3 MATERIAL UND METHODEN
3.9 In-vivo-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen
3.9.4 Beurteilung der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit
Die Beurteilun twickl entials der porzinen KT-Embryonen
e onog che Un Trächtigk 26, 33
und 77 nach Transfer t Hilfe eines Ultraschallge S 9100, Fa. Picker International GmbH, Espelkamp). Die Geburtsgewichte der Ferkel wurden
erm d deren itere Leben dokum kel
wur r pathologischen Untersuchung dem Pathologischem Institut der Tierärztlichen Hochsc
3.1 weis ge tischer Ide er geborenen Ferkel
Der Nachweis der genetischen Identität der aus geklonten Embryonen geborenen Ferkel und der Ausschluss des Empfängertieres als genetische Mutter, erfolgte durch
eine Abst ittels DN
(Variable Number of T rschiedenen hochpolymorphen
Mikrosatellitenloci (zur ersicht siehe 10) ausgewertet. Probenmaterial der ellkultur, aus der die Spenderzellen für den Kerntransfer stammten, des rägertieres und der Ferkel wurden entnommen und für jeden Microsatellitenlocus mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifiziert (Mastercycler, Fa. Eppendorf- Netheler-Hinz GmbH, Hamburg). Auftrennung und Längenbestimmung der
PCR-g des In-vivo-En raphis
ungspot
rfolgte durch s tersuchung auf eit an den Tagen
mi Real-time rätes (Modell C
ittelt un we sfähigkeit entiert. Verstorbene Fer den zu
hule Hannover übergeben.
0 Nach ne ntität d
ammungskontrolle m A-Marker. Hierzu wurden die VNTR’s andem Repeats) an zwölf ve
Üb Tabelle
Z T
Produkte erfolgten mit einem automatischem Sequenziergerät (LI-COR,DNA-Sequenzer Modell 4000l, Fa. MWG-BIOTECH) in einem Polyacrylamidgel (6%, rotiphorese® Gel 40, #3030.1, Fa. Roth+Co., Karlsruhe). Die Auswertung der Elektrophorese Gele erfolgte mit Hilfe des Programms „RFLPscan®, Version 3.5“.
Alle Arbeitsschritte für die Abstammungskontrolle wurden vom Labor Dr. Steffen Weigend (Fachbereich Genetik) durchgeführt.
Tabelle r den Abstammungsnachweis eingesetzten Mikrosatelliten
.11 Statistische Auswertung
ie statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms „Sigma Stat for indows®“ (Jandel Scientific Cooperation, Erkrath). Dazu wurde zunächst für jeden inzelnen Versuchsdurchgang der prozentuale Anteil an fusionierten Komplexen, eteilter Zygoten, unterschiedlicher Entwicklungsstadien, sowie der Blastozysten, für
de Versuchsgruppe ermittelt. Nach mehreren Versuchsdurchgängen wurden rithmetischer Mittelwert (
a x ) und Standardabweichung (±SD) für die einzelnen ntwicklungsstadien und für die jeweiligen Versuchsgruppen errechnet. Bei egebener Normalverteilung (Kolmogorov-Smirnov-Test mit Lilliefor-Korrektur) und
eicher Varianz (Levene-Median-Test) der einzelnen Entwicklungsraten (%), wurde ie Signifikanz mittels ANOVA (Tukey Test) berechnet. Unterschiede zwischen den ruppen galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant und ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,001 als hochsignifikant.
Mikrosatellit (Nr.) (Basenpaare) Literaturreferenz
CGA 1 263-318 MORAN 1993
3.12 Versuchsaufbau
Eine Übersicht über die durchgeführten Versuche ist Abbildung 32 zu entnehmen.
Abbildung 32: Schematischer Überblick über den 3-phasigen Versuchsaufbau
1. Phase 2. Phase
3. Phase Bestimmung
der Maturationsrate
Aktivierung durch Fusionspuls Wahl eines elektr.
Aktiverungsfeldes
Auswahl eines Arbeitsmediums Wahl eines
Kulturmediums
Wahl der Osmolarität des Arbeitsmediums
Optimierung der arti-fiziellen Aktivierung
Auswahl eines Fusionsmediums Parthenogenetische Embryonen Kerntransfer-Embryonen
In-vitro-Entwicklung
Wahl der Maturationsdauer
hinsichtlich Fusionsrate und In-vitro-Entwicklung
Bestimmung der In-vivo-Entwicklung
Bestimmung der genetischer Identität
In-vivo-Entwicklung
4 E
Oozyten als usgangsmaterial benutzt. Der gesamte Versuchsaufbau gliederte sich in drei
mit den Erkenntnissen aus zahlreichen twicklung ein Kerntransfer-Protokoll
nkt dieser Versuchsphase lag in der Entwicklung eines effizienten usionsprotokolls, sowie der Identifikation weiterer Parameter, die die In vitro
sphase wurde das
rgebnisse
Alle Versuche fanden im Zeitraum von März 2002 - März 2003 statt. Die Ergebnisse beziehen sich auf Untersuchungen zum Entwicklungsverhalten von parthenogenetischen und Kerntransfer-Embryonen nach Fusionierung, Aktivierung und In-vitro-Kultur. Hierzu wurden in vitro gereifte porzine
A
Phasen: In der 1. Versuchsphase wurde Modellversuchen zur parthenogenetischen En
entwickelt, das die Grundlage für die Mikromanipulation in der zweiten Versuchsphase darstellte. Insbesondere sollte die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten während einer 7,5 stündigen Verweildauer außerhalb des Brutschrankes, dem Zeitraum, der insgesamt für die Konstruktion der Kerntransfer-Embryonen benötigt wird, aufrechterhalten werden. Darüber hinaus sollte eine vorzeitige spontane Aktivierung der Oozyten verhindert werden, um die Oozyten zu einem definierten Zeitpunkt hocheffizient aktivieren zu können. In der 2. Versuchsphase wurde das Kerntransfer-Protokoll auf die Erzeugung von Kerntransfer-Embryonen übertragen und hinsichtlich der In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimiert.
Der Schwerpu F
Entwicklung positiv beeinflussen können. In der 3. Versuch
optimierte Kerntransfer-Protokoll auf das In-vivo-Entwicklungspotential in vitro erzeugter porziner Kerntransfer-Embryonen überprüft.
4.1 Entwicklung eines Kerntransferprotokolls
In dieser Vers chsphase sollten durch nte zur In- vitro-Entwicklung porziner parthenogenetis Embr erfolgsbeeinflu e Parameter identifiz rden. Die Erkenntnisse dies
Grundlagen für die Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls bilden.
4.1.1 Bestimmung der Reifungsrate
Du ,0 ± ) der eingesetzten Oozyten hatten 44 h nach Reifungsbeginn die Metaphase . meio n Re ng er und w den
uft Durc n wurd n alle yten, d für 44 h in vitro maturiert und ansc nd en liert w ware Oozyte als Kontrollstichprobe mit Hoechstfarbstoff angefärbt und unter einem
Fluoreszenzmikroskop mor en, bei denen in
nmittelbarer Nähe zur DNA des Polkörpers intraooplasmatisch eine
Entwicklungsrate r Blastozyste erlaubt. Hierzu wurden für 44 h gereifte Oozyten zufällig auf
bei konstanter Impulslänge (45 µs), einem elektrischem Feld von 0,8-1,75 KV/cm DC ausgesetzt. Nach 7 Tagen
u die Auswertung mehrere Experime
cher yonen ssend
iert we er Versuche sollten die
rchschnittlich 71% (71 7,8%
der 2 tische ifeteilu reicht ur als erfolgreich gereift eingest . In 13 hläufe en vo n Ooz ie
hließe tkumu orden n, 20 n
phologisch ausgewertet. Oozyt u
Metaphasenplatte abgegrenzt sichtbar war, und die frei von intraooplasmatisch verstreuten DNA-Bestandteilen waren, wurden dem Metaphase-II Stadium zugeordnet.
4.1.2 Auswahl des elektrischen Feldes zur Aktivierung
In diesem Versuchsteil wurde überprüft, welche elektrische Feldstärke bei gegebener Impulsdauer nach der Aktivierung die höchste parthenogenetische
zu
verschiedene Gruppen verteilt und dann, je nach Gruppe,
In vitro Kultur im dreiphasigen Kultursystem (CR2, NCSU23, NCSU23+ FCS) wurde die weitere Entwicklung bestimmt. Für die Versuche standen in 7 Durchgängen insgesamt 1467 Oozyten zur Verfügung, wobei jeweils 49-67 Oozyten auf insgesamt 25 Versuchsgruppen verteilt wurden. In Tabelle 11 sind die Entwicklungsraten für die verschiedenen Feldstärken dargestellt.
Tabelle 11: Einfluß der elektrischen Feldstärke auf die parthenogenetische In-vitro-Entwicklung porziner MII-Oozyten (x ±SD)
Elektrische Feldstärke (KV/cm)
0, 8 1,0 1,25 1,5 1,75
Durchgänge (n) n=4 n=7 n=7 n=6 n=1
Gesamt (n) 241
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
S ten sich hängigkeit zum eingesetzten elektrischen Feld: Feldstärken über 1,25 KV/cm reduzierten die Teilungsrate signifikant,
wohingegen Feldstärken rate signifikant senkten.
Die höchsten Blastozystenraten (29,6 ± 5,3 %) resultierten aus einem
s
In diesem Versuchsteil wurden 2 verschiedene Kultursysteme auf ihre Eignung, eine icklung zu gewährleisten,
ignifikante Unterschiede zeig in Ab
über 1,0 KV/cm die Blastozysten
Aktivierungspotential von 1,0 KV/cm. In der durchschnittlichen Kernzahl pro Blastozyste gab es zwischen den verschiedenen Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für alle weiteren Versuche zur Aktivierung eine elektrische Feldstärke von 1,0 KV/cm eingesetzt.
4.1.3 Auswahl eines geeigneten Kulturmedium
möglichst weitreichende parthenogenetische In-vitro-Entw
untersucht. Verglichen wurden hierbei die einphasige Kultur in NCSU23 Medium und das dreiphasige Kultursystem in CR2-, NCSU23- und NCSU23+ FCS Medium. Dazu wurden in 8 Durchgängen insgesamt 940 Oozyten, die für 44 h maturiert waren, durch ein elektrisches Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) parthenogenetisch aktiviert und
zufällig auf die beiden Kultursysteme in Gruppengrößen von 46-63 aufgeteilt. Die Beurteilung der parthenogenetischen Entwicklung erfolgte nach 7 Tagen; die genauen Entwicklungsraten dieses Experiments sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: Einfluss des Kulturmediums auf die In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen nach parthenogenetischer Aktivierung (x ± SD)
Kulturmedien NCSU23
(einphasig)
CR2 / NCSU23 / NCSU23 + FCS (dreiphasig)
Durchgänge (n) n=8 n=8
Gesamt (n) 474 466
62,9 a 54,7 b
Teilungsrate (%)
± 8,6 ± 5,9
31,3 25,2 Blastozystenrate (%)
± 9,2 ± 4,5
29,0 30,0 Zellkerne/ Blastozyste (n)
± 7,2 ± 8,4
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Mit einer lichen Teilungsrate 62,9 ± 8,6% war inphasige Embryonenkultur in NCSU23 Medium dem mehrphasigem Kultursystem (54,7 ± 5,9%) signifikant überlegen. Bei den Blastozystenraten zeigten sich keine
signi 31,3 ± 9,2% v 2 ± 4,5%). Aufgrund rgebnisse
dieses Versuchs wurden die Embryonen in allen nachfolgenden Versuchen einphasig für 7 Tage in NCSU23 Medium kultiviert.
4.1.4 Auswahl eines geeigneten Arbeitsmediums In diesem Versuchsabschnitt wurde ermitte
rbeitsmedien, Tl-Hepes271 Ca-free oder Hb-NCSU, während einer 7,5 stündigen Verwahrungszeit, dem Zeitraum, der für die Mikromanipulation nötig ist, am besten das Entwicklungspotential der nicht aktivierten Oozyten erhalten kann. Zu diesem
durchschnitt von die e
fikanten Unterschiede ( s. 25, der E
lt, welches der beiden Hepes gepufferten A
Zweck wurden 44 h gereifte Oozyten entkumuliert und in Gruppen zu 49-68 Oozyten
b-NCSU23 Arbeitsmedium (18,7 ± 3,2). Aus diesem rund wurde Tl-Hepes für alle folgenden Versuche als Basis-Arbeitsmedium
Tabelle 13: Einfluß des Arbeitsmediums auf das Entwic ogenetischer
porzine ger Einw
zufällig auf die beiden Arbeitsmedien verteilt. Dort verblieben die Oozyten für 7,5 h und wurden anschließend im elektrischem Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) aktiviert.
Nach 7 tägiger Kultur wurde retrospektiv die Entwicklung von 794 parthenogenetischen Embryonen bestimmt. Tabelle 13 stellt die durchschnittlichen Entwicklungsraten aus 7 Versuchsdurchgängen dar: Keine signifikanten Unterschiede zeigten sich in der Teilungs- (70,8% vs. 64,9%) und Blastozystenrate (17,6% vs. 15,2%). Allerdings ergaben sich signifikante Unterschiede in der durchschnittlichen Kernzahl pro Blastozyste. Blastozysten aus der Tl-Hepes271 Ca-free Versuchsgruppe besaßen mit durchschnittlich 22,3 ± 5,3 Kernen signifikant mehr Zellkerne als Blastozysten aus H
G
gewählt.
klungspotential parthen r Embryonen nach 7,5 stündi irkzeit (x ±SD)
Geprüfte Arbeitsmedien Tl-Hepes271 Ca-free Hb-NCSU23
Durchgänge (n) n=7 n=7
Gesamt (n) 385 409
70,8 64,9 Teilungsrate (%)
3,7 ±6,0 ,6 15,2
±1 Blastozystenrate (%) 17
,0 ±3,2
3 a 18,7
±7
22, b
Zellkerne/Blastozyste (n)
±2,2 ±3,2
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
4.1.5 Auswahl einer geeigneten Osmolarität des Arbeitsmediums
In diesem Versuchsabschnitt wurde der Einfluss der Osmolarität im Arbeitsmedium, dem Oozyten während der Mikromanipulation für ca. 7,5 Stunden ausgesetzt sind, bestimmt. In 9 Versuchsdurchgängen wurden insgesamt 1716 in vitro gereifte Oozyten in Gruppengrößen von 57-74 zufällig auf drei Tl-Hepes Medien, die durch Sucrosezusatz auf 271-, 296- und 321 mOsmol eingestellt worden waren, aufgeteilt.
Nach Ablauf der 7,5 stündigen Einwirkzeit der verschiedenen Arbeitsmedien wurden ie Oozyten in einem elektrischen Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) aktiviert und für 7 Entwicklungsraten der d
Tage in vitro kultiviert. Tabelle 14 stellt die durchschnittlichen
parthenogenetischen porzinen Embryonen in Abhängigkeit zur Osmolarität des benutzten Arbeitsmediums dar.
Tabelle 14: Einfluss der Osmolarität im Arbeitsmedium auf das Entwicklungspotential parthenogenetischer porziner Embryonen nach 7,5 h Einwirkzeit (x ±SD)
Tl-Hepes (mOsmol)
Geprüfte Osmolarität 271 296 321
Durchgänge (n) 9 9 9
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
ie Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Osmolarität des rbeitsmediums im gewählten Spektrum keinen signifikanten Einfluss auf die eilungsrate parthenogenetischer Embryonen ausübte (69,2% vs. 74,8% vs. 73,7%).
llerdings führten höhere Osmolaritäten im gewählten Spektrum zu signifikant D
A T A
höheren Blastozystenraten (18,3 ± 6,4 vs. 24,4 ± 3,0 vs. 26,2 ± 4,3), wobei es zwischen den Blastozysten aus den verschiedenen Gruppen bezüglich der
durchschnittlichen Kernzahl kein Aufg se
wurde ein Tl-Hepes Arbeitsmedium mit einer Osmolarität von 296 mOsmol (Tl-Hepes 296) zum Basismedium gewählt, außerhalb des Brutschranks aufzubewahren und zu manipulieren.
4.1.6 Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls
In dies sollte das am b eeignete Aktivierungsprotokoll für in vitro gereifte Schweineoozyten ermittelt . Es wurde die Aktivierung mit Hilfe
eine Feldes (1,0 DC für 45 µs) mit Aktivierung
im elektrischem Feld gefolgt von einer 3 stündigen Inkubation in 6-DMAP, verglichen.
In 6 Durchgängen standen insgesamt 731 Oozyten zur Verfügung, die zuvor für 43 h gereift worden waren. Sie verblieben bis zur Aktivierung für 7,5 h in Tl-Hepes296
Medium, was der Ze ng der
Kerntransfer-Embryonen für die Mikromanipulation benötigt wird. Nach zufälliger Aufteilung in zwei e Unterschiede gab. rund dieser Ergebnis
um Embryonen
er Versuchsreihe esten g werden
s einzelnen elektrischen KV/cm einer
itdauer entspricht, die bei der Erzeugu
Gruppen und elektrischer Aktivierung wurde eine der Gruppen zusätzlich für drei Stunden in NCSU23 Medium, supplementiert mit 6-DMAP, inkubiert. Tabelle 15 zeigt die Entwicklungsraten nach 7-tägiger Kultur in NCSU23-Medium.
Tabelle 15: Einfluss des Aktivierungsregimes auf die In-vitro-Entwicklung parthenogenetischer porziner Embryonen (x ±SD)
Aktivierungsprotokoll
wischen den beiden Aktivierungsprotokollen zeigten sich keine signifikanten nterschiede im Bezug auf die Teilungsrate (74,9 ± 12,2% vs. 71,8 ± 8,1%). Eine usätzlichen Aktivierung durch Inkubation mit 6-DMAP führte jedoch zu einer signifikant höheren Blastozystenrate als nach alleiniger elektrischer Aktivierung (40,4
± 10,5% vs. 26,5 ±8,1%), wobei zwischen den Blastozysten beider Gruppen kein Unterschied hinsichtlich der Zellzahl bestand (22,7 ± 3,1 vs. 20,6 ± 2,1). Aufgrund des höheren Entwicklungspotentials nach Aktivierung durch zusätzliche 6-DMAP Inkubation, wurde das kombinierte Aktivierungsregime in allen weiteren
xperimenten zur Aktivierung von Kerntransferkomplexen eingesetzt.
.1.7 Versuche zur Aktivierbarkeit
m Fusion und Aktivierung der Kerntransferkomplexe zu optimieren, wurden beide
Vorgänge ze rung der zu
fusionierenden Komplexe durch den Fusionsvorgang sollte verhindert werden.
Durchgänge (n) n=6 n=6
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Z
itlich voneinander getrennt, denn eine vorzeitige Aktivie
Desh e
g 33 stellt die ktivierungsraten, bestimmt anhand der Teilungsraten nach 48 Stunden Kultur in NCSU23-Medium, graphisch dar: Etwa 30% der Oozyten, die dem elektrischem ten sich (29,1 ± 3,5%).
alb wurden verschiedene Fusionsmedien, in Hinblick auf die Fähigkeit ein Fusion ohne begleitende Aktivierung einzuleiten, geprüft. In 5 Durchläufen wurden dafür 908 in vitro gereifte Oozyten in drei verschiedenen Medien (SOR2, SOR2 Ca-free und Boquest) einem elektrischen Feld (10 V DC, 99 µs) ausgesetzt, das später auch zur Fusion von Kerntransferkomplexen eingesetzt werden sollte. Eine vierte Oozytengruppe („0-Kontrolle“) wurde für einige Minuten in SOR2-Fusionsmedium aufbewahrt, ohne dass ein elektrisches Feld angelegt wurde. Abbildun
A
Fusionsfeld im SOR2 Medium ausgesetzt wurden, teil
Hochsignifikant weniger Oozyten aus den kalziumfreien Medien (SOR2 Ca-free: 8,9
± 2,7%, Boquest: 6,7 ± 7,6%) und der „0-Kontrolle“ (1,1 ± 1,5%) befanden sich im 2-Zellstadium. Für alle Fusionsversuche an Kerntransfer-Embryonen wurden deshalb ausschließlich SOR2 Ca-free und Boquest-Fusionsmedium verwendet.
Abbildung 33: Einfluß des Fusionsmediums auf die parthenogenetische Aktivierung porziner MII-Oozyten während der Fusion (x ±SD)
0 5 10 15 20 25 30
35
aate (%)
(ANOVA, Tukey Test: a:bc < 0,001 b:c < 0,05)
SOR2 Boquest SOR2 Ca-free 0-Kontrolle c
bc b
eilungsrT
4.2 In-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen In dieser Versuchsphase wurde das mit Hilfe des „parthenogenetischen Modells“
entwickelte Kerntransfer-Protokoll auf die Erzeugung von Kerntransfer-Komplexen übertragen. Durch Auswertung von Experimenten zur Fusion und zur In-vitro- Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen, wurden weitere Einflussfaktoren bestimmt, die die Effizienz der einzelnen Arbeitsschritte im Kerntransferprotokoll und die In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimierten.
4.2.1 Auswahl eines geeigneten Fusionsmediums
In diesem Versuch wurden zwei Fusionsmedien, das Boquest-Fusionsmedium und das SOR2 Ca-free Medium, hinsichtlich der Fusionseffizienz überprüft. Für beide Fusionsmedien wurden an jeweils 4 Versuchstagen 35-52 Fibroblasten-Oozytenkomplexe einem elektrischem Feld (10 V DC, 99 µs) zwischen zwei
Fusionselektroden ausge t. Es zeigte sich, dass
die durchschnittliche Fusionsrate im SOR2 Ca-free Medium signifikant höher war als im Boquest Fusionsmedium (84,2 ± 5,2% vs. 67,1 ± 6,4%). Dieser Vergleich wird in Abbildung 34 graphisch dargestellt. In den folgenden Versuchen wurden alle
usionsmedium (10 V DC, 99 µs) setzt und die Fusionsraten bestimm
Fibroblasten-Oozytenkomplexe in SOR2 Ca-free F fusioniert.
Abbildung 34: Einfluß des Fusionsmediums auf die Fusionsraten porziner Fibroblasten-Oozyten Komplexe unter ansonsten konstanten Fusionsbedingungen (x ±SD)
50 55 60 65 70 75 85
Fusionsrate b
SOR2 Ca-free Boquest
90 95
a
(%)
80
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
4.2.2 Fusion von Kerntransfer-Embryonen
Zusätzlich zu den vier Durchgängen zur Ermittlung des geeigneteren Fusions-ediums, bei denen insgesamt 193 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2
Ca-en 2 ElektrodCa-en ausgesetzt wurden (10 V DC, 45 µs), wurden bei den im Anschluss stattfindenden m
free Fusionsmedium einem identischem Fusionsfeld zwisch
Hauptversuchen unterschiedlich lang gereifte Oozyten verwendet, wobei an 20 Versuchstagen insgesamt 1200 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2 Ca-free Fusionsmedium fusioniert wurden (10 V DC, 45 µs). Zusammen mit den Versuchen zur Bestimmung des geeigneten Fusionsmediums, wurden insgesamt 1393 Fibroblasten-Oozytenkomplexe, an insgesamt 24 Versuchstagen, unter identischen Fusionsbedingungen im SOR2 Medium fusioniert (10 V DC, 45 µs). Die Fusionseffizienz wurde hierbei nicht signifikant von der Reifungsdauer der Oozyten beeinflusst (38 h Reifung: 75,0 ± 9,8%, 40 h Reifung: 76,0 ± 9,8%, 42 h Reifung: 83,6
± 6,8%, 43 h Reifung: 84,2 ± 6,4%). Wenn die Gruppen 38-40 h Reifung und 42-43 h Reifung miteinander verglichen wurden, konnte jedoch eine signifikant höhere
usionsrate bei den länger maturierten Oozyten (83,8 ± 6,3% vs. 75,5 ± 9,4%) rrechnet werden. Diese Überlegenheit stellt Abbildung 35 in graphischer Form dar.
bbildung 35: Einfluss der Oozytenreifungsdauer auf die Fusionsraten daraus erstellter porzi-sten-Oozyten-Komplexe bei ansonsten identischen Fusionsbedingungen
F e
A
ner Fibrobla (x ±SD)
enkomplexe konnten hergestellt werden (95,7%), die mit einer urchschnittlichen Effizienz von 78,9% fusioniert werden konnten. Die durchschnittliche Blastozystenrate von insgesamt 878 fusionierten und aktivierten
5
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
4.2.3 In-vitro-Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen
In diesem Versuch wurde das Entwicklungspotential rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen ermittelt. In einem 3x3x2 Versuchsmodell wurde der Einfluss der Oozyten-Reifungsdauer (38 h, 40 h oder 42 h) und der Dauer der Kontaktinhibition der porzinen fetalen Fibroblasten (24 h, 48 h oder 72 h) untersucht. Bei zwei Wiederholungen je Kombinationsmöglichkeit, wurden an 18 Versuchstagen insgesamt 1475 Oozyten mit einer Effizienz von 78,6% enukleiert; 1113 Fibroblasten-Oozyt
d
Kerntransferkomplexen lag bei 9,8%. Tabelle 16 zeigt die Blastozystenraten (Mittelwert aus zwei Durchgängen) ei K tio
Tabelle 16: Blastoz rate
der nzelnen ombina nen.
ysten (x ) porzi taktinhi
ner Kerntran -Embry on zur Dauer der
Ooz nreifung und Kon b sd r d n o t 2
Während die Kontaktinhibitionsdauer der fetalen Fibroblasten keinen signifikanten Einfluss bezüglich der Blastozystenrate aufwies (9,1% vs. 9,6% vs. 10,6%), ließ sich für die Reifungsdauer der Oozyten ein hochs fikant p<0,0 E ss errechnen (9,6% vs. 14,8% vs. 4,9%). Die ste E cklun igten Kerntransfer-Em en, die aus 40 h ge en zine ozyte kons rt wu (14,8%).
Tab 7 stellt die In-vitro-E ick de konst ten K ransfe mbryonen und „Kontrollgruppen“, in ä keit Reifu dauer Oozyten, detailliert dar
Kontrolle n=6 384 75,8 ± 7,2 60,2d ± 8,7 44,1d ± 6,6 24,3b ± 4,3
42 h KT- Komplexe n=6 314 86,7 ± 4,6 5,7c ± 3,2 4,9c ± 2,1 17,1a ± 4,7
Kontrolle n=6 368 80,0 ± 9,7 56,5d ± 18,7 44,4d ± 14,8 24,3b ± 4,3
40 h KT- Komplexe n=6 279 81,1 ± 4,3 18,0b ± 1,0 14,8b ± 1,7 16,0a ± 5,8
Kontrolle n=6 373 82,4 ± 3,9 58,2d ± 10,7 47,5d ± 9,4 24,2b ± 2,7
Reifungsdauer 38 h KT- Komplexe n=6 285 82,7 ± 7,1 10,2a ± 2,1 9,6a ± 2,0 17,4a ± 4,2
Tabelle 17: In-vitro-Entwi Relation zur Reifungsdauer der Ooz Durchgänge (n) Gesamt (n) Teilungsrate (%) Embryonen > 4 Zellblock (%) Blastozystenrate (%) Zellkerne / Blastozyste (n)
cklung rekonstruierter porziner Kerntransfer-Embryonen und parthenogenetischer „Kontrollgruppen“ in yten ( ± SD) (ANOVA, Tukey Test: d:abc <0,001 b:ac < 0,001 a:c< 0,05)
x
Bezogen auf die Reifungsdauer (n=6) war kein signifikanter Einfluss auf die Teilungsrate (82,7 ± 7,1% vs. 81,1 ± 4,3% vs. 86,7 ± 4,6%) festzustellen. Jedoch war
er Anteil der Blastozystenstadien von Kerntransfer-Komplexen, die aus 40 h eiden anderen Gruppen (38 h: 9,6 ± 2,0%, 42 h: 4,9 ± 2,1%) hochsignifikant (p<0,001) verbessert. Die 38 h Gruppe zeigte gegenüber der 42 h Gruppe eine signifikant (p<0,05) erhöhte Blastozystenrate. Das gleiche Signifikanzmuster spiegelte sich bei der relativen Anzahl an Kerntransfer-Embryonen, die den 4-Zellblock überwand (mehr als 8 Zellkerne), wieder (10,2 ± 2,1% vs. 18,0% ± 1,0 vs. 5,7% ± 3,3). Von Abbildung 36 bis Abbildung 39 sind Entwicklungsstadien verschiedener Kerntransfer-Embryonen nach Hoechstfärbung dargestellt. Die einzelnen blauen Punkte stellen hierbei die fluoreszierenden Zellkerne der Embryonen dar. Abbildung 40 zeigt eine Gruppe von KT-Blastozysten, mit einer Morphologie, die für die im Rahmen dieser Arbeit erzeugten KT-Blastozysten typisch war. Einige der im Rahmen dieser Arbeit erzeugten Kerntransfer-Blastozysten schlüpften am Tag 7 (Abbildung 41). Im Gegensatz zu den Kerntransfer-Embryonen zeigten die parthenogenetisch aktivierten „Kontrollgruppen“ mit Reifungszeiten von 38 h, 40 h und 42 h, weder im Bezug auf die Teilungsrate (82,4% vs. 80,0% vs. 75,8%) noch auf Blastozystenrate 5% vs.
60,2%), signifikante Unterschiede. Die durchschnittliche Kernzahl pro arthenogenetischer Blastozyste war nahezu identisch (24,2 vs. 24,2 vs. 24,3). Im
yonen jedoch hochsignifikant häufiger das 4-Zellstadium (56,5 - 60,2% vs. 5,7 - 18,0%), erreichten zu einem hochsignifikant höheren Prozentsatz das Blastozystenstadium (44,1 - 47,5% vs. 4,9 - 14,8%) und besaßen hochsignifikant höhere durchschnittliche Kernzahlen pro Blastozyste (24,2 - 24,3 vs. 16,0 - 17,4).
d
gereiften Oozyten rekonstruiert worden waren (14,8 ± 1,7%), gegenüber den b
(47,6% vs. 44,4% vs. 44,1%) und Überwinden des 4-Zellblocks (58,2% vs. 56,
p
Vergleich zu den KT-Embryonen überwanden die parthenogenetischen Embr
Abbildung 36: Kerntransfer- Embryo im 32-Zellstadium nach Hoechstfärbung
Abbildung 37: Schlüpfender Kerntransfer- Embryo mit ~50 Zellen nach Hoechstfärbung
Abbildung 38: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~90 Zellen nach Hoechstfärbung
Abbildung 39: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~144 Zellen nach Hoechstfärbung
Abbildung 40: Schlüpfende Kerntransfer-Blastozysten an Tag 6 der In-vitro-Kultur
Abbildung 41: Geschlüpfte In-vitro-Kerntransfer-Blastozyste an Tag 7 der Kultur
4.3 In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen In dieser Versuchsphase wurde das entwickelte Kerntransfer-Protokoll, im Hinblick
uf die Fähigkeit der Kerntransfer-Embryonen eine In-vivo-Entwicklung zu urchlaufen, überprüft. Dazu wurden rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen auf
te rotokoll zusammen.
Tabelle 18 in it Embryon wur
P sc um benötigte t
a d
synchronisierte Empfängertiere übertragen. Tabelle 18 fasst das dabei verwende P
: Protokoll nach dem dieser Arbe rekonstruierte en erzeugt den
rozes hritt Medi Zei
Eizellreifung NCSU37 22+18 h
Entkumulierung Tl-Hepes 296 30 min
Polkörperselektion Tl-Hepes 296 30 min
Enukleation Tl-Hepes 296 Ca-free 2,5 h
Kerntransfer Tl-Hepes 296 Ca-free
Fusion (10 V, 99 µs) SOR2 Ca-free
2 h1
Verweildauer Tl-Hepes 296 1,75 h
SOR2 15 min
7,5 h
elektrische Aktivierung (1,0 KV/cm, 45 µs)
6-DMAP - Aktivierung (2 mM, 3 h) NCSU23 3 h Transfer auf Empfängertiere Tl-Hepes 296
1 Kerntransfer und Fusion fanden parallel statt
4.3.1 Transfer von Kerntransfer-Embryonen auf Empfängertiere
Auf vier synchronisierte Empfängerschweine wurden chirurgisch durchschnittlich 150 rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen übertragen. Dabei wurde der Ovarbefund (Anzahl der Ovulationsstellen) erhoben. Es wurden 40 h gereifte Oozyten und fetale Fibroblasten, die sich seit ~48 h im Stadium der Kontaktinhibition befanden, zur Herstellung der Fibroblasten-Oozytenkomplexe eingesetzt. Über vier Versuchstage konnten bei einer Fusionsrate von durchschnittlich 77,1% 641 fusionierte Komplexe erzeugt werden, wobei sich insgesamt 599 Embryonen nach der Aktivierung als transfertauglich erwiesen (Tabelle 19).
Tabelle 19: Transfer porziner Kerntransfer-Zygoten auf synchronisierte Empfängerschweine
Von diesen 4 Empfängertieren hatten an Tag 26 zwei Sauen eine Trächtigkeit etabliert. In Abbildung 42 und Abbildung 43 sind die Aufnahmen der positiven Ultraschallbefunde dargestellt.
Trächtigkeitstag Sau-Nr.
Gesamt-Komplexe
fusionierte Komplexe
übertragene Komplexe
34 115
ET 10/5 200 166 83,0 161 (+) (+) 4 Ferkel
(n) (n) (%) (n) 26 33
1.
2. ET 969/20 202 158 78,2 144 (-) (-)
3. ET 868/85 213 166 77,9 156 (+) (-) 5 Implantationen
4. ET 978/25 218 151 69,3 138 (-) (-)
x = 208 160 77,1 150
(+) : positiver Ultraschallbefund, (-) : negativer Ultraschallbefund
Abbildung 42: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 22 der Trächtigkeit
Abbildung 43: Ultraschallbild von Sau 686/85 an Tag 26 der Trächtigkeit
Abbildung 44: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 29 der Trächtigkeit
Abbildung 45: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 59 der Trächtigkeit
Die Sau mit der Stall-Nr. 686/85 zeigte jedoch am Tag 33 der Trächtigkeit Rauschesymptome. Deshalb wurde das Tier zur genaueren Uterusanalyse am Tag 34 der Trächtigkeit geschlachtet. Hierbei konnten 5 Implantationsstellen nachgewiesen werden. Das verbleibende Trägertier mit der Nr. 10/5 kam nach unauffälliger Trächtigkeit (Abbildung 44 und Abbildung 45) am 115. Tag zur Abferkelung und warf 4 Ferkel, deren Entwicklungszustand Tabelle 20 darstellt.
Tabelle 20: Entwicklungszustand und Vitalität der Klonferkel bei der Geburt
1: Ferkel Nr. 2 verstarb 8 h post partum
Von den 4 weiblichen Ferkeln verstarb eines bereits im Geburtsweg, ein zweites 8 h
Von den 4 weiblichen Ferkeln verstarb eines bereits im Geburtsweg, ein zweites 8 h