Entwicklungspotential von Kerntransfer-Embryonen

Im Rahmen des Kerntransfers wird in der Literatur von Fusionsraten zwischen 68,4%

(PARK et al. 2001a) und 90,2% (MIYOSHI et al. 2002) berichtet. Diese beiden Werte können allerdings nicht mit den Fusionsraten dieser Arbeit verglichen werden, da PARK et al. (2001) in vivo gereifte Oozyten und MIYOSHI et al. (2002) Oozyten, die mit 24 h extrem kurz gereift waren, benutzten. Bezogen auf In vitro Reifungszeiten von 42-44 h, wurden Fusionsraten von 70,0% (LEE et al. 2003a) bis 86,8%

(MIYOSHI et al. 2002) berichtet. Diese Werte sind mit den Ergebnissen dieser Arbeit gut vergleichbar, nur MIYOSHI et al. (2002) berichtete von einer höheren Fusionsrate. Ursächlich für die hohen Fusionsraten in der vorliege

die Differenz der Osmolaritäten zwischen Arbeitsmedium (Tl-Hepes296: 296 mOsmol) und Fusionsmedium (SOR2: 256 mOsmol) sein. Da sich der subzonale Spalt, aufgrund der hohen Osmolarität während des Kerntransfers, relativ weit darstellt, gelingt der Transfer des Fibroblasten unter die Zona pellucida leicht. Wenn dieser Spalt später aufgrund der geringen Osmolarität im Fusionsmedium verstreicht, führt dies zu einem engen Kontakt zwischen Oozyte und Fibroblast, was für die Fusion als positiv beschrieben wurde (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982).

Die Dauer der Reifung übte einen Einfluss auf die Fusionsrate der Fibroblasten-Oozytenkomplexe aus. Oozyten, die für 42-43 h gereift waren, konnten signifikant

häufiger als Oozyten, die für 38-40 h gereift waren, fusioniert werden (83,8% vs.

75,5%). Das ist ein Ergebnis, das für das Schwein bisher noch nicht beschrieben worden ist. Interessant ist jedoch, dass die höchsten bisher im Rahmen des Kerntransfers veröffentlichten Fusionsraten (90,2%) bei der Fusion mit den am kürzesten gereiften Oozyten erreicht wurden (MIYOSHI et al. 2002). Eine höhere Fusionsrate älterer Oozyten beschrieben allerdings einige Autoren für das Rind (SIMS et al. 1991; RAO et al. 1993).

In der besten Kerntransfergruppe der vorliegenden Arbeit konnte eine Teilungsrate von 81,1% und eine Blastozystenrate von 14,8% erreicht werden. Das Aktivierungsregime dieser Arbeit wurde auch von anderen Autoren zur Aktivierung rekonstruierter Komplexe nach somatischem Kerntransfer eingesetzt und führte zur Geburt lebender Ferkel (WALKER et al. 2002; YIN et al. 2002). Während YIN et al.

(2002) in vitro eine Blastozystenrate von 11% erreichten, berichten WALKER et al.

(2002) von dem bisher höchsten Anteil an In vivo Entwicklung, wobei nach Transfer von 510 Kerntransfer-Zygoten auf 5 synchronisierte Empfängertiere 28 Ferkel (5,5%) geboren wurden. Andere Arbeitsgruppen erreichten mit anderen Aktivierungsprotokollen Teilungsraten zwischen 38,9% (IKEDA u. TAKAHASHI 2001) und 94,2% (LEE et al. 2003b). Innerhalb dieser Spannbreite sind die Teilungsraten dieser Arbeit (82,7-86,7%) im internationalen Vergleich relativ hoch. Diese Befunde zeigen, dass die Effizienz des Aktivierungsregimes, das bei den parthenogenetischen Embryonen in dieser Arbeit zu einer hohen Teilungsrate führte, auch bei der Erstellung von Kerntransfer-Embryonen effektiv war.

Nach Verwendung von 40 h gereiften Oozyten, wurde mit einer Blastozystenrate von 14,8% das beste Ergebniss erzielt. Lediglich drei Arbeitsgruppen berichten mit 21,2%

(LEE et al. 2003a), 23,0% (BOQUEST et al. 2002) und 26,0% (HYUN et al. 2003) höhere In vitro Blastozystenraten. Die Werte dieser Autorengruppen sind jedoch kaum mit denen der vorliegenden Arbeit vergleichbar. So benutzten BOQUEST et al.

(2002) ausschließlich in vivo gereifte Schweineoozyten, von denen bekannt ist, dass sie ein höheres Entwicklungspotential besitzen als in vitro gereifte Oozyten.

Außerdem müssen die Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe kritisch hinterfragt werden, da diese MII-Oozyten „blind“ enukleiert hat, und die erfolgreiche Enukleation somit

nicht kontrolliert werden konnte. Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass es sich bei einigen der Blastozysten nicht um geklonte sondern um parthenogenetische Embryonen handelte. HYUN et al. (2003) benutzten ausschließlich Oozyten von postpuberalen Sauen für die In vitro Reifung. In der vorliegenden Arbeit wurden dagegen Oozyten unbekannter Herkunft aus dem Schlachthaus, und damit größtenteils von präpuberalen Jungsauen, gewonnen. Es ist bekannt, dass Oozyten von geschlechtsreifen Sauen den Oozyten präpuberaler Jungsauen im Hinblick auf ihr Entwicklungspotential nach In-vitro-Reifung überlegen sind (MARCHAL et al.

2001). LEE et al. (2003) führten ihre hohe Blastozystenrate (21,2%) auf eine verbesserte In-vitro-Kultur zurück. Während alle anderen Arbeitsgruppen KT-Embryonen in NCSU23 Medium kultivieren, benutzte diese Arbeitsgruppe ein modifiziertes NCSU23 Medium, bei dem Laktat und Pyruvat statt Glucose die Energiequelle bilden. Die KT-Kontrollgruppe, die diese Arbeitsgruppe in normalem NCSU23 Medium kultivierte, erreichte dagegen nur eine Blastozystenrate von 10,9%.

Arbeitsgruppen, die mit vergleichbaren Oozyten als Empfängermaterial arbeiteten und KT-Embryonen in vergleichbaren Medien kultivierten wie in der vorliegenden Arbeit, berichteten eine Blastozystenrate von 15,9% (PARK et al. 2001b; LEE et al.

2003b), was den Ergebnissen dieser Arbeit entspricht.

Embryonen, die aus 38 h gereiften Oozyten rekonstruiert wurden, erreichten signifikant seltener das Blastozystenstadium als Embryonen aus Oozyten, die zuvor für 40 h gereift worden waren. Letztere erreichen das Blastozystenstadium hochsignifikant häufiger als Embryonen aus Oozyten, die für 42 h gereift worden waren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass das Zeitfenster für die technischen Schritte des Kerntransfers beim Schwein nach der In-vitro-Reifung sehr eng ist.

Bereits zuvor hatten einige Autoren spekuliert, dass der Einsatz kürzer gereifter Oozyten für den Kerntransfer vorteilhaft sein könnte (IKEDA u. TAKAHASHI 2001;

WALKER et al. 2002; MIYOSHI et al. 2002). Die ersten beiden Autorengruppen erreichten In-vitro-Blastozystenraten von 13,6 und 14,1%. Die letztgenannte Arbeitsgruppe, die die Oozyten für etwa 38 h reifte, berichtete von der bisher besten In-vivo-Entwicklung, wobei sich aus 510 Embryonen 28 lebende Ferkel entwickelten (5,5%). Es ist bekannt, dass Schweineoozyten nur in einem sehr engen Zeitfenster

befruchtet werden können, das auf etwa 6 h festgelegt ist (HUNTER 1991). Es ist ebenso bekannt, dass in vitro gereifte Oozyten einen deutlich geringeren Spiegel an Gluthation (GSH) aufweisen als in vivo gereifte Oozyten (BRAD et al. 2003). GSH spielt jedoch bei der physiologischen Befruchtung und der Vorkernbildung eine entscheidende Rolle (MAHI u. YANAGIMACHI 1975). Es wäre denkbar, dass ein verringerter GSH-Spiegel das Zeitfenster, in welchem der Kerntransfer erfolgen muss, weiter einengt, so dass eine Aktivierung 49,5 h (42 h Reifung+7,5 h bis zur Aktivierung) nach Reifungsende bereits am äußeren Rand des geeigneten Zeitfensters liegt. Darüberhinaus ist bekannt, dass ältere MII-Oozyten leichter aktivierbar sind (KIKUCHI et al. 2000). Daher ist auch vorstellbar, dass ein höherer Anteil der länger gereiften Oozyten bereits bei der Fusion aktiviert wurde als dies bei den kürzer gereiften Oozyten der Fall war. Eine verzögerte Aktivierung nach Fusion gilt jedoch als positiv für die „Reprogrammierung“ des Spenderkernes nach Kerntransfer (ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; DE SOUSA et al. 2002). Auf der anderen Seite benötigen Oozyten bei der Reifung für die zytoplasmatische Reifung in vitro eine Zeitspanne von mindestens 38 h (Überblick: PRATHER & DAY 1998). Doch da die Aktivierung bei der kürzer gereiften Gruppe (38 h) 45,5 h nach Reifungsbeginn stattfindet, ist es unwahrscheinlich, dass der Abfall der Blastozystenrate bei Nutzung der 38 h Gruppe, auf eine unvollständige zytoplasmatische Reifung zurückzuführen ist. Es stellt sich die Frage, ob der ermittelte Einfluss der Reifungsdauer nicht auf einen Selektionseffekt bezüglich der Oozyten zurückzuführen ist, der durch die Reifungsdauer beeinflusst wird. Im verwendeten Reifungsprotokoll werden die Oozyten für die ersten 22 h der Reifung cAMP ausgesetzt, das Oozyten im Germinal Vesikel Stadium II (GVII) arretiert.

Dadurch wird eine bessere Entwicklungssynchronität erreicht (FUNAHASHI et al.

1997). So arretierte Oozyten erreichen etwa ab 16 h nach Überführen in ein cAMP-freies Medium (38 h Gesamtreifungszeit) das erwünschte MII-Stadium (FUNAHASHI et al. 1997; ZHU et al. 2002; MIYOSHI et al. 2002). Allerdings können sich unmittelbar zu Beginn der Reifung bereits 23% der Oozyten in einem Stadium jenseits von GV II befinden, und werden deshalb durch cAMP nicht in ihrem meiotischem Fortschreiten gehindert (FUNAHASHI et al. 1997). Letztere bilden eine

2. Oozytenpopulation mit einer abweichenden Entwicklungsgeschwindigkeit. Nach 24 h Gesamtreifungszeit haben bereits ~35% aller eingesetzten Oozyten das MII-Stadium erreicht, wobei davon auszugehen ist, dass es sich dabei um Oozyten handelt, die ungehindert meiotisch fortgeschritten sind (MIYOSHI et al. 2002). 16 Stunden nach Überführen in ein cAMP-freies Medium (38 h Gesamtreifungszeit) ermittelte die gleiche Autorengruppe eine Reifungsrate von 67,5%, nach 44 h Gesamtreifungszeit waren es schließlich 85,2%. Wenn alle gereiften Oozyten aufgrund der Präsenz eines Polkörpers nach einer Gesamtreifungszeit von 38 h selektiert werden, so befinden sich von den selektierten Oozyten, die zu diesem Zeitpunkt etwa 67,5% aller Oozyten ausmachen, etwa 35 % seit ca. 14 h im MII-Stadium. Das sind 50% der für den Kerntransfer ausgewählten Oozyten. Solche Oozyten werden als gealtert bezeichnet, und es ist bereits früher gezeigt worden, dass sie ein vermindertes Entwickungspotential besitzen (KIKUCHI et al. 2000;

FISSORE et al. 2002). Selektiert man Oozyten allerdings erst 40 h nach Reifungsbeginn auf die Anwesenheit eines Polkörpers, so ist der relative Anteil der gealterten Oozyten auf etwa 1/3 zurückgegangen, da die Gesamtzahl der frisch gereiften Oozyten angestiegen ist (MIYOSHI et al. 2002). Für einen Einfluss gealterter Oozyten spricht zudem, dass sich die Teilungsrate in den verschiedenen Gruppen gegensätzlich zur Blastozystenrate darstellte (keine Signifikanz). Dies ist plausibel, denn gealterte Oozyten sind sehr leicht aktivierbar (FISSORE et al. 2002).

Diese Vermutung wird auch dadurch untermauert, dass bei den parthenogenetischen

„Kontrollgruppen“ kein Einfluss der Reifungsdauer auf die Blastozystenrate auftrat.

Da die parthenogenetischen Gruppen zuvor nicht auf die Anwesenheit eines Polkörpers selektiert wurden, ist davon auszugehen, dass der Anteil der gealterten Oozyten in allen 3 Gruppen nahezu identisch war. Damit ist zu erklären, weshalb Oozyten, die 40 h nach Reifungsbeginn selektiert wurden, eine bessere Entwicklung nach Kerntransfer aufweisen als Oozyten, die bereits nach 38 h selektiert wurden.

Zusätzlich wurde beschrieben, dass bei Schweineoozyten, die den Polkörper in vitro erst nach 40 h oder später bilden, eine höhere Wahrscheinlichkeit für Chromosomenabnormalitäten (unreduzierte Chromosomensätze, Anaploidien und hyperhaploide Chromosomensätze) vorliegt als bei schneller gereiften Oozyten

(SOSNOWSKI et al. 2003). Vor diesem Hintergrund würde eine Selektion der Oozyten auf Anwesenheit eines Polkörpers nach 42 h zu einem gehäuften Einsatz abnormaler Empfängeroozyten im Kerntransfer führen als eine Selektion nach 38 oder 40 h. Zwar werden die Chromosomen im Zuge der Enukleation entfernt, doch die Abnormalitäten können auch den Spindelapparat, Zytoskelett oder zytoplasmatische Faktoren betreffen. Diese Oozyten sind als Empfängerzellen für den somatischen Kerntransfer ungeeignet. Ebenso bedingen einzelne

atischen Spenderkerne steht, Chromosomenbrüche oftmals eine unvollständige Enukleation, was zu abnormen Ploidien nach Kerntransfer führt.

Die gleichen Signifikanzverhältnisse wie bei der Blastozystenrate zeigten sich in Abhängigkeit zur Reifungsdauer hinsichtlich der Rate an Embryonen, die das 4-Zellstadium überwanden. Dieser Einfluss der Reifungsdauer trat bei der parthenogenetischen „Kontrollgruppe“ nicht auf. Darüber hinaus überwanden die parthenogenetischen Embryonen das 4-Zellstadium (>8 Zellkerne) hochsignifikant häufiger. In der vorliegenden Arbeit teilten sich jeweils ~80% der parthenogenetischen „Kontroll“-und Kerntransfer-Embryonen zum 2-Zeller. Während jedoch ~58% der parthenogenetischen „Kontroll“-Embryonen den 4-Zellblock überwanden, schafften dies in Abhängigkeit zur Reifungsdauer der Oozyten nur 10-18% der Kerntransfer-Embryonen. Daher kann man vermuten, dass die präimplantative Entwicklung von KT-Embryonen durch einen für KT-Embryonen spezifischen Effekt beeinflusst wird. Denkbar ist, dass dieser Effekt in Zusammenhang mit der „Reprogrammierung“ der som

denn Hauptunterschied zwischen parthenogenetischen und KT-Embryonen ist die Herkunft des Zellkerns. Während die Zelllkerne von KT-Embryonen für eine präimplantative Entwicklung „reprogrammiert“ werden müssen, ist dies bei parthenogenetischen Embryonen nicht erforderlich. Die signifikant unterschiedliche Entwicklung von parthenogenetischen und Kerntranfer-Embryonen während des Zellstadiums deckt sich auch mit der Erkenntnis, dass der porzine Embryo ab dem 4-Zellstadium mRNA transkribiert (TELFORD et al. 1990; JARRELL et al. 1991).

Wahrscheinlich erlaubt nur eine erfolgreiche „Reprogrammierung“ die Translation entwicklungsrelevanter Gene ab dem 4-Zellstadium. Darüber hinaus besitzen

Embryonen, da sie auf somatische Zellen zurückgehen, Genome maternaler und paternaler Herkunft; die parthenogenetischen Embryonen besitzen dagegen nur Genome maternaler Herkunft (SURANI et al. 1984). Diese können darüber hinaus bei einigen parthenogenetischen Embryonen in haploider Form vorliegen (KURE-BAYASHI et al. 1996). Die präimplantative Entwicklung von parthenogenetischen und KT-Embryonen ist aus den oben angeführten Gründen deshalb ab dem 4-Zellstadium nicht mehr vergleichbar.

Ziel der zweiten Versuchsphase war die Optimierung des KT-Protokolls für eine effiziente In vitro Entwicklung porziner Embryonen nach somatischem Kerntransfer.

Es stellte sich heraus, dass die Übertragung der Ergebnisse aus dem erstem Versuchsabschnitt dieser Arbeit zu einer akzeptablen Entwicklung der KT-Embryonen führte. Im Rahmen der Versuche mit Kerntransferembryonen konnte routinemäßig eine Fusionsrate von 75,7-83,4% erreicht werden, was im internationalen Vergleich eine hohe Effizienz ist (MIYOSHI et al. 2002; LEE et al.

2003a). Durch weitere Experimente zur Reifungsdauer konnte die In vitro Blastozystenrate der KT-Embryonen optimiert werden (14,8%), was im internationalen Vergleich ebenfalls im oberen Bereich liegt (BETTHAUSER et al.

2000; BONDIOLI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; LEE et al. 2003b). Sie ist vermutlich die Kombination einer optimalen Reifungsdauer, eines Arbeitsmediums, das die Entwicklungsfähigkeit der Oozyte über einen langen Zeitraum aufrechterhalten kann, einer Fusion, die eine vorzeitige Aktivierung wirkungsvoll vermeidet, und eines effektiven Aktivierungsprotokolls.

Mit diesem Protokoll erstellte Kerntransfer-Embryonen wurden auf synchronisierte Empfängertiere übertragen, um die Entwicklung in vivo zu überprüfen. Es wurden durchschnittlich 150 Embryonen pro Empfängertier übertragen, was etwa das Mittel der aus der Literatur berichteten Zahlen (44-240 Embryonen) darstellt.

Autorengruppen, die mit 123 (BETTHAUSER et al. 2000), 146 (RAMSOONDAR et al.

2003), 150 (HYUN et al. 2003) und 163 Embryonen (DAI et al. 2002) eine vergleichbare Anzahl an Embryonen übertrugen, berichteten von Trächtigkeitsraten zwischen 30 und 59%, sowie einer Abferkelrate von 4,7-15%. Die durchschnittliche Wurfgröße betrug 2 Ferkel. In der vorliegenden Arbeit konnte bei 2 der 4 Sauen eine

Trächtigkeit etabliert werden, wovon eine zur Abferkelung kam und 4 Ferkel warf.

Zwei der Ferkel waren vital. Diese Werte entsprechen den aus der Literatur gemeldeten Erfolgsraten. Dieser Versuchsabschnitt erbrachte damit den eindeutigen Nachweis, dass das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte KT-Protokoll eine In-vivo- Entwicklung bis zur Geburt lebender Ferkel erlaubt. Von diesen Ferkeln wies keines Anzeichen des LOS auf. Ähnlich wie schon bei anderen Arbeitsgruppen zuvor (PARK et al. 2002; LAI et al. 2002a; ARCHER et al. 2003) wurde ein sehr leichtes Ferkel geboren. In der vorliegenden Arbeit wog Klonferkel Nr. 2 lediglich 400 g. Die anderen Ferkel lagen mit Geburtsgewichten zwischen 680 g und 1550 g innerhalb der Norm.

An den verstorbenen Ferkeln konnten keine pathologischen Befunde festgestellt werden. Für Klonferkel Nr. 1, das mit einem Gewicht von 1480 g körperlich gut entwickelt war, ergab die pathologische Untersuchung, dass der Tod im Geburtsweg eintrat. Da das Trägertier eine erstgebärende Jungsau war, könnte das Ferkel relativ lange im Geburtsweg gesteckt haben und der Tod aufgrund einer gerissenen Nabelschnur durch Sauerstoffmangel eingetreten sein. Pathologische Befunde, die auf eine andere Todesursache schliessen lassen, wurden nicht erhoben. Die verbliebenen beiden Ferkel waren frei von klinischen Befunden und entwickeln sich bis heute körperlich normal. Sie zeigen ein „unbekümmertes“ normales Verhalten, das ihrem Alter entspricht und sich nicht von dem anderer Jungschweine des selben Stalles unterscheidet. Diese Beobachtung deckt sich mit Berichten anderer Autoren, die ebenfalls über eine normale körperliche Entwicklung geklonter Schweine berichteten (CARTER et al. 2002), und keine Verhaltensabnormalitäten erkennen konnten (CARTER et al. 2002; ARCHER et al. 2003).

Zur Aufrechterhaltung der Gravidität müssen Schweineembryonen an den Tagen 11-14 eine ausreichende Menge Östradiol17ß produzieren (HEAP et al. 1979a; HEAP et al. 1981), wozu mindestens 4-5 Embryonen nötig sind (POLGE et al. 1966; POPE et al. 1972). Um dies zu gewährleisten, wird meistens eine große Anzahl KT-Zygoten (100-200) übertragen (BETTHAUSER et al. 2000; DAI et al. 2002; HYUN et al. 2003;

RAMSOONDAR et al. 2003). Es ist jedoch bekannt, dass besonders Jungsauen eine begrenzte Uteruskapazität für sich entwickelnde Früchte aufweisen, so dass eine erhöhte Embryonensterblichkeit zur Regulierung der Gravidität ein normaler

biologischer Vorgang ist (BOSTEDT 1995). Der Transfer einer geringeren Embryonenzahl mit verbesserter Qualität wäre deshalb ein Vorteil, denn eine hohe Anzahl übertragener Embryonen führt zu einer Platzkonkurrenz und damit möglicherweise zu einer zusätzlich erhöhten Embryonensterblichkeit (BOSTEDT 1995). Dies könnte durch Verbesserungen der In vitro Kultur erreicht werden. Einen guten Ansatzpunkt hierzu könnte die kürzlich veröffentlichte Arbeit von LEE et al.

(2003c) darstellen, die in ihren Experimenten, durch Veränderung der Energiequelle des Kulturmediums, eine Verdopplung der Blastozystenrate (21,2% vs. 10,9%) erreichen konnten. Eine verbesserte präimplantative In-vitro-Entwicklung der Embryonen würde eine bessere Selektion der zu übertragenden Embryonen erlauben, die dann zu einem späteren Zeitpunkt in kleinerer Zahl, „unblutig“

intrauterin übertragen werden könnten (GALVIN et al. 1994; HAZELEGER et al.

2000).

Ein weiterer Aspekt der zukünftig erforscht werden sollte, stellt die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit bei weniger als 4 Embryonen an den Tagen 11-14 dar. Damit Trächtigkeiten auch ausgetragen werden, falls nur 1 bis 3 KT-Embryonen eine normale Entwicklung bis Tag 14 erreichen, wurden Empfängertiere von mehreren Autoren zusätzlich zu den transferierten KT-Embryonen besamt (PRATHER et al.

1989a; ONISHI et al. 2000). Mit diesem Ansatz wurden einzelne lebende Klone ausgetragen. Bekannt ist jedoch, dass sich die Anzahl der Embryonen in der Gebärmutter, durch direkte Konkurrenz der Embryonen untereinander, verringern kann (BOSTEDT 1995). Betroffen sind besonders die Embryonen, die in ihrer Entwicklung zurück geblieben sind (POPE et al. 1990). Dies würde somit auch für KT-Embryonen zutreffen, denn diese besitzen ein geringeres Entwicklungspotential als Embryonen aus sexueller Vermehrung (HAO et al. 2003). Andere Arbeitsgruppen

wurden lebende Klon-Ferkel geboren (BETTHAUSER et al. 2000). Es ist übertrugen zusätzlich zu den Kerntransfer-Embryonen parthenogenetische „Helfer-Embryonen“ (BETTHAUSER et al. 2000; DE SOUSA et al. 2002). Da diese eine eingeschränkte Entwicklungskapazität besitzen und sich in vitro höchstens bis Tag 29 entwickeln (KURE-BAYASHI et al. 2000), sollte so eine schädliche Konkurrenzsituation für die KT-Embryonen umgangen werden. Auch mit diesem Ansatz

jedoc Arbeiten auf die

te h unklar, ob der Erhalt der Trächtigkeit in diesen

Helferembryonen zurückzuführen ist. Selbst wenn letztlich weniger als 4 Ferkel geboren werden besteht die Möglichkeit, dass mehr als 4 KT-Embryonen Tag 14 der Entwicklung erreichten und erst später abgestorben sind. LAI et al. (2002) berichten nach Transfer von durchschnittlich 113 Kerntransfer-Embryonen und zusätzlicher Übertragung von Helfer-Embryonen (Anzahl nicht genannt), dass 5 von 7 Trägersauen eine Trächtigkeit etablierten. Dennoch wurden aus diesen 5 Trächtigkeiten keine Ferkel geboren. Dies könnte darauf hindeuten, dass parthenogenetische Embryonen in der frühen präimplantativen Phase keineswegs eine eingeschränkte Entwicklung aufweisen. Für diesen Fall würde eine hohe Anzahl parthenogenetischer Embryonen die Entwicklungsmöglichkeiten der KT-Embryonen durch direkte Konkurrenz einschränken. Durch die Östradiol-17ß-Produktion parthenogenetischer Embryonen könnte die Trächtigkeit zudem auch aufrechterhalten werden, falls kein KT-Embryo implantiert hat, ehe die Trägersauen nach dem Absterben der parthenogenetischen Embryonen umrauschen. Eine andere Möglichkeit des Erhalts der Trächtigkeit besteht in der Zufuhr von exogenem Östradiol-17ß (GEISERT et al. 1991). Diese Strategie resultierte im Rahmen des Kerntransfers noch nicht zu geborenen Ferkeln. Andere Arbeitsgruppen induzierten durch Administration von Gonadotropinen an Tag 9 und 11 der Trächtigkeit ein zusätzliches Follikelwachstum, wodurch von den Follikeln zusätzlich endogenes Östradiol17ß produziert wurde (CHRISTENSON u. DAY 1971). Dieser Ansatz führ bei mehreren Arbeitsgruppen zur Geburt lebender Klonferkel (POLEJAEVA et al.

2000; WALKER et al. 2002). Es ist jedoch ungeklärt, ob der Erhalt der Trächtigkeit in diesen Arbeiten auf den Hormoneinsatz zurückzuführen ist, denn die Anzahl der Embryonen, die Tag 14 der Entwicklung erreichte, ist auch hier unbekannt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden den Trägersauen Hormondosen wie schon zuvor von WALKER et al. (2002) injiziert. Diese Hormonapplikationen beeinträchtigten die bestehenden Trächtigkeiten nicht. Da die Wurfgröße jedoch 4 Ferkel betrugt bleibt auch hier unklar, ob die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit eine Folge der Hormonapplikation darstellt oder eventuell auch ohne diese fortbestanden hätte.