Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls

4 ERGEBNISSE

4.1 Entwicklung eines Kerntransferprotokolls

4.1.6 Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls

In dies sollte das am b eeignete Aktivierungsprotokoll für in vitro gereifte Schweineoozyten ermittelt . Es wurde die Aktivierung mit Hilfe

eine Feldes (1,0 DC für 45 µs) mit Aktivierung

im elektrischem Feld gefolgt von einer 3 stündigen Inkubation in 6-DMAP, verglichen.

In 6 Durchgängen standen insgesamt 731 Oozyten zur Verfügung, die zuvor für 43 h gereift worden waren. Sie verblieben bis zur Aktivierung für 7,5 h in Tl-Hepes296

Medium, was der Ze ng der

Kerntransfer-Embryonen für die Mikromanipulation benötigt wird. Nach zufälliger Aufteilung in zwei e Unterschiede gab. rund dieser Ergebnis

um Embryonen

er Versuchsreihe esten g werden

s einzelnen elektrischen KV/cm einer

itdauer entspricht, die bei der Erzeugu

Gruppen und elektrischer Aktivierung wurde eine der Gruppen zusätzlich für drei Stunden in NCSU23 Medium, supplementiert mit 6-DMAP, inkubiert. Tabelle 15 zeigt die Entwicklungsraten nach 7-tägiger Kultur in NCSU23-Medium.

Tabelle 15: Einfluss des Aktivierungsregimes auf die In-vitro-Entwicklung parthenogenetischer porziner Embryonen (x ±SD)

Aktivierungsprotokoll

wischen den beiden Aktivierungsprotokollen zeigten sich keine signifikanten nterschiede im Bezug auf die Teilungsrate (74,9 ± 12,2% vs. 71,8 ± 8,1%). Eine usätzlichen Aktivierung durch Inkubation mit 6-DMAP führte jedoch zu einer signifikant höheren Blastozystenrate als nach alleiniger elektrischer Aktivierung (40,4

± 10,5% vs. 26,5 ±8,1%), wobei zwischen den Blastozysten beider Gruppen kein Unterschied hinsichtlich der Zellzahl bestand (22,7 ± 3,1 vs. 20,6 ± 2,1). Aufgrund des höheren Entwicklungspotentials nach Aktivierung durch zusätzliche 6-DMAP Inkubation, wurde das kombinierte Aktivierungsregime in allen weiteren

xperimenten zur Aktivierung von Kerntransferkomplexen eingesetzt.

.1.7 Versuche zur Aktivierbarkeit

m Fusion und Aktivierung der Kerntransferkomplexe zu optimieren, wurden beide

Vorgänge ze rung der zu

fusionierenden Komplexe durch den Fusionsvorgang sollte verhindert werden.

Durchgänge (n) n=6 n=6

(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)

itlich voneinander getrennt, denn eine vorzeitige Aktivie

Desh e

g 33 stellt die ktivierungsraten, bestimmt anhand der Teilungsraten nach 48 Stunden Kultur in NCSU23-Medium, graphisch dar: Etwa 30% der Oozyten, die dem elektrischem ten sich (29,1 ± 3,5%).

alb wurden verschiedene Fusionsmedien, in Hinblick auf die Fähigkeit ein Fusion ohne begleitende Aktivierung einzuleiten, geprüft. In 5 Durchläufen wurden dafür 908 in vitro gereifte Oozyten in drei verschiedenen Medien (SOR2, SOR2 Ca-free und Boquest) einem elektrischen Feld (10 V DC, 99 µs) ausgesetzt, das später auch zur Fusion von Kerntransferkomplexen eingesetzt werden sollte. Eine vierte Oozytengruppe („0-Kontrolle“) wurde für einige Minuten in SOR2-Fusionsmedium aufbewahrt, ohne dass ein elektrisches Feld angelegt wurde. Abbildun

Fusionsfeld im SOR2 Medium ausgesetzt wurden, teil

Hochsignifikant weniger Oozyten aus den kalziumfreien Medien (SOR2 Ca-free: 8,9

± 2,7%, Boquest: 6,7 ± 7,6%) und der „0-Kontrolle“ (1,1 ± 1,5%) befanden sich im 2-Zellstadium. Für alle Fusionsversuche an Kerntransfer-Embryonen wurden deshalb ausschließlich SOR2 Ca-free und Boquest-Fusionsmedium verwendet.

Abbildung 33: Einfluß des Fusionsmediums auf die parthenogenetische Aktivierung porziner MII-Oozyten während der Fusion (x ±SD)

0 5 10 15 20 25 30

35

ate (%)

(ANOVA, Tukey Test: a:bc < 0,001 b:c < 0,05)

SOR2 Boquest SOR2 Ca-free 0-Kontrolle c

bc b

eilungsrT

4.2 In-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen In dieser Versuchsphase wurde das mit Hilfe des „parthenogenetischen Modells“

entwickelte Kerntransfer-Protokoll auf die Erzeugung von Kerntransfer-Komplexen übertragen. Durch Auswertung von Experimenten zur Fusion und zur In-vitro- Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen, wurden weitere Einflussfaktoren bestimmt, die die Effizienz der einzelnen Arbeitsschritte im Kerntransferprotokoll und die In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimierten.

4.2.1 Auswahl eines geeigneten Fusionsmediums

In diesem Versuch wurden zwei Fusionsmedien, das Boquest-Fusionsmedium und das SOR2 Ca-free Medium, hinsichtlich der Fusionseffizienz überprüft. Für beide Fusionsmedien wurden an jeweils 4 Versuchstagen 35-52 Fibroblasten-Oozytenkomplexe einem elektrischem Feld (10 V DC, 99 µs) zwischen zwei

Fusionselektroden ausge t. Es zeigte sich, dass

die durchschnittliche Fusionsrate im SOR2 Ca-free Medium signifikant höher war als im Boquest Fusionsmedium (84,2 ± 5,2% vs. 67,1 ± 6,4%). Dieser Vergleich wird in Abbildung 34 graphisch dargestellt. In den folgenden Versuchen wurden alle

usionsmedium (10 V DC, 99 µs) setzt und die Fusionsraten bestimm

Fibroblasten-Oozytenkomplexe in SOR2 Ca-free F fusioniert.

Abbildung 34: Einfluß des Fusionsmediums auf die Fusionsraten porziner Fibroblasten-Oozyten Komplexe unter ansonsten konstanten Fusionsbedingungen (x ±SD)

50 55 60 65 70 75 85

Fusionsrate b

SOR2 Ca-free Boquest

90 95

(%)

80

(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)

4.2.2 Fusion von Kerntransfer-Embryonen

Zusätzlich zu den vier Durchgängen zur Ermittlung des geeigneteren Fusions-ediums, bei denen insgesamt 193 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2

Ca-en 2 ElektrodCa-en ausgesetzt wurden (10 V DC, 45 µs), wurden bei den im Anschluss stattfindenden m

free Fusionsmedium einem identischem Fusionsfeld zwisch

Hauptversuchen unterschiedlich lang gereifte Oozyten verwendet, wobei an 20 Versuchstagen insgesamt 1200 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2 Ca-free Fusionsmedium fusioniert wurden (10 V DC, 45 µs). Zusammen mit den Versuchen zur Bestimmung des geeigneten Fusionsmediums, wurden insgesamt 1393 Fibroblasten-Oozytenkomplexe, an insgesamt 24 Versuchstagen, unter identischen Fusionsbedingungen im SOR2 Medium fusioniert (10 V DC, 45 µs). Die Fusionseffizienz wurde hierbei nicht signifikant von der Reifungsdauer der Oozyten beeinflusst (38 h Reifung: 75,0 ± 9,8%, 40 h Reifung: 76,0 ± 9,8%, 42 h Reifung: 83,6

± 6,8%, 43 h Reifung: 84,2 ± 6,4%). Wenn die Gruppen 38-40 h Reifung und 42-43 h Reifung miteinander verglichen wurden, konnte jedoch eine signifikant höhere

usionsrate bei den länger maturierten Oozyten (83,8 ± 6,3% vs. 75,5 ± 9,4%) rrechnet werden. Diese Überlegenheit stellt Abbildung 35 in graphischer Form dar.

bbildung 35: Einfluss der Oozytenreifungsdauer auf die Fusionsraten daraus erstellter porzi-sten-Oozyten-Komplexe bei ansonsten identischen Fusionsbedingungen

F e

ner Fibrobla (x ±SD)

enkomplexe konnten hergestellt werden (95,7%), die mit einer urchschnittlichen Effizienz von 78,9% fusioniert werden konnten. Die durchschnittliche Blastozystenrate von insgesamt 878 fusionierten und aktivierten

(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)

4.2.3 In-vitro-Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen

In diesem Versuch wurde das Entwicklungspotential rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen ermittelt. In einem 3x3x2 Versuchsmodell wurde der Einfluss der Oozyten-Reifungsdauer (38 h, 40 h oder 42 h) und der Dauer der Kontaktinhibition der porzinen fetalen Fibroblasten (24 h, 48 h oder 72 h) untersucht. Bei zwei Wiederholungen je Kombinationsmöglichkeit, wurden an 18 Versuchstagen insgesamt 1475 Oozyten mit einer Effizienz von 78,6% enukleiert; 1113 Fibroblasten-Oozyt

Kerntransferkomplexen lag bei 9,8%. Tabelle 16 zeigt die Blastozystenraten (Mittelwert aus zwei Durchgängen) ei K tio

Tabelle 16: Blastoz rate

der nzelnen ombina nen.

ysten (x ) porzi taktinhi

ner Kerntran -Embry on zur Dauer der

Ooz nreifung und Kon b sd r d n o t 2

Während die Kontaktinhibitionsdauer der fetalen Fibroblasten keinen signifikanten Einfluss bezüglich der Blastozystenrate aufwies (9,1% vs. 9,6% vs. 10,6%), ließ sich für die Reifungsdauer der Oozyten ein hochs fikant p<0,0 E ss errechnen (9,6% vs. 14,8% vs. 4,9%). Die ste E cklun igten Kerntransfer-Em en, die aus 40 h ge en zine ozyte kons rt wu (14,8%).

Tab 7 stellt die In-vitro-E ick de konst ten K ransfe mbryonen und „Kontrollgruppen“, in ä keit Reifu dauer Oozyten, detailliert dar

Kontrolle n=6 384 75,8 ± 7,2 60,2d ± 8,7 44,1d ± 6,6 24,3b ± 4,3

42 h KT- Komplexe n=6 314 86,7 ± 4,6 5,7c ± 3,2 4,9c ± 2,1 17,1a ± 4,7

Kontrolle n=6 368 80,0 ± 9,7 56,5d ± 18,7 44,4d ± 14,8 24,3b ± 4,3

40 h KT- Komplexe n=6 279 81,1 ± 4,3 18,0b ± 1,0 14,8b ± 1,7 16,0a ± 5,8

Kontrolle n=6 373 82,4 ± 3,9 58,2d ± 10,7 47,5d ± 9,4 24,2b ± 2,7

Reifungsdauer 38 h KT- Komplexe n=6 285 82,7 ± 7,1 10,2a ± 2,1 9,6a ± 2,0 17,4a ± 4,2

Tabelle 17: In-vitro-Entwi Relation zur Reifungsdauer der Ooz Durchgänge (n) Gesamt (n) Teilungsrate (%) Embryonen > 4 Zellblock (%) Blastozystenrate (%) Zellkerne / Blastozyste (n)

cklung rekonstruierter porziner Kerntransfer-Embryonen und parthenogenetischer „Kontrollgruppen“ in yten ( ± SD) (ANOVA, Tukey Test: d:abc <0,001 b:ac < 0,001 a:c< 0,05)

Bezogen auf die Reifungsdauer (n=6) war kein signifikanter Einfluss auf die Teilungsrate (82,7 ± 7,1% vs. 81,1 ± 4,3% vs. 86,7 ± 4,6%) festzustellen. Jedoch war

er Anteil der Blastozystenstadien von Kerntransfer-Komplexen, die aus 40 h eiden anderen Gruppen (38 h: 9,6 ± 2,0%, 42 h: 4,9 ± 2,1%) hochsignifikant (p<0,001) verbessert. Die 38 h Gruppe zeigte gegenüber der 42 h Gruppe eine signifikant (p<0,05) erhöhte Blastozystenrate. Das gleiche Signifikanzmuster spiegelte sich bei der relativen Anzahl an Kerntransfer-Embryonen, die den 4-Zellblock überwand (mehr als 8 Zellkerne), wieder (10,2 ± 2,1% vs. 18,0% ± 1,0 vs. 5,7% ± 3,3). Von Abbildung 36 bis Abbildung 39 sind Entwicklungsstadien verschiedener Kerntransfer-Embryonen nach Hoechstfärbung dargestellt. Die einzelnen blauen Punkte stellen hierbei die fluoreszierenden Zellkerne der Embryonen dar. Abbildung 40 zeigt eine Gruppe von KT-Blastozysten, mit einer Morphologie, die für die im Rahmen dieser Arbeit erzeugten KT-Blastozysten typisch war. Einige der im Rahmen dieser Arbeit erzeugten Kerntransfer-Blastozysten schlüpften am Tag 7 (Abbildung 41). Im Gegensatz zu den Kerntransfer-Embryonen zeigten die parthenogenetisch aktivierten „Kontrollgruppen“ mit Reifungszeiten von 38 h, 40 h und 42 h, weder im Bezug auf die Teilungsrate (82,4% vs. 80,0% vs. 75,8%) noch auf Blastozystenrate 5% vs.

60,2%), signifikante Unterschiede. Die durchschnittliche Kernzahl pro arthenogenetischer Blastozyste war nahezu identisch (24,2 vs. 24,2 vs. 24,3). Im

yonen jedoch hochsignifikant häufiger das 4-Zellstadium (56,5 - 60,2% vs. 5,7 - 18,0%), erreichten zu einem hochsignifikant höheren Prozentsatz das Blastozystenstadium (44,1 - 47,5% vs. 4,9 - 14,8%) und besaßen hochsignifikant höhere durchschnittliche Kernzahlen pro Blastozyste (24,2 - 24,3 vs. 16,0 - 17,4).

gereiften Oozyten rekonstruiert worden waren (14,8 ± 1,7%), gegenüber den b

(47,6% vs. 44,4% vs. 44,1%) und Überwinden des 4-Zellblocks (58,2% vs. 56,

Vergleich zu den KT-Embryonen überwanden die parthenogenetischen Embr

Abbildung 36: Kerntransfer- Embryo im 32-Zellstadium nach Hoechstfärbung

Abbildung 37: Schlüpfender Kerntransfer- Embryo mit ~50 Zellen nach Hoechstfärbung

Abbildung 38: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~90 Zellen nach Hoechstfärbung

Abbildung 39: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~144 Zellen nach Hoechstfärbung

Abbildung 40: Schlüpfende Kerntransfer-Blastozysten an Tag 6 der In-vitro-Kultur

Abbildung 41: Geschlüpfte In-vitro-Kerntransfer-Blastozyste an Tag 7 der Kultur

4.3 In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen In dieser Versuchsphase wurde das entwickelte Kerntransfer-Protokoll, im Hinblick

uf die Fähigkeit der Kerntransfer-Embryonen eine In-vivo-Entwicklung zu urchlaufen, überprüft. Dazu wurden rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen auf

te rotokoll zusammen.

Tabelle 18 in it Embryon wur

P sc um benötigte t

a d

synchronisierte Empfängertiere übertragen. Tabelle 18 fasst das dabei verwende P

: Protokoll nach dem dieser Arbe rekonstruierte en erzeugt den

rozes hritt Medi Zei

Eizellreifung NCSU37 22+18 h

Entkumulierung Tl-Hepes 296 30 min

Polkörperselektion Tl-Hepes 296 30 min

Enukleation Tl-Hepes 296 Ca-free 2,5 h

Kerntransfer Tl-Hepes 296 Ca-free

Fusion (10 V, 99 µs) SOR2 Ca-free

2 h¹

Verweildauer Tl-Hepes 296 1,75 h

SOR2 15 min

7,5 h

elektrische Aktivierung (1,0 KV/cm, 45 µs)

6-DMAP - Aktivierung (2 mM, 3 h) NCSU23 3 h Transfer auf Empfängertiere Tl-Hepes 296

1 Kerntransfer und Fusion fanden parallel statt

4.3.1 Transfer von Kerntransfer-Embryonen auf Empfängertiere

Auf vier synchronisierte Empfängerschweine wurden chirurgisch durchschnittlich 150 rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen übertragen. Dabei wurde der Ovarbefund (Anzahl der Ovulationsstellen) erhoben. Es wurden 40 h gereifte Oozyten und fetale Fibroblasten, die sich seit ~48 h im Stadium der Kontaktinhibition befanden, zur Herstellung der Fibroblasten-Oozytenkomplexe eingesetzt. Über vier Versuchstage konnten bei einer Fusionsrate von durchschnittlich 77,1% 641 fusionierte Komplexe erzeugt werden, wobei sich insgesamt 599 Embryonen nach der Aktivierung als transfertauglich erwiesen (Tabelle 19).

Tabelle 19: Transfer porziner Kerntransfer-Zygoten auf synchronisierte Empfängerschweine

Von diesen 4 Empfängertieren hatten an Tag 26 zwei Sauen eine Trächtigkeit etabliert. In Abbildung 42 und Abbildung 43 sind die Aufnahmen der positiven Ultraschallbefunde dargestellt.

Trächtigkeitstag Sau-Nr.

Gesamt-Komplexe

fusionierte Komplexe

übertragene Komplexe

34 115

ET 10/5 200 166 83,0 161 (+) (+) 4 Ferkel

(n) (n) (%) (n) 26 33

2. ET 969/20 202 158 78,2 144 (-) (-)

3. ET 868/85 213 166 77,9 156 (+) (-) 5 Implantationen

4. ET 978/25 218 151 69,3 138 (-) (-)

x = 208 160 77,1 150

(+) : positiver Ultraschallbefund, (-) : negativer Ultraschallbefund

Abbildung 42: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 22 der Trächtigkeit

Abbildung 43: Ultraschallbild von Sau 686/85 an Tag 26 der Trächtigkeit

Abbildung 44: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 29 der Trächtigkeit

Abbildung 45: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 59 der Trächtigkeit

Die Sau mit der Stall-Nr. 686/85 zeigte jedoch am Tag 33 der Trächtigkeit Rauschesymptome. Deshalb wurde das Tier zur genaueren Uterusanalyse am Tag 34 der Trächtigkeit geschlachtet. Hierbei konnten 5 Implantationsstellen nachgewiesen werden. Das verbleibende Trägertier mit der Nr. 10/5 kam nach unauffälliger Trächtigkeit (Abbildung 44 und Abbildung 45) am 115. Tag zur Abferkelung und warf 4 Ferkel, deren Entwicklungszustand Tabelle 20 darstellt.

Tabelle 20: Entwicklungszustand und Vitalität der Klonferkel bei der Geburt

1: Ferkel Nr. 2 verstarb 8 h post partum

Von den 4 weiblichen Ferkeln verstarb eines bereits im Geburtsweg, ein zweites 8 h post partum. Durch pathologische Untersuchung konnten bei beiden Ferkeln keine Missbildungen festgestellt werden. Die verbliebenen beiden Ferkel zeigten ein unauffälliges Verhalten und erschienen morphologisch normal (Abbildung 46 und Abbildung 47). Bis heute zeigten sie eine unauffällige Entwicklung, die sich von der Entwicklung anderer Ferkel im Stall nicht unterscheidet (Abbildung 48).

Geburtsgewicht Geschlecht Vitalität

Ferkel Nr.1 1480 g weiblich tot

Ferkel Nr.2 400 g weiblich lebensschwach¹

Ferkel Nr.3 680 g weiblich munter

munter

Ferkel Nr.4 1550 g weiblich

Abbildung 46: Klonferkel Nr.3 („Björna“) am Tag nach der Geburt

Abbildung 47: Klonferkel Nr. 4 („Michaela“) am Tag nach der Geburt

onschweine auf dem europäischem Festland Abbildung 48: „Michaela“ und „Björna“, die ersten Kl

4.3.2 Bestimmung der genetischen Identität der geklonten Ferkel

Im B sche Übereinstimmung

die Tabelle 21 stellt die Ergebnisse der 12 Loci umfassenden Mikrosatelliten-Analyse von der gepoolten Zellkultur, von den 4 Ferkeln und dem Trägertier, dar.

Tabelle 21: Mikrosatellitenanalyse von Zellkultur, Ferkeln und Trägertier zum Nachweis der genetischen Abstammung der Klonferkel

Quelle des Probenmaterials

Mikro-satellit

Spender

Zellen Ferkel 1 Ferkel 2 Ferkel 3 Ferkel 4 Trägertier CGA 293/289 293/289 293/289 293/289 293/289 amplifiziert ^Nicht

S0002 208/206/18 208/206 206/188 208/206 206/188 206/198 S0090 238/237 237/237 238/237 237/237 238/237 238/237 S0101 214/212 212/212 214/212 212/212 214/212 212/212 SW122 122/116 122/116 122/116 122/116 122/116 122/112 SW632 171/165 165/165 171/165 165/165 171/165 173/173 SW951 125/123 123/123 125/123 123/123 125/123 125/125 SW857 105/94/92 105/92 105/94 105/92 105/94 110/94 SW936 109/107/97 97/97 109/107 97/97 109/107 107/97

S0068 nicht polymorph

S0178 nicht polymorph

SW911 nicht polymorph

ezug auf den Locus SW632 ist jedes Ferkel ohne alleli

mit dem Trägertier, das damit als genetische Mutter auszuschließen ist. Die Mikrosatelliten SW951 und SW857 zeigen zusätzlich, dass Ferkel 1 und Ferkel 3 biologisch nicht vom Trägertier stammen, da bei ihnen ausschließlich Allele typisiert wurden, die das Trägertier nicht besitzt. Ferkel 1 und Ferkel 3, sowie Ferkel 2 und Ferkel 4, sind im Bezug auf 12 Mikrosatelliten vollkommen identisch. Keines der Ferkel weist ein Allel auf, das nicht auch in der Zellkultur typisiert wurde, wobei Mikrosatelliten S0002, SW936 und SW857 anzeigen, dass die Zellkultur aus 2 Zellinien bestand; 3 Allele pro Locus wurden typisiert.

5 Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens zum Klonen von Schweinen mittels somatischem Kerntransfer. In der ersten Versuchsphase wurden zur Entwicklung eines KT-Protokolls entwicklungsbeeinflussende Parameter für Kerntransfer-Embryonen ermittelt. Hierzu wurden zahlreiche Versuche an einer großen Anzahl parthenogenetischer Embryonen durchgeführt, die als „Modell“

benutzt wurden. Wichtiges Kriterium war der Erhalt des Entwicklungspotentials von Eizellen außerhalb des Brutschrankes, während des Zeitraums der zur Herstellung von Kerntransferkomplexen nötig ist. Außerdem sollte eine vorzeitige (spontane) Aktivierung der Oozyten, insbesondere während der Fusion, verhindert werden, um eine effiziente, zeitlich bestimmbare, parthenogenetische Entwicklung induzieren zu können. Im zweiten Versuchsabschnitt sollte das Protokoll auf Kerntransfer-Embryonen übertragen und optimiert werden, um eine möglichst weitreichende In vitro Entwicklung geklonter porziner Embryonen zu gewährleisten. In der dritten Versuchsphase wurde das optimierte Kerntransfer-Protokoll hinsichtlich der In vivo Entwicklungsfähligkeit der erzeugten Embryonen überprüft. Dazu wurden Kerntransfer-Embryonen auf synchronisierte Empfängertiere übertragen. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit führten zur Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls, dessen Eignung durch die Geburt der ersten geklonten Ferkel auf dem europäischen Festland nachgewiesen wurde.

5.1 Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls

In dieser Versuchsphase sollten vor allem arbeitstechnische Aspekte untersucht werden, mit denen das aufwendige Verfahren des somatischen Kerntransfers optimiert und das Entwicklungspotential der Oozyte, bzw. der KT-Komplexe, während des Zeitraums der Mikromanipulation aufrechterhalten werden kann. Hierzu wurden alle Versuche im „parthenogenetischem Modell“ durchgeführt, um die Erkenntnisse in der folgenden Versuchsphase auf KT-Embryonen zu übertragen.

Durch Färbung einer repräsentativen Stichprobe konnte bei 71% der Oozyten, die für 44 h (22 h in Gegenwart von cAMP und 22 h ohne cAMP) gereift waren, eine

morphologisch normal erscheinende Metaphasenplatte identifiziert werden. Andere Autoren gaben nach gleicher Reifungsdauer geringfügig höhere Reifungsraten von 83,6% (FUNAHASHI et al. 1997), 85,2% (MIYOSHI et al. 2002) und ~90% (ZHU et al. 2002) an. In diesen Arbeiten wurden jedoch lysierte Oozyten nicht mit einbezogen, während im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Reifungsraten auf die Gesamtheit der eingesetzten Oozyten bezogen wurden. Eine dieser Autorengruppen verwendete außerdem ein anderes Reifungsmedium (MIYOSHI et al. 2002). Die Ermittlung der Reifungsrate war zur Beurteilung der nachfolgenden Versuche im

„parthenogenetischen Modell“ von großer Bedeutung, da für diese Versuche nach der Reifung keine Selektion der Oozyten betrieben werden konnte.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die elektrische Aktivierung porziner Oozyten eine Feldstärke von 1,0 KV/cm als am besten geeignet ermittelt. Dies deckt sich mit Untersuchungen anderer Autoren (BETTHAUSER et al. 2000; ZHU et al. 2002). Oft ist auch eine Feldstärke von 1,2 KV/cm benutzt worden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b). Diese höheren Feldstärken waren jedoch mit kürzeren Impulslängen verbunden. Die letztgenannten Autoren verwendeten ein elektrisches Feld von 1,2 KV/cm für 30 µs; in der vorliegenden Arbeit wurde dagegen ein elektrisches Feld von 1,0 KV/cm für 45 µs erzeugt und hierdurch eine artifizielle Teilungsrate von 72,9% erreicht. Die danach erreichte Blastozystenrate von 29,6% deckt sich mit der Blastozystenrate von ZHU et al.

(2002), die bei gleicher Feldstärke eine Blastozystenrate von 29% erreichen konnten.

Andere Autoren erreichten bei alleiniger elektrischer Aktivierung eine Blastozystenrate von 25% (JOLLIFF u. PRATHER 1997), 22,4% (KOO et al. 2000) und 18% (PARK et al. 2001b). Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine zusätzliche Stimulierung der Oozyten nach der elektrischen Aktivierung mit 6-DMAP für 3h, gegenüber der alleinigen Elektrostimulation, zu einer signifikant verbesserten Blastozystenrate führt. Diese Beobachtung wurde kürzlich von weiteren Autorengruppen (GRUPEN et al. 2002; ROH u. HWANG 2002) bestätigt. Die erstgenannte Arbeitsgruppe konnte bei zusätzlicher Aktivierung mit 6-DMAP einen schnelleren und anhaltenderen Abfall der MPF-Aktivität als bei alleiniger Elektrostimulation nachweisen (GrUPEN et al. 2002). Dies spricht für einen stärkeren

Stimulus durch die kombinierte Aktivierung, was auf die Stimulation einer zusätzlichen Aktivierungskaskade durch 6-DMAP zurückzuführen sein könnte, die durch das elektrische Feld nicht stimuliert wird. Diese Autorengruppe stellte fest, dass bei alleiniger elektrischer Aktivierung der porzinen Oozyten die MPF-Aktivität bereits nach 8 Stunden wieder auf höhere Werte als bei unaktivierten Oozyten ansteigt und damit von der physiologischen Situation abweicht. Es wird vermutet, dass ein vorzeitiger erneuter Anstieg der MPF-Aktivität durch Inaktivierung der MAPK verhindert werden kann (LIU u. YANG 1999). Da 6-DMAP unter anderem die MAPK inaktiviert, schließen die Autoren daraus, dass eine kombinierte Aktivierung durch Elektrostimulation und 6-DMAP den Verlauf der MPF-Aktivität bei der Aktivierung durch ein Spermium exakter wiederspiegelt als eine alleinige Elektrostimulation (GRUPEN et al. 2002). Zusätzlich wurde gezeigt, dass 6-DMAP zu einem hohen Prozentsatz die Ausschleusung der Polkörper nach der Aktivierung verhindert, was bei parthenogenetisch aktivierten Embryonen zu einem höheren Prozentsatz diploider Embryonen als nach Aktivierung durch alleinigen Elektrostimulus führt (LEAL u. LIU 1998). Die verbesserte Entwicklungskompetenz diploider parthenogenetischer Embryonen gegenüber haploiden Embryonen wurde bereits früher berichtet (KURE-BAYASHI et al. 1996). Die Retention des Polkörpers ist darüber hinaus auch beim somatischen Kerntransfer wichtig, falls diploide Spenderzellen aus der G0/G1 Phase benutzt werden (CAMPBELL et al. 1996a).

Obwohl die Versuche zur Aktivierung zeigten, dass ein hoher Prozentsatz der gereiften Oozyten in der Lage war sich nach der Aktivierung zu (parthenogenetischen) Blastozysten zu entwickeln, war es enorm schwierig, gereifte Oozyten anhand des ausgeschleusten Polkörpers für die Mikromanipulation zu selektieren, denn der subzonale Spalt, der in dieser Arbeit gereiften Ooyzten, war sehr schmal. Deshalb wurde durch Zusatz von Sucrose die Osmolarität des Arbeitsmediums um 25-50 mOsmol erhöht. Durch die Erhöhung des osmotischen Drucks schrumpften die Oozyten geringgradig, was die Perivitellarräume erweiterte und das Auffinden der Polkörper erleichterte. Dieses Vorgehen wurde ursprünglich zur Aufweitung der Perivitellarräume von Kaninchenoozyten angewendet. In diesen Arbeiten führten selbst Konzentrationen von 0,5 M Sucrose (für 60 min) nicht zu

Einschränkungen der weiteren Entwicklung (YANG et al. 1990a; YANG et al. 1990b).

Ein Zusatz von Sucrose wurde auch bei Oozyten von Rindern und Mäusen eingesetzt (WANG et al. 2001; LIU et al. 2002a), um die perivitellinen Räume der Oozyten aufzuweiten. In einem Experiment zur Abklärung eines potentiell schädlichen Einflusses des Sucrosezusatzes, wurden Oozyten Arbeitsmedien mit verschiedenen Osmolaritäten, eingestellt duch Sucrosezusatz, für 7,5 Stunden ausgesetzt und anschließend im elektrischem Feld aktiviert. Hierbei zeigte sich eine signifikant verbesserte Entwicklung bis zur Blastozyste, wenn die Osmolarität der Arbeitsmedien durch Sucrosezusatz von 271 mOsmol auf 296 oder 321 mOsmol erhöht worden war (18,3% vs. 24,4% vs. 26,2%). Worauf der positive Effekt des Sucrosezusatzes beruht, ist noch ungeklärt. Auszuschließen ist, dass Sucrose einen direkten positiven Einfluss als Energiequelle ausübt, denn Sucrose kann von der Oozyte nicht aufgenommen werden (SAITO et al. 1994). Durch Schrumpfen des Zytoplasmas der Eizelle wird die Konzentration verbleibender Proteine im Zytoplasma erhöht. Dies könnte protektive Wirkung auf den Erhalt des Entwicklungspotentials der Ooyzte ausüben. Ferner ist gezeigt worden, dass die Osmolarität die Stabilität des Zytoskelettes der Oozyte beeinflusst (SAITO et al.

1994; WANG et al. 2001). Da das Reifungsmedium der vorliegenden Arbeit (NCSU37) eine Osmolarität von 296 mOsmol aufwies, ist vorstellbar, dass eine niedrigere Osmolarität des Arbeitsmediums von 271 mOsmol über einen Zeitraum von 7,5 Stunden bereits die Organisation des Zytoskelettes beeinflusste und so das Entwicklungspotential der Oozyten beeinträchtigte. Erst kürzlich konnte eine Autorengruppe zeigen, dass die Osmolarität in den ersten 48 h der In vitro Kultur einen starken Einfluss auf die parthenogenetische Entwicklung ausübt (NGUYEN et al. 2003). Da es in dieser Phase der vorliegenden Arbeit jedoch in erster Linie um den Erhalt einer möglichst hohen Entwicklungsfähigkeit der Oozyten ging, und weniger um genaue biochemische Zusammenhänge, wurde dieser Frage nicht weiter nachgegangen. Dies wäre jedoch sicherlich ein interessanter Aspekt für Folgeexperimente.

Um später eine gezielte, zeitlich abstimmbare, artifizielle Aktivierung der rekonstruierten Kerntransfer-Komplexe zu ermöglichen, musste eine vorzeitige

(spontane) Aktiverung dieser Komplexe verhindert werden, denn die Fusion eines Spenderkerns mit einer aktivierten Oozyte führt zu einer schlechteren Entwicklung als wenn hierzu eine nicht aktivierte Ooyzte verwendet wird (TANI et al. 2001). Eine spontane Aktivierung porziner Oozyten stellte in früheren Arbeiten ein wesentliches Problem dar, da 29% der Oozyten die meiotische Arretierung auch ohne einen artifiziellen Stimulus überwanden (REICH 2001). Insbesondere während der Fusion sollte eine vorzeitige Aktivierung der Oozyten verhindert werden, da eine zur Fusion zeitlich verzögerte Aktivierung von vielen Arbeitsgruppen als positiv bewertet wird (ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; DE SOUSA et al.

Im Dokument Experimentelle Untersuchungen zum somatischen Klonen beim Schwein (Seite 115-0)