Parthenogenetische Entwicklung beim Schwein

Die Parthenogenese ist definiert als reduzierte Form der Fortpflanzung, bei der die Oozyte ohne vorherige Vereinigung mit der männlichen Geschlechtszelle aktiviert wird und die Embryonalentwicklung aus einer unbefruchteten Oozyte beginnt (WEHNER u. GEHRING 1995). Bei der typischen Parthenogenese sind 2 Phänomene abzugrenzen: Bei der Gynogenese wird die Oozyte durch ein Spermium aktiviert, ohne dass männliches genetisches Material beigesteuert wird. Bei der Androgenese entwickelt sich nach Eindringen des Spermiums nur der männliche Vorkern weiter (KAUFMAN u. SACHS 1976). Im Tierreich ist die Parthenogenese, mit Ausnahme des Säugers, eine relativ weit verbreitete Art der Reproduktion.

Natürlicherweise kommt sie bei verschiedenen Insekten, Reptilien und Fischen vor (WEHNER u. GEHRING 1995). In der Literatur wird auch über Parthenogenese bei Hühnern (OLSEN 1966) und Truthühnern (DARCEY et al. 1971) berichtet. Durch Ausbleiben der meiotischen Teilung, sowie durch Retention des Polkörpers, kann ein

aber schwere Abnormalitäten, wie Herz- und Leberzysten, sowie eine reduzierte diploider Chromosomensatz gebildet werden (zur Übersicht KAUFMAN u. SACHS 1976). Im Jahre 1970 wurde eine parthenogenetische Entwicklung erstmalig bei der Maus experimentell ausgelöst (TARKOWSKI et al. 1970). Die Parthenogenese kann auch beim Schwein durch eine artifizielle nicht Spermium-induzierte Aktivierung ausgelöst werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE-BAYASHI et al. 2000).

Solche Embryonen können sich nach Embryotransfer auf ein synchronisiertes Empfängertier bis ins postimplantative Stadium (min. Tag 29) entwickeln. Sie zeigen

Ausbildung der Kopfregion, oder sogar Kopflosigkeit (KURE-BAYASHI et al. 2000).

Da für eine vollständige Entwicklung bei Säugetieren männlich- und weiblich geprägte Genome erforderlich sind (SURANI et al. 1984; SURANI et al. 1990), ist über eine vollständige parthenogenetische Entwicklung mit der Geburt normaler

achkommen bei Säugetieren bisher nicht berichtet worden.

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Austausch der Chromosomen durch Kerntransfer müssen die rekonstruierten Kerntransferkomplexe für eine weitere Entwicklung aktiviert werden (BETT

et al. 2000). Zusätzlich werden parthenogenetisch aktivierte Oozyten als Kontrollgruppe zu Kerntransferembryonen genutzt (BETTHAUSER et al. 2000; KOO et al. 2000). Daher wurden er letzten Jahre t, um

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physikalisch Elektrostimulation JOLLIFF u. PRATHER 1997 Ca²⁺-Ionophor WANG et al. 1998c

Ethanol DIDION et al. 1990 chemisch

Thimerosal MACHATY et al. 1997b Protein-Synthese-Inhibitoren NUSSBAUM u. PRATHER 1995

Protein-Kinase-Inhibitoren MAYES et al. 1995 GTP-Injektion MACHATY et al. 1995 Inositol-1,4,5-Triphosphat-Injektion MACHATY et al. 1997a

CSF-Injektion MACHATY et al. 1997a biochemisch

CaCl₂-Injektion MACHATY et al. 1996

Da bei der Befruchtung intrazytoplasmatische Ca²⁺-Oszillationen einen Impuls von zentraler Bedeutung darstellen (WHITAKER u. SWANN 1993), führen die meisten Aktivierungsprotokolle zu einer intraooplasmatischen Ca²⁺ Erhöhung, die in der Schweineoozyte die erfolgreiche Befruchtung durch ein Spermium simulieren soll.

Während die spermieninduzierte Aktivierung jedoch zu Ca²⁺-Oszillationen führt, die in der porzinen Oozyte für 2-3 h anhalten (MACHATY et al. 1997a), tritt bei der artifiziellen Aktivierung ein konstanter Anstieg des intrazellulären Kalziums ein, der nach einer Plateauphase wieder abfällt (SUN et al. 1992; RICKORDS u. WHITE 1992; TESARIK u. TESTART 1994; TESARIK et al. 1994). Eine intrazytoplasmatische Ca²⁺-Injektion bei Oozyten verschiedener Spezies induziert die Aktivierung (FULTON u. WHITTINGHAM 1978; IGUSA u. MIYAZAKI 1983). Bei der Schweineoozyte führt eine solche Behandlung zur Exozytose kortikaler Granula und zum Beginn der präimplantativen Entwicklung (MACHATY et al. 1996). Weniger aufwendig kann auf physikalischem Weg, durch einen kurzzeitigen DC Puls im elektrischem Feld, die Bildung von Membranporen in der Oozyte induziert werden (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). In Medien mit hohen Ca²⁺-Konzentration ermöglichen diese Poren einen transmembranen Ca²⁺-Influx der erfolgreich zur Aktivierung bei verschiedenen Säugetierspezies eingesetzt wurde (TARKOWSKI et al. 1970; PRATHER et al. 1989a). Obwohl die Ca²⁺-Quelle extrazellulär liegt, glaubt man, dass die Elektroportation bei der Schweineoozyte ebenfalls zu einer Freisetzung von Ca²⁺ aus intrazellulären Speichern führt (MACHATY et al. 1999). Die elektrische Aktivierung erlaubt eine präimplantative Entwicklung, obwohl sie nur selten zur Ausschleusung des Polkörpers und zu keinem Polyspermieblock führt (WANG et al. 1998c; ZHU et al. 2002). Die Effizienz korreliert mit gewissen Ca²⁺ -Konzentration im Extrazellularraum (CHEONG et al. 2002).

Eine Erhöhung des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels gelingt darüber hinaus auf chemischem Weg durch Einsatz von Ca-Ionophor A23187 (IONO), das intrazellulär Ca²⁺-Ionen über Membrankompartimente hinweg transportiert, und dadurch die Verteilung zwischen den Kompartimenten zugunsten des Zytoplasmas verändert.

Dies löst in vielen Säugerspezies die Exozytose der kortikalen Granula und die Ausschleusung des 2. Polkörpers aus und ermöglicht eine präimplantative

Entwicklung (STEINHARDT et al. 1974; DUCIBELLA et al. 1990; KLINE u. KLINE 1992; WANG et al. 1998c). Obwohl Ca-Ionophor A23187 in den meisten Oozyten auch bei Abwesenheit extrazellulären Kalziums eine Aktivierung induziert, zeigen Schweineoozyten in Ca²⁺ freiem Medium signifikant schwächere Ca²⁺-Oszillationen als in Ca²⁺ supplementiertem Medium (SHINA et al. 1993; WANG et al. 1999).

Vermutlich kann das Ca-Ionophor auch einen Übertritt von extrazellulärem Ca²⁺ über das Oolemm fördern. Thimerosal (TIM), eine organische Quecksilberverbindung, oxidiert Sulfhydrylgruppen an Rezeptoren intrazellulärer Ca²⁺-Speicher und mobilisiert so deren Ausschüttung (SWANN 1991; FISSORE u. ROBL 1993). Diese Wirkung muss bei der Schweineoozyte nach ca. 10 Minuten durch den Antagonisten Dithiolthreitol (DTT), eine sulfhydrylreduzierende Substanz, wieder aufgehoben werden, da sonst die meiotische Spindel zerstört werden kann (MACHATY et al.

1997b). Da sich auf der Oberfläche der intrazellulären Ca²⁺-Speicher Inositol3-Phosphat- (Ins3P) und Ryanodinrezeptoren befinden, führt bei porzinen Oozyten auch eine Injektion mit ADP-Ribose oder Ins3P zur Ausschüttung der Ca²⁺-Speicher (MACHATY et al. 1997a). Darüber hinaus stimuliert Ethanol als temporärer Medienzusatz die intrazelluläre Ins3P-Bildung in porzinen Oozyten, was durch seine Wirkung auf den oben angeführten Rezeptor die präimplantative Entwicklung einleitet (CUTHBERTSON 1983). MACHATY et al. (1995) konnten durch Injektion von GTP (Guanosintriphosphat) intrazelluläre G-Proteine in porzinen Oozyten stimulieren, die ihrerseits die Phospholipase C stimulieren (GILMAN 1987), die wiederum die Synthese von Ins3P katalysiert (MACHATY et al. 1995). Mit dem Ziel, die Aktivierungskaskade an einem Kontrollpunkt zu beginnen, der den physiologischen Verhältnissen möglichst nahe kommt, injizierten MACHATY et al. (2000) und SAUNDERS et al. (2002) Schweineoozyten einen Extrakt aus porzinem Ejakulat („Cytosolic Sperm Factor“, CSF), der zuvor von Kern-DNA befreit worden war. Damit wurden ähnliche Verhältnisse wie bei der physiologischen Aktivierung ausgelöst (MACHATY et al. 2000). Durch porzinen CSF wurde darüberhinaus sogar in bovinen Oozyten die Embryonalentwicklung ausgelöst (KNOTT et al. 2002), was auf speziesübergreifende Mechanismen hindeutet. Darüber hinaus wurden Stimulantien an Kontrollpunkten jenseits der Ca²⁺-Ausschüttung eingesetzt. Mit der Hemmung der

Proteinsynthese wird die Produktion von Cyclin B1 unterbunden, das ein Bestandteil vom MPF ist. Ohne kontinuierliche Produktion von Cyclin B1 sinkt der Plasmaspiegel an aktivem MPF, und die Oozyte gelangt in die Interphase.

Proteinsyntheseinhibitoren, wie Cycloheximide (CYCLO) und Puromycin, aktivierten Oozyten von Mensch und Maus (SIRACUSA et al. 1978), waren jedoch ohne Effekt bei Rind und Schwein (NUSSBAUM u. PRATHER 1995). Bei den Oozyten der meisten Säugetierarten ist die Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors mit einem Ca²⁺-mobilisierenden Stimulus deutlich effektiver in der Aktivierung (NUSSBAUM u. PRATHER 1995; PRESICCE u. YANG 1994; TANAKA u.

KANAGAWA 1997).

Durch die Inhibition von Proteinkinasen, vor allem der „Mitogen Activated Protein Kinase“ (MAPK), können die Oozyten vieler Spezies aktiviert werden. So führt die Inhibierung allgemeiner Proteinkinasen mit 6-Dimethylaminopurin (DMAP)

ZÖLLÖSIS et al. 1993), H7 (5-Isoquinolinesulfonyl-2-Methylpiperazin) (MAYES et l. 1995), oder Staurosporine (RICKORDS et al. 1992) zur Aufhebung der

eiotischen Arretierung. In Folge der Protein-Kinase-Inhibition ist bei der Oozyte des chweins weder eine Exozytose der kortikalen Granula noch eine Entwicklung bis ur Blastozyste zu beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass damit nur ein Teil er Aktivierungskomponente ausgelöst werden kann (MAYES et al. 1995; GREEN et al. 1999). Bei Rind und Schwein wurden Kombinationen von Ca-Ionophor zusammen 998;

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mit 6-DMAP erfolgreich zur Aktivierung von Oozyten eingesetzt (RHO et al. 1 BETTHAUSER et al. 2000; CHUNG et al. 2000; BOQUEST et al. 2002). Einige Autoren aktivierten porzine Oozyten zudem durch eine Elektrostimulation, gefolgt von einer Inkubation in Gegenwart von 6-DMAP (GRUPEN et al. 2002; ROH u. HWANG 2002).

2.2.4 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen