Physiologie der Befruchtung

Bei der Befruchtung erfüllt das Spermium zwei zentrale Aufgaben: Es liefert der Oozyte in Form des haploiden Chromosomensatzes die genetische Information für das diploide Genom und aktiviert die Eizelle, so dass diese ihre 2. meiotische Reifeteilung vollenden kann, den 2. Polkörper ausschleust und nach Verschmelzung des männlichen- und weiblichen Vorkerns schließlich die Embryonalentwicklung einleitet. Beim Schwein findet die Befruchtung am Übergang der Eileiterampulle zum Isthmus tubae uterinae statt. Die Oozyten gelangen nach der Ovulation über die Fimbrientrichter in die Eileiter und erreichen nach 30-45 Minuten die Eileiterampulle (HUNTER 1991). Ihre optimale Befruchtungsfähigkeit bleibt jedoch nur maximal sechs Stunden bestehen (HUNTER 1991). Die ersten Spermien erreichen bereits 15 Minuten nach der Konzeption den Eileiter, was durch die intrauterine Deposition, das große Ejakulatvolumen, sowie durch kranial gerichtete Myometriumskontraktionen unterstützt wird (HUNTER 1991). Im Bereich des kaudalen Isthmus tubae uterinae wird ein Spermienreservoir gebildet, wobei die Spermien an epitheliale Zellen binden (HUNTER 1991). Die periovulatorische Freisetzung der Spermien erfolgt aufgrund vom Follikel ausgehender hormoneller Signale (HUNTER 1994). Um die Befruchtungsfähigkeit zu erlangen, müssen die Spermien die Kapazitation durchlaufen (HUNTER u. DZIUK 1968), die durch biochemische und biophysikalische Umgestaltungsprozesse gekennzeichnet ist (FLESCH u. GADELLA 2000) und die Voraussetzung für die Akrosomreaktion darstellt (AUSTIN 1951;

CHANG 1951). Diese befähigt die Spermien zur Penetration durch die Zona pellucida und zur anschließenden Gametenfusion. Bei der Akrosomreaktion kommt es zur Verschmelzung der Plasmamenbran des Spermienkopfes mit der äußeren Akrosommembran und zu anschließender Exozytose akrosomaler Enzyme (BARROS et al. 1967; YANAGIMACHI 1988). Nach Passieren der Zona pellucida erfolgt die Fusion der nebeneinanderliegenden Plasmamembranen von Samenzelle und Oozyte. Aus dem Halsstück der Samenzelle entwickelt sich das Zentriol für die später stattfindende erste Teilung (YLLERA-FERNANDEZ et al. 1992). Durch die Gametenfusion gelangt der Zellkern des Spermiums in die Oozyte, von da an besitzt die Oozyte einen vollständigen Chromosomensatz. Dieser liegt in Form von 2

haploiden Vorkernen vor, die zunächst noch voneinander getrennt sind. Ebenfalls durch die Fusion gelangt ein lösliches zytosolisches Protein („Cytosolic Sperm Factor“, CSF, „oscillin“) aus dem Zytoplasma des Spermiums in die Oozyte (Abbildung 2), was repetitive intrazelluläre Ca²⁺ Oscillationen auslöst (PARRINGTON et al. 1996; MACHATY et al. 2000; SWANN et al. 2001; SAUNDERS et al. 2002).

CSF besitzt ein relatives Molekulargewicht von 33KDa und befindet sich im Spermienkopf auf Höhe des Äquatorialsegmentes, wo die Spermien-Oozyten-Fusion ihren Anfang nimmt (PARRINGTON et al. 1996). Es wurde gezeigt, dass durch Injektion von porzinem CSF in Oozyten von Rind und Schwein eine vollständige Aktivierung eingeleitet werden kann (MACHATY et al. 2000; KNOTT et al. 2002).

Zunächst glaubte man an ein Protein, das die Phospholipase C (PLC) stimuliert (WU et al. 2001). Später wurde es als eine spermientypische Isoform der Phospholipase C identifiziert, die Phosphatidylinositol4,5-bisphosphat (PIP2) zu Inositol1,4,5-triphosphat (Ins3P) und Diacylglycerin hydrolysiert (SAUNDERS et al. 2002). Ins3P als second messenger aktiviert die Oozyte (INOUE et al. 2002). Durch Bindung an Ins3P-Kalziumkanalrezeptoren kommt es zu einer Erhöhung des intrazellulär verfügbaren Ca²⁺ (BERRIDGE 1993; MACHATY et al. 1997a). Das freigesetzte Ca²⁺

wiederum verstärkt die PLC-Aktivität (RICE et al. 2000). Dieses positive Feedback ist ursächlich für die Induktion der Ca²⁺ Oszillationen, die in der Schweineeizelle bei Eintritt des Spermiums für etwa 2-3 Stunden (SUN et al. 1992; MACHATY et al.

1997a) bis zur Bildung der Vorkerne anhalten (JONES et al. 1995; DAY 2000). Sie werden als das zentral auslösende Signal für die weiteren Vorgänge im Rahmen der Oozyten-Aktivierung angesehen (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992). Die Exozytose der kortikalen Granula führt zu Veränderungen von Oolemm und Zona pellucida. Der Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in den perivitellinen Raum, und es kommt zu physikochemischen und biochemischen Zustandsänderungen der Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida (CRAN u. CHENG 1986).

Hierdurch wird ein Polyspermieblock aufgebaut, der das Eindringen weiterer Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991). Ursächlich für die meiotische Arretierung der gereiften Oozyte ist ein hoher Plasmaspiegel von aktivem „Meiosis Promoting Factor“ (MPF) (NURSE 1990; VERLHAC et al. 1994), einem Komplex aus

einem regulatorischem Protein, dem Cyclin B (GAUTIER et al. 1990), und einem katalytischen Protein, der CdK (Cyclin dependent kinase). Die Aktivität von MPF wird durch die Aneinanderlagerung dieser beiden Proteine aufrechterhalten, wobei der intrazytoplasmatische Abbau von Cyclin B durch einen Cyclin-stabilisierenden Komplex (CsK) unterbunden wird (MASUI 1991; KUBIAK et al. 1993; MASUI 2000).

Als Folge der Ca²⁺ Oszillationen stimuliert freies Ca²⁺ Calmodulin-Moleküle, die ihrerseits eine calmodulinabhängige Kinase stimulieren, die den CsK dann inaktiviert (LORCA et al. 1993). Durch intrazytoplasmatischen Abbau sinkt in der Folge der Cyclin B-Plasmaspiegel, was zum MPF-Abbau (Abbildung 2) und schließlich zum Überwinden der meiotischen Arretierung führt (MURRAY 1989).

Abbildung 2: Biochemische Vorgänge bei der Aktivierung der Schweineoozyte durch ein Spermium

MPF CdK + Cyclin B Cyclin B Cyclin B CsK (aktiv) CsK (inaktiv) Calmodulin Calmodulin(Ca²⁺)

+

+

+

(modifiziert nach SWANN et al. 2001)

Eine wichtige bisher jedoch noch nicht vollständig geklärte Rolle bei der Aktivierung der Schweineoozyte spielt die „Mitogen Activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u.

YANG 1999), die die Oozyte während der meiotischen Arretierung bei hoher Plasmaaktivität vor parthenogenetischer Aktivierung bewahrt (PICARD et al. 1996).

Diese Kinase, deren Aktivitätsabfall mit der Vorkernbildung in Verbindung gebracht wird (MOOS et al. 1995; LIU u. YANG 1999), wird vermutlich durch eine spezifische Proteinkinase C (PKC) inaktiviert (SUN et al. 1999). Dies geschieht bei der Spezies Schwein zeitlich versetzt zur MPF-Inaktivierung (MIYANO et al. 2000). Die Wiederaufnahme der Meiose führt zur Ausschleusung des 2. Polkörpers und zur Ausbildung des weiblichen und männlichen Vorkerns (HANCOCK 1961). Die ersten Vorkerne sind beim Schwein frühestens 6 Stunden nach Besamung bzw. Konzeption zu sehen (HANCOCK 1961; LAURINCIK et al. 1994). Für die Syngamie wandern beide Vorkerne aufeinander zu und verschmelzen miteinander zur diploiden Zygote.

Die erste Furchungsteilung vollzieht sich in Form einer normalen Mitose, und tritt bei der Spezies Schwein etwa 21h nach Konzeption auf (HANCOCK 1961).