Abbildung 1/C), wobei die Meiose in der Prophase der ersten Reifeteilung (spätes Diplotän) unterbrochen wird (FULKA et al.
1972). Nach Abschluss dieser ersten Wachstumsperiode, die beim Schwein bis in die postnatale Periode hineinreicht, ist die Gesamtpopulation an Keimzellen festgelegt (SCHNORR 1996). Zum Zeitpunkt der Geburt sind ca. 99% der primären Oozyten in dieser Ruhephase arretiert, die unter Umständen viele Jahre dauert und erst zu Beginn der präovulatorischen Follikelreifung beendet wird (FULKA et al.
1972). Die 30-50 µm große Schweineeizelle wird in dieser Entwicklungsstufe von einem einschichtigem Plattenepithel umgeben und bildet mit diesem zusammen den Primordialfollikel. Eizellen, die nicht in einen Follikel eingeschlossen werden, gehen zugrunde (MOOR et al. 1990; HUNTER 1991; SCHNORR 1996).
Etwa vom 60. Tag nach der Geburt an tritt beim Schwein ein Teil der Primordialfollikel in die zweite Wachstumsperiode ein, bei der die Eizelle ihre endgültige Größe (ca. 150 µm) erreicht und die Follikel unter dem Einfluß der Hormone über Primär- und Sekundärfollikel zu den vesikulären Tertiärfollikeln heranwachsen (MAULEON 1964; OXENEDER et al. 1979). In dieser 2.
Wachstumsphase weisen die primären Oozyten eine ausgeprägte metabolische und synthetische Aktivität auf. Proteine, Energiesubstrate und Lipide, sowie Mitochondrien und Ribosomen, werden von ihnen selbst, sowie von den Granulosazellen, synthetisiert und in Form von Granula gespeichert (PICTON u.
GOSDEN 1995). Sie sind notwendig für den Metabolismus, die Zellstruktur während der Reifung, sowie für die ersten Teilungen in der Embryonalentwicklung, bevor das embryonale Genom aktiviert wird (CRAN u. CHENG 1985; MOOR et al. 1990;
HUNTER 1991; HYTTEL et al. 1993). Im Stadium des Primärfollikels beginnen primäre Oozyten und Granulosazellen darüber hinaus mit der Synthese der aus mehreren Glykolipidschichten bestehenden Zona pellucida, die die spätere Oozyte umgibt. Parallel dazu wird das flache Follikelepithel erst kubisch, später zylindrisch (MAULEON 1964; HUNTER 1991). Gegen Ende der Wachstumsperiode nimmt die RNA-Syntheseaktivität ab, wobei die Synthese von Makromolekülen bis in die spätere Reifungsphase anhält (MOOR et al. 1990; WASSERARMAN u. ALBERTINI 1994). Aus dem Primärfollikel entsteht der Sekundärfollikel, dessen Wand aus einem mehrschichtigen kubischem Epithel besteht. In diesem Stadium hat die Eizelle einen Durchmesser von ca. 100 µm erreicht, und die Zona pellucida ist als vollständige Hülle ausgebildet. Das Follikelepithel entwickelt sich im folgenden durch mitotische Teilungen zum mehrschichtigen Stratum granulosum, das durch eine Basalmembran von der Theca folliculi interna und externa abgegrenzt ist. Durch Sekretion der Granulosazellen entsteht Liquor follicularis, der sich zwischen den Zellen ansammelt, was zu einer Hohlraumbildung führt, und so den Tertiärfollikel entstehen lässt. Die Oozyte wird an die Wand des Follikels gedrängt und in der Folge von mehreren Granulosazellschichten umgeben. Diese Struktur wird als Kumulus-Oozyten-Komplex (KOK) bezeichnet (SCHNORR 1996).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Keimzellentwicklung beim Schwein
Geburt
ab Geschlechtsreife E
D C B A
ab Tag 60 nach Geburt
postpuberal praepuberal praenatal
postnatal
(modifiziert nach ALBERTS et al. 1995)
Die präovulatorische Freisetzung der gonadotropen Hormone induziert schließlich die Bildung des ovulationsbereiten Graafschen Follikels. Hierbei führt ein LH-Anstieg, der letztlich auch die Ovulation auslöst, zur Vermehrung der Granulosazellen und zur Zunahme der Follikelflüssigkeit. Die ursprüngliche breitflächige Verbindung des Cumulus Oophorus mit dem Stratum granulosum wird bis auf einen dünnen Stiel, der schließlich einreißt, reduziert, so dass die Eizelle samt umgebenden Kumuluszellen frei in der Follikelflüssigkeit flotiert (SCHNORR 1996). Ebenso induziert der LH- Anstieg, durch Wiederaufnahme der meiotischen Aktivität, die Reifung der im Diktyotän verharrenden primären Oozyte (HUNTER 1966). Die Auflösung des ringförmigen Germinalvesikels (Germinal Vesicle Break Down, GVBD) ist charakteristisch für dieses Stadium (DAGUET 1980; DEKEL 1988). Zugleich wird durch ungleiche Zytokinese der erste Polkörper ausgeschleust, was die sekundäre Oozyte (Abbildung 1/D) entstehen lässt (TSAFRIRI et al. 1982). Unmittelbar darauf beginnt diese die zweite meiotische Reifeteilung zu durchlaufen, die jedoch in der Metaphase (Metaphase II-Oozyte, MII-Oozyte) bis zur Aktivierung durch ein penetrierendes Spermium erneut arretiert wird (HUNTER et al. 1987; THIBAULT et al. 1987; HUNTER 1991; BEARDEN u. FUQUA 1993). Erst mit Abschluss der zweiten Reifeteilung, im Anschluss an die Befruchtung, entsteht die haploide reife Eizelle, das Ovum (Abbildung 1/E). Pro Zyklus entstehen beim Schwein 25-50 Tertiärfollikel, von denen nur eine begrenzte Anzahl ovuliert. Die übrigen Oozyten degenerieren zusammen mit den umgebenen Follikeln (BYSKOV 1978;
ARMSTRPONG u. LEUNG 1990). Verglichen mit den Eizellen von Schaf und Rind ist ein relativ hoher Lipidgehalt speziesspezifisch für die Schweineeizelle. Besonders der Anteil mehrfach ungesättigter Fettsäuren ist beim Schwein wesentlich höher als bei den genannten Wiederkäuern (McEVOY et al. 2000). Der hohe Lipidgehalt, der später auch typisch für den porzinen präeimplantativen Schweineembryo ist, bedingt eine hohe Empfindlichkeit von Eizelle und Embryo gegen Temperaturschwankungen, was unter anderem zu Schwierigkeiten bei der Kryokonservierung porziner Embryonen führt (zum Überlick: DOBRINSKY 1997).
2.1.2 Physiologie der Befruchtung
Bei der Befruchtung erfüllt das Spermium zwei zentrale Aufgaben: Es liefert der Oozyte in Form des haploiden Chromosomensatzes die genetische Information für das diploide Genom und aktiviert die Eizelle, so dass diese ihre 2. meiotische Reifeteilung vollenden kann, den 2. Polkörper ausschleust und nach Verschmelzung des männlichen- und weiblichen Vorkerns schließlich die Embryonalentwicklung einleitet. Beim Schwein findet die Befruchtung am Übergang der Eileiterampulle zum Isthmus tubae uterinae statt. Die Oozyten gelangen nach der Ovulation über die Fimbrientrichter in die Eileiter und erreichen nach 30-45 Minuten die Eileiterampulle (HUNTER 1991). Ihre optimale Befruchtungsfähigkeit bleibt jedoch nur maximal sechs Stunden bestehen (HUNTER 1991). Die ersten Spermien erreichen bereits 15 Minuten nach der Konzeption den Eileiter, was durch die intrauterine Deposition, das große Ejakulatvolumen, sowie durch kranial gerichtete Myometriumskontraktionen unterstützt wird (HUNTER 1991). Im Bereich des kaudalen Isthmus tubae uterinae wird ein Spermienreservoir gebildet, wobei die Spermien an epitheliale Zellen binden (HUNTER 1991). Die periovulatorische Freisetzung der Spermien erfolgt aufgrund vom Follikel ausgehender hormoneller Signale (HUNTER 1994). Um die Befruchtungsfähigkeit zu erlangen, müssen die Spermien die Kapazitation durchlaufen (HUNTER u. DZIUK 1968), die durch biochemische und biophysikalische Umgestaltungsprozesse gekennzeichnet ist (FLESCH u. GADELLA 2000) und die Voraussetzung für die Akrosomreaktion darstellt (AUSTIN 1951;
CHANG 1951). Diese befähigt die Spermien zur Penetration durch die Zona pellucida und zur anschließenden Gametenfusion. Bei der Akrosomreaktion kommt es zur Verschmelzung der Plasmamenbran des Spermienkopfes mit der äußeren Akrosommembran und zu anschließender Exozytose akrosomaler Enzyme (BARROS et al. 1967; YANAGIMACHI 1988). Nach Passieren der Zona pellucida erfolgt die Fusion der nebeneinanderliegenden Plasmamembranen von Samenzelle und Oozyte. Aus dem Halsstück der Samenzelle entwickelt sich das Zentriol für die später stattfindende erste Teilung (YLLERA-FERNANDEZ et al. 1992). Durch die Gametenfusion gelangt der Zellkern des Spermiums in die Oozyte, von da an besitzt die Oozyte einen vollständigen Chromosomensatz. Dieser liegt in Form von 2
haploiden Vorkernen vor, die zunächst noch voneinander getrennt sind. Ebenfalls durch die Fusion gelangt ein lösliches zytosolisches Protein („Cytosolic Sperm Factor“, CSF, „oscillin“) aus dem Zytoplasma des Spermiums in die Oozyte (Abbildung 2), was repetitive intrazelluläre Ca2+ Oscillationen auslöst (PARRINGTON et al. 1996; MACHATY et al. 2000; SWANN et al. 2001; SAUNDERS et al. 2002).
CSF besitzt ein relatives Molekulargewicht von 33KDa und befindet sich im Spermienkopf auf Höhe des Äquatorialsegmentes, wo die Spermien-Oozyten-Fusion ihren Anfang nimmt (PARRINGTON et al. 1996). Es wurde gezeigt, dass durch Injektion von porzinem CSF in Oozyten von Rind und Schwein eine vollständige Aktivierung eingeleitet werden kann (MACHATY et al. 2000; KNOTT et al. 2002).
Zunächst glaubte man an ein Protein, das die Phospholipase C (PLC) stimuliert (WU et al. 2001). Später wurde es als eine spermientypische Isoform der Phospholipase C identifiziert, die Phosphatidylinositol4,5-bisphosphat (PIP2) zu Inositol1,4,5- triphosphat (Ins3P) und Diacylglycerin hydrolysiert (SAUNDERS et al. 2002). Ins3P als second messenger aktiviert die Oozyte (INOUE et al. 2002). Durch Bindung an Ins3P-Kalziumkanalrezeptoren kommt es zu einer Erhöhung des intrazellulär verfügbaren Ca2+ (BERRIDGE 1993; MACHATY et al. 1997a). Das freigesetzte Ca2+
wiederum verstärkt die PLC-Aktivität (RICE et al. 2000). Dieses positive Feedback ist ursächlich für die Induktion der Ca2+ Oszillationen, die in der Schweineeizelle bei Eintritt des Spermiums für etwa 2-3 Stunden (SUN et al. 1992; MACHATY et al.
1997a) bis zur Bildung der Vorkerne anhalten (JONES et al. 1995; DAY 2000). Sie werden als das zentral auslösende Signal für die weiteren Vorgänge im Rahmen der Oozyten-Aktivierung angesehen (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992). Die Exozytose der kortikalen Granula führt zu Veränderungen von Oolemm und Zona pellucida. Der Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in den perivitellinen Raum, und es kommt zu physikochemischen und biochemischen Zustandsänderungen der Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida (CRAN u. CHENG 1986).
Hierdurch wird ein Polyspermieblock aufgebaut, der das Eindringen weiterer Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991). Ursächlich für die meiotische Arretierung der gereiften Oozyte ist ein hoher Plasmaspiegel von aktivem „Meiosis Promoting Factor“ (MPF) (NURSE 1990; VERLHAC et al. 1994), einem Komplex aus
einem regulatorischem Protein, dem Cyclin B (GAUTIER et al. 1990), und einem katalytischen Protein, der CdK (Cyclin dependent kinase). Die Aktivität von MPF wird durch die Aneinanderlagerung dieser beiden Proteine aufrechterhalten, wobei der intrazytoplasmatische Abbau von Cyclin B durch einen Cyclin-stabilisierenden Komplex (CsK) unterbunden wird (MASUI 1991; KUBIAK et al. 1993; MASUI 2000).
Als Folge der Ca2+ Oszillationen stimuliert freies Ca2+ Calmodulin-Moleküle, die ihrerseits eine calmodulinabhängige Kinase stimulieren, die den CsK dann inaktiviert (LORCA et al. 1993). Durch intrazytoplasmatischen Abbau sinkt in der Folge der Cyclin B-Plasmaspiegel, was zum MPF-Abbau (Abbildung 2) und schließlich zum Überwinden der meiotischen Arretierung führt (MURRAY 1989).
Abbildung 2: Biochemische Vorgänge bei der Aktivierung der Schweineoozyte durch ein Spermium
MPF CdK + Cyclin B Cyclin B Cyclin B CsK (aktiv) CsK (inaktiv) Calmodulin Calmodulin(Ca2+)
+
+
+
(modifiziert nach SWANN et al. 2001)
Eine wichtige bisher jedoch noch nicht vollständig geklärte Rolle bei der Aktivierung der Schweineoozyte spielt die „Mitogen Activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u.
YANG 1999), die die Oozyte während der meiotischen Arretierung bei hoher Plasmaaktivität vor parthenogenetischer Aktivierung bewahrt (PICARD et al. 1996).
Diese Kinase, deren Aktivitätsabfall mit der Vorkernbildung in Verbindung gebracht wird (MOOS et al. 1995; LIU u. YANG 1999), wird vermutlich durch eine spezifische Proteinkinase C (PKC) inaktiviert (SUN et al. 1999). Dies geschieht bei der Spezies Schwein zeitlich versetzt zur MPF-Inaktivierung (MIYANO et al. 2000). Die Wiederaufnahme der Meiose führt zur Ausschleusung des 2. Polkörpers und zur Ausbildung des weiblichen und männlichen Vorkerns (HANCOCK 1961). Die ersten Vorkerne sind beim Schwein frühestens 6 Stunden nach Besamung bzw. Konzeption zu sehen (HANCOCK 1961; LAURINCIK et al. 1994). Für die Syngamie wandern beide Vorkerne aufeinander zu und verschmelzen miteinander zur diploiden Zygote.
Die erste Furchungsteilung vollzieht sich in Form einer normalen Mitose, und tritt bei der Spezies Schwein etwa 21h nach Konzeption auf (HANCOCK 1961).
2.1.3 Embryonalentwicklung beim Schwein
Die Schweinezygote vollzieht 14-16 h nach der Befruchtung die erste Furchungsteilung, gefolgt von der 2. Teilung nach 20-25 h (HUNTER 1974), die zum 4-Zellembryo führt (Abbildung 3). Dieser tritt nach 46-48 h vom Eileiter in den Uterus über (BRÜSSOW 1985; BAVISTER 1988). Bereits in dieser frühembryonalen Entwicklungsphase findet beim präimplantativen Schweineembryo eine progressive Umstellung von der maternalen zur embryonalen RNA-Synthese statt (TELFORD et al. 1990; JARRELL et al. 1991). Der wachsende porzine Embryo erreicht nach 3-4 Tagen das Entwicklungsstadium der Morula und nach 5 Tagen das der Blastozyste (Abbildung 3). Die Blastozyste schlüpft am 6. Tag aus der Zona pellucida, was auch als „Hatching“ bezeichnet wird (SCHNORR 1996). Bereits in der kompaktierten Morula, sowie deutlicher in der Blastozyste erkennbar, differenziert sich der Embryo in 2 Zellpopulationen, die innere Zellmasse („Inner Cell Mass“ = ICM) und das Trophektoderm (TE, Abbildung 3) (DORST 1991). Der Schweinefetus geht nur aus der ICM hervor, weshalb diese Zellen auch als Embryoblast bezeichnet werden. Aus dem TE bilden sich später die Fruchthüllen, das Chorion- und Amnionepithel (SCHNORR 1996).
Abbildung 3: Präimplantative Stadien des frühen Schweineembryos
Oozyte Metaphase II
arretiert
Zygote
~ 6 Stunden nach Befruchtung
2-Zeller 14-16 Stunden nach Befruchtung
4-Zeller
~20-25 Stunden nach Befruchtung
8-Zeller am 3. Tag nach Befruchtung
Morula am 4. Tag nach Befruchtung
Blastozyste am 5.Tag nach Befruchtung
ICM
TE
(modifiziert nach SCHNORR 1996)
Das uterine Signal zur Luteolyse der Corpora lutea (Gelbkörper), die das Trächtigkeit erhaltende Steroid Progesteron synthetisieren, erfolgt an Tag 14 der Trächtigkeit. Die wichtigste Aufgabe, die porzine Embryonen zunächst für ihre weitere Existenz zu bewältigen haben, ist deshalb die Verhinderung der Luteolyse, um damit die Lebensspanne der Corpora lutea zu verlängern. Hierzu produzieren die Embryonen an Tag 11-12 der Gravidität, dem Stadium, in dem sich der Primitivstreifen bildet, viel Östradiol-17ß (HEAP et al. 1979b; HEAP et al. 1981). Unter dem Einfluss dieses lokal wirkenden Östrogens tritt das endometriale PGF2α, das am Ovar die Luteolyse
hervorruft, aus den Uterusvenen in den arteriellen Schenkel des Gefäßsystems über und gelangt in das Uteruslumen, so dass das Ovar nicht erreicht wird. Aus einem endokrinen wird ein exokriner Sekretionsmodus, und die zyklische Luteolyse bleibt aus. Um genügend Östradiol-17ß zu bilden sind bei der multiparen Spezies Schwein am Tag 10-14 der Gravidität mindestens 4-5 Embryonen nötig (POLGE et al. 1966;
POPE et al. 1972). Zu späteren Zeitpunkten ist die Aufrechterhaltung der Gravidität mit einer geringeren Embryonen- oder Fetenzahl vereinbar. Am 14. Tag der Gravidität, dem Stadium in dem sich das Neuralrohr ausbildet, erfolgt die Anheftung an die uterine Schleimhaut (POPE et al. 1972). Hierzu wachsen die Schweineembryonen, die bis zum 13. Tag der Gravidität die Gestalt einer 2 mm großen kugelförmigen Keimblase aufweisen, innerhalb von 4 Tagen zu schlauchförmigen, bis zu 150 cm langen, Gebilden aus, bei denen der eigentliche Embryo in der Mitte lokalisiert ist. Die Schläuche liegen aufgeknäult im Uterus und entwickeln sich ab dem 20. Tag, durch Weitenzunahme im Mittelteil und Rückbildung an den Enden, zur typischen zweizipfeligen Form. Als Vorstufen der Zotten bilden sich an der Oberfläche Epithelfalten, in die in der 4. Woche Mesenchym einwächst.
Die endgültige Ausbildung und Einsenkung der Chorionzotten in die Uterusschleimhaut erfolgt etwa in der 5. Graviditätswoche. Die Zotten sind bei der Spezies Schwein auf dem Chorion gleichmäßig verteilt, fehlen jedoch an den Enden;
man spricht deshalb von einer Semiplacenta diffusa incompleta. Da an der Plazenta keine Gewebsverluste auftreten, besitzt das Schwein eine Placenta epitheliochorialis (SCHNORR 1996). Bis zum 28 Tag der Gravidität hat der Schweineembryo eine Größe von ca. 23 mm erreicht (KEIBEL 1897). Eine detailliertere Betrachtung des spätembryonalen Wachstums gibt Abbildung 4. Ab dem 30 Tag der Gravidität sind beim späten Schweineembryo alle Organe angelegt, so dass von nun an vom frühen Schweinefetus gesprochen wird, der in der Folge bis zur Geburt an Tag 114 der Gravidität im wesentlichen nur noch ein Größenwachstum erfährt (SCHNORR 1996).
Abbildung 4: Morphologische Veränderungen während der späten Embryonalentwicklung des Schweines
Tag 17:
6,8 mm Körperlänge
Tag 21:
9,6 mm Körperlänge
Tag 22:
12 mm Körperlänge
Tag 25:
19,5 mm Körperlänge
Tag 28:
23 mm Körperlänge
(modifiziert nach KEIBEL 1897)
2.1.4 Relevante Aspekte des Zellzyklus
Jede mitotisch aktive Zelle unterliegt dem Zellzyklus (Abbildung 5), der Zellwachstum und Zellteilung koordiniert. Seine Dauer ist je nach Zelltyp sehr unterschiedlich. Der Zellzyklus frühembryonaler Zellen ist verkürzt, da diese Zellen sich ohne vorheriges Wachstum teilen. Embryonen von Fliegen haben mit etwa 8 Minuten die kürzesten bekannten Zellzyklen, der Zellzyklus von Leberzellen aus einem Säuger kann dagegen länger als ein Jahr dauern (ALBERTS et al. 1995). Im allgemeinen wird der Zellzyklus in 2 Hauptphasen eingeteilt, von denen die Mitose (M-Phase) die eigentliche Zellteilung darstellt. Zu Beginn der Mitose, der Prophase, zerfällt die Kernmembran, der Inhalt des Zellkerns kondensiert zu sichtbaren Chromosomen und zelluläre Mikrotubuli bilden die Mitosespindel, die schließlich die Chromosomen trennt. Daraufhin scheint die Zelle kurz in einem als Metaphase bezeichneten Stadium zu verharren, in welchem die bereits verdoppelten Chromosomen an der Mitosespindel aufgereiht werden. Die Trennung der verdoppelten Chromosomen markiert den Beginn der Anaphase, in der sich die Chromosomen zu den jeweiligen Polen der Spindel hinbewegen, wo sie in der Telophase dekondensieren und neue intakte Zellkerne bilden. In der sich anschließenden Zytokinese teilt sich die Zelle in zwei Tochterzellen, was als das Ende der M-Phase des Zellzyklus betrachtet wird (ALBERTS et al. 1995). Der Zeitabschnitt zwischen den Mitosen, der den größten Teil im Zyklus ausmacht und in dem Zellwachstum und DNA-Replikation erfolgen, bezeichnet man als Interphase. Diese wird in die G1-Phase (engl. gap = Lücke zwischen M-Phase und S-Phase), die S-Phase (Synthesephase) und die G2-Phase (Lücke zwischen S-Phase und M-Phase) unterteilt (ALBERTS et al. 1995). Aus der G1-Phase können die Zellen, z.B. durch Kontaktinhibition oder Serumentzug, in ein Ruhestadium (G0-Phase) gelangen (BOQUEST et al. 1999b) und so den Zellzyklus arretieren, wobei ein länger andauernder Serumentzug bei porzinen Fibroblasten zu apoptotischen Erscheinungen führen kann (KUES et al. 2002). Da die DNA- Replikation in der S-Phase erfolgt, besitzen Zellen in der G0/G1-Phase einen diploiden Chromosomensatz, in der G2- und M-Phase einen tetraploiden Chromosomensatz, sowie in der S-Phase einen DNA-Gehalt, der zwischen diesen Werten liegt (BOQUEST et al. 1999b). Dies wird auch in Abbildung 5 verdeutlicht.
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Zellzyklus einer Säugetierzelle
MPF
CdK +Cyclin (4 C)
(2 C)
(2-4 C)
C: Chromosomensatz, MPF (Meiosis Promoting Factor), CdK (Cyclin dependent Kinase) (modifiziert nach ALBERTS et al. 1995)
Die Meiose der Säugeroozyte kann als eine Abfolge von 2 Zellzyklen betrachtet werden, wobei die S-Phase der 2. meiotischen Reifeteilung entfällt, was einen haploiden Chromosomensatz des Ovums zur Folge hat (SCHNORR 1996).
Schlüsselprotein zur Kontrolle des Zellzyklus ist der „Meiosis Promoting Factor“
(MPF). Nur die hohe Aktivität dieses Komplexes aus einer „Cyclin dependent kinase“
(CdK) und einem regulatorischen Cyclin erlaubt es der Zelle von der G2-Phase in die
M-Phase fortzuschreiten; nur ein niedriger Spiegel an aktivem MPF erlaubt ein Verlassen der Mitose (ALBERTS et al. 1995). So verhindert bei der Metaphase II- arretierten Säugeroozyte ein Cyclin stabilisierender Komplex den Abbau des Cyclins (MASUI 1991), was einen vorzeitigen Eintritt in die Interphase ohne Befruchtung verhindert. Aktives MPF besitzt Proteinkinaseaktivität; es induziert die Aufösung der Kernmembran durch Phosphorylierung von Serin-Resten an Lamin-Molekülen, lässt durch Phosphorylierung Mikrotubuli-assoziierter Proteine die Mitosespindel entstehen und führt über direkte oder indirekte Phosphorylierung von Histon H1, das an der Verpackung der DNA in Nucleosomen beteiligt ist, zur DNA Kondensation (WEHNER u. GEHRING 1995; ALBERTS et al. 1995). Da der Cyclingehalt zyklischen Schwankungen unterworfen ist, stellt Cyclin den eigentlichen Taktgeber des Zellzyklus dar. In der G2-Phase wird Cyclin durch Proteinbiosynthese angereichert und bildet mit CdK Molekülen den MPF-Komplex. Dieser wird durch Abbau von Cyclin zwischen Meta- und Anaphase inaktiviert, was die Zelle in die Interphase eintreten lässt (MURRAY 1989). Bei der gereiften Schweineoozyte unterscheidet man zwischen aktivem- und inaktivem MPF (preMPF). Entscheidend ist das Phosphorylierungsmuster; aktiver MPF ist stets am Threoninrest 14 und Thymidinrest 15 dephosphoryliert, und am Threoninrest 161 phosphoryliert (KIKUCHI et al. 2000; KIKUCHI et al. 2002). Wenn gereifte Schweineoozyten, die einen hohen Spiegel an aktivem MPF aufweisen (VERLHAC et al. 1994; KIKUCHI et al. 2000), spät oder gar nicht aktiviert werden, sinkt durch Änderungen des Phosphorylierungsmusters das Verhältnis von aktivem MPF zugunsten des Anteils an pre-MPF (KIKUCHI et al. 1999) ohne Veränderung der MPF-Gesamtmenge (KIKUCHI et al. 2002). Dieser Aktivitätsverlust führt neben spontanem Eintritt in die Interphase zu erhöhten Aktivierungsraten bei gleichzeitig vermindertem Entwicklungspotential und erhöhten Fragmentationsraten nach artifizieller Aktivierung (KIKUCHI et al. 2000). Die Gesamtheit dieser Alterungserscheinungen werden als
„Aging“ bezeichnet (KIKUCHI et al. 2000; FISSORE et al. 2002). Bei der Spezies Schwein sind bei gealterten Oozyten mitochondriale Dysfunktionen (GREEN u.
REED 1998; WANG 2001) und veränderte Mitosespindeln (FISSORE et al. 2002) beschrieben worden.
2.2 Biotechnologische Grundlagen
2.2.1 In-vitro-Reifung porziner Oozyten
Für die IVM (In vitro Maturation) werden primäre Oozyten im Germinal-Vesikel- Stadium (GV-Stadium) (MOOR u. GANDOLFI 1987) aus Ovarien geschlachteter Sauen durch Aspritation aus 2-5 mm großen Follikeln gewonnen und in geeigneten Reifungsmedien inkubiert. Oozyten aus kleineren Follikeln können zur Zeit noch nicht verwendet werden, da sie eine verminderte Kompetenz zur Fortsetzung der Meiose besitzen (MOTLIK et al. 1984; MARCHAL et al. 2002) und nach IVF (In-vitro- Fertilisation) nur zu einem geringeren Anteil das Blastozystenstadium erreichen (MARCHAL et al. 2002). Oozyten aus den Ovarien postpuberaler Sauen reifen dabei schneller (TAKAHASHI u. NAGAI 1990) und weisen ein höheres Entwicklungspotential auf als Oozyten präpuberaler Sauen (MARCHAL et al. 2001).
Es wird zwischen Kernreifung und zytoplasmatischer Reifung unterschieden. Die Kernreifung beinhaltet die Wiederaufnahme der ersten meiotischen Reifeteilung, die Ausschleusung des 1. Polkörpers, sowie das Fortschreiten der 2. meiotischen Reifeteilung bis zur Metaphase, und ist bei Schweineoozyten bereits nach 36 h vollendet, während die zytoplasmatische Reifung, die mit morphologischen Veränderungen im Verteilungsmuster der Mitochondrien und der kortikalen Granula einhergeht (MOOR et al. 1990), frühestens nach 44 h abgeschlossen ist (zum Überblick: PRATHER u. DAY 1998). Bei der Reifung porziner Oozyten sollte der osmotische Druck des Mediums 265 bis 355 mOsmol (optimal 285 mOsmol) betragen (McGAUGHEY u. VAN BLERKOM 1977) und der pH-Wert auf 7,2-7,4 eingestellt sein (SATO u. KOIDE 1987). Als optimal gilt eine Temperatur von 38,5- 39°C (CRAN u. CHENG 1985; YOSHIDA 1987) bei einer Gasatmosphäre von 5%
CO2 (TSAFRIRI u. CHANNING 1975). Das Ölüberschichten des Reifungsmediums ist mit verzögerter Kernreifung und einem geringeren Entwicklungspotential in Verbindung gebracht worden. Hierbei wird die Diffusion von Steroiden aus dem Reifungsmedium in das Öl diskutiert (SHIMADA et al. 2002). Unterschiedliche Medien wurden verwendet: Krebs Ringer Bicarbonatlösung (NAITO et al. 1988), Waymouth Medium (HIRAO et al. 1994; KIKUCHI et al. 1995), Tissue Culture
Medium (TCM)199 (MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1989; FUNAHASHI u. DAY 1993; GRUPEN et al. 1995), North Carolina State Universiy (NCSU) Medium 23 (ABEYDEERA u. DAY 1997; BOQUEST et al. 1999a) und NCSU37 (PETTERS u.
WELLS 1993; FUNAHASHI et al. 1997; RATH et al. 1999; LONG et al. 1999). Die Medien, die auf TCM199 und NCSU basieren, werden heute vielfach als Standardmedien zur Reifung von Schweineoozyten eingesetzt. In Tabelle 1 wird ein Überblick über die Reifungsergebnisse verschiedener Autorengruppen gegeben.
Eine Verbesserung der Reifung porziner Eizellen wurde durch Zusatz porziner Follikelflüssigkeit (pFF) als Proteinquelle erzielt (NAITO et al. 1988; YOSHIDA et al.
1992; ABEYDEERA et al. 1998a; VATZIAS u. HAGEN 1999; RATH et al. 1999).
Morphologisch intakte Oozyten sollten ein fein granuliertes Zytoplasma und mindestens 3 Lagen an Kumuluszellen besitzen (LEIBFRIED u. FIRST 1979), wobei einer ausreichenden Zahl an Kumuluszellen besondere Bedeutung zukommt (MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1988; MOOR et al. 1990; THOMAS u. SEIDEL, JR. 1993). Diese fördern aufgrund ihrer metabolischen Kapazität (TANGHE et al.
2002), über ein Netzwerk an Gap junctions zwischen Kumuluszellen und Oozyte (MOOR et al. 1980; EPPIG 1982), die zytoplasmatische Reifung durch einen direkten Substanztransfer. Die Kumuluszellen sind auch an der meiotischen Arretierung der Oozyte in der Prophase der 1. meiotischen Reifeteilung beteiligt. Von den Kumuluszellen befreit, nehmen einige Schweineoozyten spontan die Meiose wieder auf (NAGAI et al. 1993). Dies wird als passive Reaktion auf die Abwesenheit einer Meiosis Inhibiting Substance gedeutet (THIBAULT et al. 1987). Beim Schwein wird dem Transport von cAMP über die Gap junctions in die Eizelle eine Beteiligung an der Aufrechterhaltung der meiotischen Arretierung zugeschrieben (KUMAR u.
GILULA 1996). Da in kleinen Follikeln stetig geringe Mengen an cAMP von den Kumuluszellen in die Eizelle transportiert werden, um diese in der Prophase zu arretieren (DEKEL 1988), gilt die Aufrechterhaltung eines optimalen intrazellulären cAMP-Spiegels als Voraussetzung, um der Eizelle eine zytoplasmatische Reifung zu ermöglichen (LUCIANO et al. 1999). Vermutlich führt deshalb ein cAMP-Zusatz zum Reifungsmedium für die ersten 20 h der Reifung zu einer verbesserten präimplantativen Entwicklung bei der Spezies Schwein (FUNAHASHI et al. 1997).
RR (%) 71 53-72 87-100 80 85 71 90 70 96 60
Inkubations- bedingungen 46-48 h, 39°C 32 h, 39°C 47-48 h, 39°C 44-48 h, 39°C 44 h, 39°C 36 h, 39°C 36 h, 38°C 48 h, 39°C 47 h, 39°C 48 h, 39°C
Reifungsmedien TCM199 + Glutamin + Hepes +15%CBS TCM 199 + Hepes + LH + PS + Estradiol TCM199 + FSH + LH + Prolaktin + Glutamin + 5%FCS + 5%NBCS TCM199 + 15%NPS TCM199 + pFSH + LH +10%FCS TCM199 + eCG + hCG + Estradiol + 10%FCS TCM199 + eCG + hCG + Estradiol + 10% pFF + 10%FCS TCM199 + FSH + LH + Prolaktin + Glutamin + 5%FCS + 5%NBCS TCM199 + pFSH + LH + Glutamin + Vit.C + Insulin +10%FCS TCM199 + 10%FCS + pFF + FSH
Tabelle 1: Reifungsergebnisse porziner Oozyten Autor ENG et al. 1986 NAGAI et al. 1988 NAGAI u. MOOR 1990 NAKANISHI et al. 1990 GALEATI et al. 1991 WANG et al. 1991 YOSHIDA et al. 1990 DING et al. 1992 DING u. FOXCROFT 1994 RATH et al. 1995a RR (Reifungsrate), CBS (Castrated Boar Serum), FCS (Fetal Calf Serum), NBCS (Newborn Calf Serum) NPS (Newborn Piglet Serum), pFF (porzine Follikelflüssigkeit)
RR(%) 87 93 83,6 80-87 78-89 79 90 85,2 71-82 71-84
Inkubations- bedingungen 44 h, 39°C 44 h, 39°C 20h, 39°C, 24h ohne Hormone + cAMP 44 h, 39°C 20 h, 39°C, weitere 22 h ohne Hormone 44 h 39°C 22 h, 39°C, weitere 22 h ohne Hormone 20 h, 39°C, 22h ohne Hormone + cAMP 22 h, 39°C, weitere 20 h ohne Hormone 22 h, 39°C, weitere 20 h ohne Hormone
Reifungsmedien TCM199 + eCG + hCG + Cystein + 10%pFF NCSU23 + eCG + hCG + Cystein + 10%pFF NCSU37 + ß-Merkaptoethanol + Cystein + Insulin +10%pFF + eCG + hCG + cAMP BSA freies NCSU23 + Cystein + eCG + hCG + 10%pFF NCSU23 + Cystein + LH + FSH + pFF TCM199 + Cystein + EGF + LH + FSH BSA freies NCSU23 + Cystein + EGF + eCG + hCG + pFF TCM199 + Cystein + EGF + eCG + hCG + pFF+cAMP BSA freies NCSU23 + EGF+ eCG + hCG + pFF TCM199 + EGF + eCG + hCG + pFF
Fortsetzung Tabelle 1: Reifungsergebnisse porziner Oozyten Autoren WANG et al. 1997 FUNAHASHI et al. 1997 ABEYDEERA et al. 1998b ABEYDEERA et al. 1999 ABEYDEERA et al. 2001 ZHU et al. 2002 MIYOSHI et al. 2002 HYUN et al. 2003b RR (Reifungsrate), pFF (porzine Follikelflüssigkeit)
Als Antwort auf den präovulatorischen Gonadotropin-Impuls wird die meiotische Arretierung aufgehoben und die Kumuluszellen beginnen mit der Produktion von Hyaluronsäure, die in den interzellulären Räumen gelangt und zur Kumulusexpansion führt (CHEN et al. 1990; MATTIOLI et al. 1994).
Der Zusatz von FSH und LH, sowie deren Analoga PMSG und hCG, zum Reifungsmedium führt bei den Oozyten vieler Säugetiere zu einer Verbesserung der Kumulusexpansion und der Spermienpenetration nach IVF (In vitro Fertilization) (EPPIG 1979; MOOR et al. 1980). Die Vorkernbildungsraten werden bei der Spezies Schwein optimiert, wenn die Hormone sich für die ersten 20h der Reifung im Medium befinden (FUNAHASHI u. DAY 1993). Ebenfalls einen günstigen Einfluss auf die Kumulus-Expansion und die präimplantative Entwicklung der Schweineembryonen nach IVF übt der Epidermal Growth Factor (EGF) aus (DING u. FOXCROFT 1994;
SINGH et al. 1997; ABEYDEERA et al. 1998b; ABEYDEERA et al. 2000). Durch die Kumulusexpansion werden die Gap-junctions zu den äußeren Kumuluszellen unterbrochen (WERT u. LARSEN 1989; SUZUKI et al. 2000). Wahrscheinlich wird hierdurch auch die Überführung von Meiosis-Inhibitory Signalen unterbunden (ISOBE et al. 1998). Letztlich sind die Gap junctions auf die Corona radiata beschränkt (MATTIOLI 2000), wohingegen die Kumulus-Kumulus-Verbindungen intakt bleiben (SUZUKI et al. 2000). Für eine vollständige Zytoplasmareifung der Schweineoozyten müssen anheftende Kumuluszellen vorhanden sein (YAMAUCHI u. NAGAI 1999), da diese die weitere Entwicklung fördern (NAGAI 2001). Vermutet werden intrazelluläre Einflüsse auf pH-Wert und Ca2+ Konzentration (YAMAUCHI u. NAGAI 1999; MORI et al. 2000). Glucose kann von der Schweineoozyte nicht verstoffwechselt werden. Sie ist auf Pyruvat als Energiesubstrat angewiesen, das die Kumuluszellen aus Glucose metabolisieren (TANGHE et al. 2002).
Die Kumuluszellen erhöhen darüber hinaus den intrazellulären Glutathion (GSH)- Gehalt in porzinen Oozyten (YAMAUCHI u. NAGAI 1999), der auch als Indikator für eine vollständige zytoplasmatische Reifung angesehen wird (YOSHIDA 1993).
Glutathion reduziert die Disulfidbrücken in den Protaminen, was zur Dekondensation der Spermienköpfe führt (MAHI u. YANAGIMACHI 1975), und trägt so zur Ausbildung der männlichen Vorkerne („male pronuclei“, MPN) bei. GSH stimuliert den
Aminosäuretransport, sowie die Proteinsynthese und schützt die Zelle durch Bindung freier Radikale vor oxidativem Stress (MEISTER 1983; YOSHIDA et al. 1993;
TATEMOTO et al. 2000). Mauszygoten, die transgen für eine Überexpression der GSH-Synthetase sind, zeigten unter suboptimalen Kulturbedingungen eine deutlich bessere Entwicklung als normale Zygoten (RZUCIDLO u. BRACKETT 2000).
Cysteinzusatz im Reifungsmedium kann von Schweineoozyten direkt aufgenommen werden und bewirkt metabolisiert eine Erhöhung des GSH Gehaltes (YOSHIDA et al.
1993; ABEYDEERA et al. 1999). Allerdings wird Cystein unter in Vitro Bedingungen durch Sauerstoff zu Cystin oxidiert (MOHINDRU et al. 1985), was nur von den Kumuluszellen aufgenommen werden kann und über Gap junctions an die Oozyte weitergeleitet wird. Durch Zusatz von ß-Merkaptoethanol (ABEYDEERA et al. 1998a;
TAKAHASHI et al. 2002) oder Cysteamin (GRUPEN et al. 1995; YAMAUCHI u.
NAGAI 1999) wird Cystin teilweise wieder zu Cystein reduziert. In NCSU23 gereifte Schweineoozyten zeigen einen höheren GSH Gehalt als Oozyten, die in Whittens Medium und TCM 199 gereift werden, sowie eine bessere Entwicklung zur Blastozyste (WANG et al. 1997). Organische Osmolyte, wie Taurin und Sorbitol (z.B in NCSU37), erhöhen den GSH Gehalt der Oozyte ebenfalls (FUNAHASHI et al.
1996). Dennoch weisen in vitro gereifte Schweineoozyten, verglichen mit in vivo gereiften Oozyten, nur 25% des Gehaltes an GSH auf (BRAD et al. 2003). Sie zeigen geringere Penetrationsraten, verzögerte und asynchrone Vorkernentwicklungen und geringere Teilungsraten nach IVF (LAURINCIK et al. 1994), sowie geringere Blastozystenraten (NAGASHIMA et al. 1996). Während in vivo maturierte Oozyten häufig helle Areale im Cortex-Bereich aufweisen, fehlten diese bei in vitro maturierten Oozyten. In vivo maturierte Schweineoozyten sind größer (176mm vs. 149µm) und besitzen einen weiteren perivitellinen Spalt (2.4µm vs. 3.1µm) als in vitro gereifte Oozyten (WANG et al. 1998b). In vitro gereifte Oozyten weisen zudem häufig Chromosomenabnormalitäten auf (SOSNOWSKI et al. 2003). Dennoch wurden im Jahre 1989 die ersten Ferkel aus Embryonentransfer nach In-vitro-Maturation (IVM) und In-vitro-Fertilisation (IVF) geboren (MATTIOLI et al. 1989). Später sind in vitro gereifte Oozyten mit Erfolg verwendet worden, um transgene (CABOT et al. 2001) und geklonte Schweine (BETTHAUSER et al. 2000) zu produzieren.
2.2.2 In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen
Bei der In-vitro-Kultur (IVC: „In Vitro Culture“) porziner Embryonen ist oft eine Entwicklungsblockade im Vierzellstadium (Vierzellblock) beschrieben worden (BAVISTER 1988; BAVISTER 1995), der durch Zusatz von Taurin und Hypotaurin zum Kulturmedium jedoch überwunden werden konnte (PETTERS u. REED 1991).
Porzine Embryonen besitzen das Potential sich in Gegenwart von Glucose und Glutamin als Energiequelle in vitro bis zur Blastozyste (Abbildung 6) zu entwickeln (PETTERS et al. 1990) und zu schlüpfen (Abbildung 7). Zusätzlich wurde berichtet, dass Serumzugaben zum Kulturmedium einen positiven Einfluss auf die Entwicklung zur Blastozyste ausüben (PETTERS u. WELLS 1993). Ein Austausch des Serums durch BSA (Bovines Serum Albumin) erhöht die Blastozystenraten (DOBRINSKY et al. 1996), verringert jedoch das Verhältnis von ICM zu TE (RATH et al. 1995b). Als Basismedien für die Kultur porziner Embryonen wurden Whitten’s Medium (WHITTEN u. BIGGERS 1968), BECM-3 (DOBRINSKY et al. 1996), NCSU23 (PETTERS u. WELLS 1993) und SOF (Synthetic Oviductal Fluid)(MARCHAL et al.
2001) eingesetzt, die als Proteinquelle allesamt Serumbestandteile (BSA) enthalten.
Dies erschwert die Standardisierung der Kultur, da Serumchargen erheblich in ihrer Zusammensetzung variieren können (KANE 1983; BAVISTER 1995). Aus diesem Grund wurde das definierte „Porcine Zygote Medium“ (PZM) entwickelt (YOSHIOKA et al. 2002). Obwohl viele verschiedene Kulturmedien entwickelt worden sind, zeigen in vitro kultivierte porzine Embryonen nach Embryotransfer ein geringeres Entwicklungspotential als Embryonen, die zuvor aus dem Genitaltrakt trächtiger Tiere gewonnen wurden (HYTTEL u. NIEMANN 1990). Eine mögliche Ursache wird in einem negativen Einfluss des Kulturmediums auf die Struktur der Mikrofilamente gesehen (zum Überblick: NIEMANN u. RATH 2001b). Nach In-vitro-Fertilisation und anschließender In-vitro-Kultur porziner Embryonen konnten Blastozystenraten von bis zu 50% erreicht werden (WANG u. DAY 2002). In vitro kultivierte Embryonen zeigen jedoch eine geringere Gesamtzellzahl als gleichalte in vivo kultivierte Embryonen, sowie ein geringeres Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (RATH et al.
1995b; MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002).
Abbildung 6: In vitro kultivierte Blastozyste vom Schwein an Tag 6 nach Befruchtung
Abbildung 7: In vitro kultivierte „geschlüpfte“ Blastozyste vom Schwein an Tag 7 nach Befruchtung
In Anlehnung an Milieuveränderungen, die der Embryo beim Übertritt vom Eileiter in den Uterus erfährt, wurde ein zweiphasiges Kultursystem entwickelt, bei dem Pyruvat/Lactat Glucose als Energiequelle für die ersten 3 Tage ersetzt. Dies kann die präimplantative Entwicklung verbessern (KIKUCHI et al. 2002), was kürzlich auch für KT-Embryonen gezeigt wurde (LEE et al. 2003a). Ebenfalls deuten neuere Ergebnisse von NGUYEN et al. (2003) an, dass der porzine Embryo während der ersten 48 h seiner Entwicklung andere Anforderungen an die Osmolarität stellt, als zu späteren Entwicklungsphasen.
2.2.3 Parthenogenetische Entwicklung beim Schwein
Die Parthenogenese ist definiert als reduzierte Form der Fortpflanzung, bei der die Oozyte ohne vorherige Vereinigung mit der männlichen Geschlechtszelle aktiviert wird und die Embryonalentwicklung aus einer unbefruchteten Oozyte beginnt (WEHNER u. GEHRING 1995). Bei der typischen Parthenogenese sind 2 Phänomene abzugrenzen: Bei der Gynogenese wird die Oozyte durch ein Spermium aktiviert, ohne dass männliches genetisches Material beigesteuert wird. Bei der Androgenese entwickelt sich nach Eindringen des Spermiums nur der männliche Vorkern weiter (KAUFMAN u. SACHS 1976). Im Tierreich ist die Parthenogenese, mit Ausnahme des Säugers, eine relativ weit verbreitete Art der Reproduktion.
Natürlicherweise kommt sie bei verschiedenen Insekten, Reptilien und Fischen vor (WEHNER u. GEHRING 1995). In der Literatur wird auch über Parthenogenese bei Hühnern (OLSEN 1966) und Truthühnern (DARCEY et al. 1971) berichtet. Durch Ausbleiben der meiotischen Teilung, sowie durch Retention des Polkörpers, kann ein
aber schwere Abnormalitäten, wie Herz- und Leberzysten, sowie eine reduzierte diploider Chromosomensatz gebildet werden (zur Übersicht KAUFMAN u. SACHS 1976). Im Jahre 1970 wurde eine parthenogenetische Entwicklung erstmalig bei der Maus experimentell ausgelöst (TARKOWSKI et al. 1970). Die Parthenogenese kann auch beim Schwein durch eine artifizielle nicht Spermium-induzierte Aktivierung ausgelöst werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE-BAYASHI et al. 2000).
Solche Embryonen können sich nach Embryotransfer auf ein synchronisiertes Empfängertier bis ins postimplantative Stadium (min. Tag 29) entwickeln. Sie zeigen
Ausbildung der Kopfregion, oder sogar Kopflosigkeit (KURE-BAYASHI et al. 2000).
Da für eine vollständige Entwicklung bei Säugetieren männlich- und weiblich geprägte Genome erforderlich sind (SURANI et al. 1984; SURANI et al. 1990), ist über eine vollständige parthenogenetische Entwicklung mit der Geburt normaler
achkommen bei Säugetieren bisher nicht berichtet worden.
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Untersuchungen zum n. Nach
Austausch der Chromosomen durch Kerntransfer müssen die rekonstruierten Kerntransferkomplexe für eine weitere Entwicklung aktiviert werden (BETT
et al. 2000). Zusätzlich werden parthenogenetisch aktivierte Oozyten als Kontrollgruppe zu Kerntransferembryonen genutzt (BETTHAUSER et al. 2000; KOO et al. 2000). Daher wurden er letzten Jahre t, um
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physikalisch Elektrostimulation JOLLIFF u. PRATHER 1997 Ca2+-Ionophor WANG et al. 1998c
Ethanol DIDION et al. 1990 chemisch
Thimerosal MACHATY et al. 1997b Protein-Synthese-Inhibitoren NUSSBAUM u. PRATHER 1995
Protein-Kinase-Inhibitoren MAYES et al. 1995 GTP-Injektion MACHATY et al. 1995 Inositol-1,4,5-Triphosphat-Injektion MACHATY et al. 1997a
CSF-Injektion MACHATY et al. 1997a biochemisch
CaCl2-Injektion MACHATY et al. 1996
Da bei der Befruchtung intrazytoplasmatische Ca2+-Oszillationen einen Impuls von zentraler Bedeutung darstellen (WHITAKER u. SWANN 1993), führen die meisten Aktivierungsprotokolle zu einer intraooplasmatischen Ca2+ Erhöhung, die in der Schweineoozyte die erfolgreiche Befruchtung durch ein Spermium simulieren soll.
Während die spermieninduzierte Aktivierung jedoch zu Ca2+-Oszillationen führt, die in der porzinen Oozyte für 2-3 h anhalten (MACHATY et al. 1997a), tritt bei der artifiziellen Aktivierung ein konstanter Anstieg des intrazellulären Kalziums ein, der nach einer Plateauphase wieder abfällt (SUN et al. 1992; RICKORDS u. WHITE 1992; TESARIK u. TESTART 1994; TESARIK et al. 1994). Eine intrazytoplasmatische Ca2+-Injektion bei Oozyten verschiedener Spezies induziert die Aktivierung (FULTON u. WHITTINGHAM 1978; IGUSA u. MIYAZAKI 1983). Bei der Schweineoozyte führt eine solche Behandlung zur Exozytose kortikaler Granula und zum Beginn der präimplantativen Entwicklung (MACHATY et al. 1996). Weniger aufwendig kann auf physikalischem Weg, durch einen kurzzeitigen DC Puls im elektrischem Feld, die Bildung von Membranporen in der Oozyte induziert werden (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). In Medien mit hohen Ca2+-Konzentration ermöglichen diese Poren einen transmembranen Ca2+-Influx der erfolgreich zur Aktivierung bei verschiedenen Säugetierspezies eingesetzt wurde (TARKOWSKI et al. 1970; PRATHER et al. 1989a). Obwohl die Ca2+-Quelle extrazellulär liegt, glaubt man, dass die Elektroportation bei der Schweineoozyte ebenfalls zu einer Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern führt (MACHATY et al. 1999). Die elektrische Aktivierung erlaubt eine präimplantative Entwicklung, obwohl sie nur selten zur Ausschleusung des Polkörpers und zu keinem Polyspermieblock führt (WANG et al. 1998c; ZHU et al. 2002). Die Effizienz korreliert mit gewissen Ca2+- Konzentration im Extrazellularraum (CHEONG et al. 2002).
Eine Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels gelingt darüber hinaus auf chemischem Weg durch Einsatz von Ca-Ionophor A23187 (IONO), das intrazellulär Ca2+-Ionen über Membrankompartimente hinweg transportiert, und dadurch die Verteilung zwischen den Kompartimenten zugunsten des Zytoplasmas verändert.
Dies löst in vielen Säugerspezies die Exozytose der kortikalen Granula und die Ausschleusung des 2. Polkörpers aus und ermöglicht eine präimplantative
Entwicklung (STEINHARDT et al. 1974; DUCIBELLA et al. 1990; KLINE u. KLINE 1992; WANG et al. 1998c). Obwohl Ca-Ionophor A23187 in den meisten Oozyten auch bei Abwesenheit extrazellulären Kalziums eine Aktivierung induziert, zeigen Schweineoozyten in Ca2+ freiem Medium signifikant schwächere Ca2+-Oszillationen als in Ca2+ supplementiertem Medium (SHINA et al. 1993; WANG et al. 1999).
Vermutlich kann das Ca-Ionophor auch einen Übertritt von extrazellulärem Ca2+ über das Oolemm fördern. Thimerosal (TIM), eine organische Quecksilberverbindung, oxidiert Sulfhydrylgruppen an Rezeptoren intrazellulärer Ca2+-Speicher und mobilisiert so deren Ausschüttung (SWANN 1991; FISSORE u. ROBL 1993). Diese Wirkung muss bei der Schweineoozyte nach ca. 10 Minuten durch den Antagonisten Dithiolthreitol (DTT), eine sulfhydrylreduzierende Substanz, wieder aufgehoben werden, da sonst die meiotische Spindel zerstört werden kann (MACHATY et al.
1997b). Da sich auf der Oberfläche der intrazellulären Ca2+-Speicher Inositol3- Phosphat- (Ins3P) und Ryanodinrezeptoren befinden, führt bei porzinen Oozyten auch eine Injektion mit ADP-Ribose oder Ins3P zur Ausschüttung der Ca2+-Speicher (MACHATY et al. 1997a). Darüber hinaus stimuliert Ethanol als temporärer Medienzusatz die intrazelluläre Ins3P-Bildung in porzinen Oozyten, was durch seine Wirkung auf den oben angeführten Rezeptor die präimplantative Entwicklung einleitet (CUTHBERTSON 1983). MACHATY et al. (1995) konnten durch Injektion von GTP (Guanosintriphosphat) intrazelluläre G-Proteine in porzinen Oozyten stimulieren, die ihrerseits die Phospholipase C stimulieren (GILMAN 1987), die wiederum die Synthese von Ins3P katalysiert (MACHATY et al. 1995). Mit dem Ziel, die Aktivierungskaskade an einem Kontrollpunkt zu beginnen, der den physiologischen Verhältnissen möglichst nahe kommt, injizierten MACHATY et al. (2000) und SAUNDERS et al. (2002) Schweineoozyten einen Extrakt aus porzinem Ejakulat („Cytosolic Sperm Factor“, CSF), der zuvor von Kern-DNA befreit worden war. Damit wurden ähnliche Verhältnisse wie bei der physiologischen Aktivierung ausgelöst (MACHATY et al. 2000). Durch porzinen CSF wurde darüberhinaus sogar in bovinen Oozyten die Embryonalentwicklung ausgelöst (KNOTT et al. 2002), was auf speziesübergreifende Mechanismen hindeutet. Darüber hinaus wurden Stimulantien an Kontrollpunkten jenseits der Ca2+-Ausschüttung eingesetzt. Mit der Hemmung der
Proteinsynthese wird die Produktion von Cyclin B1 unterbunden, das ein Bestandteil vom MPF ist. Ohne kontinuierliche Produktion von Cyclin B1 sinkt der Plasmaspiegel an aktivem MPF, und die Oozyte gelangt in die Interphase.
Proteinsyntheseinhibitoren, wie Cycloheximide (CYCLO) und Puromycin, aktivierten Oozyten von Mensch und Maus (SIRACUSA et al. 1978), waren jedoch ohne Effekt bei Rind und Schwein (NUSSBAUM u. PRATHER 1995). Bei den Oozyten der meisten Säugetierarten ist die Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors mit einem Ca2+-mobilisierenden Stimulus deutlich effektiver in der Aktivierung (NUSSBAUM u. PRATHER 1995; PRESICCE u. YANG 1994; TANAKA u.
KANAGAWA 1997).
Durch die Inhibition von Proteinkinasen, vor allem der „Mitogen Activated Protein Kinase“ (MAPK), können die Oozyten vieler Spezies aktiviert werden. So führt die Inhibierung allgemeiner Proteinkinasen mit 6-Dimethylaminopurin (DMAP)
ZÖLLÖSIS et al. 1993), H7 (5-Isoquinolinesulfonyl-2-Methylpiperazin) (MAYES et l. 1995), oder Staurosporine (RICKORDS et al. 1992) zur Aufhebung der
eiotischen Arretierung. In Folge der Protein-Kinase-Inhibition ist bei der Oozyte des chweins weder eine Exozytose der kortikalen Granula noch eine Entwicklung bis ur Blastozyste zu beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass damit nur ein Teil er Aktivierungskomponente ausgelöst werden kann (MAYES et al. 1995; GREEN et al. 1999). Bei Rind und Schwein wurden Kombinationen von Ca-Ionophor zusammen 998;
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mit 6-DMAP erfolgreich zur Aktivierung von Oozyten eingesetzt (RHO et al. 1 BETTHAUSER et al. 2000; CHUNG et al. 2000; BOQUEST et al. 2002). Einige Autoren aktivierten porzine Oozyten zudem durch eine Elektrostimulation, gefolgt von einer Inkubation in Gegenwart von 6-DMAP (GRUPEN et al. 2002; ROH u. HWANG 2002).
2.2.4 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen Da die Entwicklung der parthenogenetischen Embryonen unter anderem durch die Oozytenherkunft, den Aktivierungsstimuls und das Kulturmedium beeinflusst wird, sind Literaturangaben nur schwer miteinander vergleichbar. Unterschiedliche elektrische oder chemische Stimuli bewirkten beim Schwein parthenogenetische Entwicklungen mit zunächst Vorkernstadien (HAGEN et al. 1991). Mit der Weiterentwicklung der IVC konnten sich die aktivierten Oozyten zu frühen Teilungsstadien (LIU u. MOOR 1997), sowie später zu parthenogenetischen Blastozysten, weiterentwickeln (NUSSBAUM u. PRATHER 1995; KURE-BAYASHI et al. 1996; MACHATY et al. 1997b). Tabelle 3 stellt parthenogenetische Entwicklungsraten porziner Embryonen von verschiedenen Autoren dar. Es wurde gezeigt, dass sich parthenogenetische Embryonen mit diploidem Chromosomensatz besser entwickeln als solche mit haploidem Chromosomensatz (KURE-BAYASHI et al. 1996). Parthenogenetische Embryonen zeigten in verschiedenen Versuchsreihen nach der Aktivierung vergleichbare Teilungsraten wie KT-Embryonen (KOO et al.
2000; PARK et al. 2001b), erreichten jedoch zu einem wesentlich höheren Prozentsatz als KT-Embryonen das Blastozystenstadium (BETTHAUSER et al. 2000;
KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b), wobei die durchschnittliche Kernzahl arthenogenetischer Blastozysten geringer ist als bei Blastozysten aus IVF (WANG et al. 1998a; KOO et al. 2000). Unterschiede in der Entwicklung zu KT- und IVF- Embryonen werden unter anderem auf das Fehlen eines paternalen Genoms (SURANI et al. 1984; SURANI et al. 1990), auf ein verändertes Energiestoffwechselprofil (SWAIN et al. 2002), sowie auf einen potentiell haploiden Chromosomensatz (KURE-BAYASHI et al. 1996) zurückgeführt. Deshalb können Erkenntnisse, die an parthenogenetischem Embryonen gewonnen werden, nur mit Vorsicht auf KT-Embryonen übertragen werden. Trotz dieser Unzulänglichkeiten werden parthenogenetisch aktivierte Oozyten häufig als Kontrollgruppe zu Embryonen aus KT und IVF eingesetzt (BETTHAUSER et al. 2000; KOO et al. 2000;
PARK et al. 2001b).
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