Molekularbiologische Untersuchungen der Genexpression der Nonapeptid-Hormone Mesotocin und Arginin-Vasotocin beim Huhn

Molekularbiologische Untersuchungen der

Genexpression der Nonapeptid-Hormone Mesotocin und Arginin-Vasotocin beim Huhn

THESE

zur Erlangung des Grades eines

PHILOSOPHICAL DOCTOR - Ph.D. -

im Fachgebiet Physiologie

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Almut Köhler aus Schwelm

Hannover 2000

gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Graduiertenkollegs

„Zell- und Molekularbiologie in der Tiermedizin“ an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Supervisor: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff und Dr. Roland Großmann

Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff Prof. Dr. Richard Ivell

Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-Petersen

1. Gutachten: Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff

(Institut für Tierzucht und Tierverhalten, Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft)

Prof. Dr. Richard Ivell

(Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung, Universität Hamburg)

Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-Petersen

(Institut für Reproduktionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover) 2. Gutachten: Prof. Dr. Rüdiger Gerstberger

(Institut für Veterinär-Physiologie, Justus-Liebig-Universität Giessen)

Datum der mündlichen Prüfung: 8.12.2000

Meiner Mutter und meiner Oma, die immer für mich da sind

1 EINLEITUNG ...11

2 LITERATURÜBERSICHT...13

2.1 EVOLUTION DES ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-SYSTEMS...13

2.2 MORPHOLOGIE DES ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-SYSTEMS...17

2.3 ONTOGENESE DES HYPOTHALAMO-NEUROHYPOPHYSÄREN SYSTEMS...21

2.4 EINFLÜSSE VON STEROIDHORMONEN UND SEXDIMORPHISMUS...24

2.5 NEUROHYPOPHYSÄRE HORMONE UND VERHALTEN...28

2.6 EINFLÜSSE AUF DIE NONAPEPTID-KONZENTRATION IN PLASMA UND ZNS ...34

2.7 FUNKTIONEN VON NEUROHYPOPHYSÄREN HORMONEN IN DER NIERE UND IM KARDIOVASKULÄREN SYSTEM...41

2.8 ARGININ-VASOTOCIN, MESOTOCIN UND REPRODUKTION...43

2.9 ARGININ-VASOTOCIN- UND MESOTOCIN-REZEPTOREN...45

3 FRAGESTELLUNG...48

4 MATERIAL...49

4.1 TIERE UND GEWEBE...49

4.2 PUFFERLÖSUNGEN...49

4.3 PLASMIDE...50

4.4 ENZYME, CHEMIKALIEN, RADIOCHEMIKALIEN, NÄHRMEDIEN, NÄHRLÖSUNGEN...50

4.5 GERÄTE...51

5 METHODEN ...51

5.1 KULTIVIERUNG DER SONDEN-DNA IN BAKTERIEN...51

5.1.1 Herstellung kompetenter Zellen ... 51

5.1.2 Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid ... 52

5.1.3 Minipräparation ... 52

5.1.4 Maxipräparation... 53

5.1.5 Konzentrationsbestimmung von DNA ... 53

5.2 HERSTELLUNG DER DNA-SONDE AUS DEM ISOLIERTEN PLASMID...54

5.2.1 Restriktion des Plasmids mittels Enzymen ... 54

5.2.2 Auftrennung der Sonden-DNA von der Plasmid-DNA... 55

5.2.3 Elutions-Verfahren zur Gewinnung der isolierten Sonden- DNA... 56

5.2.4 Konzentrationsbestimmung der eluierten DNA ... 56

5.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER CDNA-SONDE...57

5.3.1 Markierung der Gensonde... 57

5.3.2 Random Priming ... 58

5.4 SOUTHERN BLOT...59

5.4.1 Extraktion von DNA aus Hühnerblut... 59

5.4.2 Konzentrationsbestimmung der DNA... 60

5.4.3 Restriktion ... 60

5.4.4 Gelelektrophorese... 60

5.4.5 Southern Blotting ... 61

5.4.6 Hybridisierung... 61

5.4.7 Auswertung der Southern Blots ... 61

5.5 NORTHERN BLOT...61

5.5.1 RNA-Extraktion ... 61

5.5.2 Konzentrationsbestimmung der RNA ... 63

5.5.3 Auftrennung der RNA im Agarose-Gel ... 63

5.5.4 Northern Blotting... 65

5.5.5 Hybridisierung mit mRNA-spezifischen Gensonden ... 66

5.5.6 Auswertung der Northern Blots ... 67

5.5.7 RNase H-Verdau ... 68

5.6 IN-SITU-HYBRIDISIERUNG...69

5.6.1 Behandlung von Plastikmaterial, Glaswaren und Metall gegen RNase ... 69

5.6.2 Beschichtung der Objektträger... 70

5.6.3 Anfertigung der Gefrierschnitte ... 70

5.6.4 Fixierung der Gewebeschnitte... 70

5.6.5 Vorbereitung der Sonde ... 71

5.6.6 Prähybridisierung und Hybridisierung ... 71

5.6.7 Posthybridisierungswaschungen... 72

5.6.8 Autoradiographie... 73

5.6.9 Histologische Färbung und Einbettung ... 73

5.6.10 Mikroskopische Auswertung... 73

5.6.11 Kontrollen... 74

5.6.12 Quantitative In-situ-Hybridisierung ... 75

5.7 IMMUNHISTOCHEMIE...76

5.7.1 Präparation der Objektträger ... 76

5.7.2 Vorbereitung der Tiere und des Gewebes ... 76

5.7.3 Peptid-Detektion ... 78

5.8 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR)...79

5.8.1 Reverse Transkription ... 79

5.8.2 PCR ... 80

5.8.3 Kontrolle der Spezifität der PCR-Produkte ... 84

5.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG...85

6 ERGEBNISSE ...86

6.1 RESTRIKTION DER DNA-FRAGMENTE...86

6.2 SPEZIFITÄT DER SONDEN...88

6.2.1 Southern Blot ... 88

6.2.2 Northern Blot... 89

6.2.3 In-Situ-Hybridisierung ... 91

6.2.4 Immunhistochemie... 93

6.3 ONTOGENESE DER NONAPEPTID-GENEXPRESSION IM HYPOTHALAMUS...94

6.3.1 Morphologie ... 94

6.3.2 Quantitative Analyse... 102

6.4 VERGLEICH ZWISCHEN AVT UND MT MRNA GEHALT IM HYPOTHALAMUS...109

6.5 MT-GENEXPRESSION IN PERIPHEREN GEWEBEN...111

6.6 MT-REZEPTOR-GENEXPRESSION IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN...113

7.1 KONTROLLEN DER SONDENSPEZIFITÄT...124

7.2 VERTEILUNG MT-GENEXPRIMIERENDER NEURONE IM HYPOTHALAMUS...128

7.3 EXTRASOMATISCHE GENEXPRESSION DER NONAPEPTIDE...130

7.4 ONTOGENESE DES NONAPEPTID-SYSTEMS...132

7.5 VERGLEICH DER AVT MRNA- UND MT MRNA-SYNTHESE IM HYPOTHALAMUS...137

7.6 GENEXPRESSION VON NONAPEPTIDEN IN PERIPHEREN GEWEBEN...139

7.7 PHYSIOLOGISCHE EINFLÜSSE AUF DIE LÄNGE DES POLY(A)-SCHWANZES...141

7.8 EINFLUß EINER OSMOTISCHEN STIMULATION AUF DIE MT-GENEXPRESSION IM HYPOTHALAMUS...142

8 ZUSAMMENFASSUNG ...145

9 SUMMARY ...147

10 LITERATURVERZEICHNIS ...149

11 ANHANG...176

11.1 CHEMIKALIEN-NACHWEIS...176

11.2 ENZYME UND LÄNGENSTANDARDS...179

11.3 KITS...180

11.4 RADIONUKLIDE...180

11.5 PRIMER...181

11.6 PUFFER...181

11.7 NÄHRBÖDEN UND NÄHRMEDIEN...189

11.8 PLASMAWERTE DER TIERE...190

12 PUBLIKATIONSLISTE ...193

Abkürzungsverzeichnis AS Aminosäure

AVP Arginin –Vasopressin

AVT Arginin –Vasotocin

bp Basenpaare cDNA komplementäre DNA

cpm counts per minute

D Lebenstag

dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat DNA desoxyribonucleic acid = Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidtriphosphat ds doppelsträngig

dTTP Desoxytymidintriphosphat

E Inkubationstag (embryonal)

HPLC High performance liquid chromatography = Hochleistungs–

Flüssigchromatografie icv intracerebroventriculär

IHC Immunhistochemie IR Immunoreaktivität

ISH In situ-Hybridisierung IT Isotocin iv intravenös

Kb Kilobasen ( = 1000 Basen)

KO knock out (= Deletion eines Genes) LB Lohmann Brown (Huhn, Legerasse)

LSL Lohmann Selected Leghorn (Huhn, Legerasse) LVP Lysin-Vasopressin

LS Längenstandard

M Molar mosmol Milliosmol

mRNA messenger ribonucleic acid = Boten-Ribonukleinsäure MSEL Neurophysin der vasopressinergen Linie (Aminosäure-Code) MT Mesotocin

nm Nanometer

OD optische Dichte

OP Operation OT Oxytocin P Phosphor RIA Radioimmunoassay RNA ribonucleic acid = Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

U unit = aktive Einheit

UV ultraviolett

v/v Volumen pro Volumen

v/w Volumen pro Gewicht (weight)

VLDV Neurophysin der oxytocinergen Linie (Aminosäure-Code) Vol. Volumen

Anatomische Abkürzungen

BnST Bed nucleus der Stria Terminalis

CO Chiasma opticum

HNS Hypothalamo-neurohypophysäres System ME Median eminence = Eminentia mediana

PVN Nucleus paraventricularis

SCN Nucleus suprachiasmaticus

SOe Nucleus supraopticus, pars externus

SON Nucleus supraopticus

SOv Nucleus supraopticus, pars ventralis

TSM Tractus septomesencephalicus

V III Ventriculus tertius = Dritter Hirnventrikel VL Ventriculus lateralis = Lateraler Hirnventrikel

ZNS Zentrales Nervensystem

1 Einleitung

Mesotocin (MT) und Arginin-Vasotocin (AVT) sind die beiden neurohypophysären Hormone des Vogels. Sie entsprechen in ihrer Struktur Arginin-Vasopressin (AVP) und Oxytocin (OT) beim Säugetier. Sie werden hauptsächlich in magnozellulären Neuronen des Hypothalamus gebildet, axonal in die Terminale in der Neurohypophyse transportiert und von dort in das Blut abgegeben. Die Synthese erfolgt als Prohormon mit zwei (MT) bzw. drei (AVT) beteiligten Peptiden bzw. Proteinen: MT / AVT, Neurophysin und einem Glycopeptid (nur AVT). Der Hypophysenhinterlappen enthält die Terminale der magnozellulären hypophysären Neurone und bildet zusammen mit dem Hypothalamus das „hypothalamo-neurohypophysäre System“ (HNS).

Die physiologischen Wirkungen von AVT und MT betreffen sowohl die Reproduktion wie auch die Homöostase des Wasserhaushaltes. AVT hat, wie AVP bei Säugetieren, eine antidiuretische Wirkung an der Niere. Dementsprechend ist die Hormonkonzentration im Blut bei Wassermangel erhöht. Oxytocin ist beim Säugetier ein Hormon mit stark uterotonischer Wirkung und bewirkt den Milchejektionsreflex durch Kontraktion der Myoepithelien im Gesäuge, wenn durch das Jungtier ein mechanischer Reiz ausgeübt wird. Beim Huhn ist die Eiablage von den neurohypophysären Hormonen beeinflußt, jedoch konnte hier bisher im Blutplasma nur ein Anstieg des AVT-Gehaltes unmittelbar vor der Oviposition festgestellt werden. Hingegen ist für MT bisher keine direkte physiologische Funktion beschrieben worden, die spezifisch für dieses Hormon ist. Auch sonst fehlen verläßliche Daten über eine von AVT unabhängige Regulation von MT.

Außer dem magnozellulären hypothalamischen System mit den Projektionen in die Neurohypophyse gibt es Zellgruppen mit Zellen geringerer Größe, welche als parvozellulär bezeichnet werden. Auch einige dieser Zellgruppen im Hypothalamus sind in der Lage, AVT und MT zu bilden. Die hier gebildeten Peptide werden nicht über die Neurohypophyse sezerniert, sondern im ZNS ausgeschüttet, entweder direkt am Syntheseort oder an den synaptischen Endungen in anderen Projektionsgebieten. Im AVT-System konnte ein Sexdimophismus in der Genexpression und -translation in parvozellulären Neuronen

Einleitung 12

festgestellt werden. Dieser Unterschied scheint durch Geschlechtshormone bedingt zu sein, jedoch ist die embryonale Entwicklung dieses Unterschiedes bisher nicht genau beschrieben.

Neben der hypothalamischen Lokalisation der AVT-bildenden Zellen gibt es auch Nachweise extrahypothalamischer Genexpression, sowohl im zentralen Nervensystem als auch in peripheren Körpergeweben wie dem Ovar. Die Hormone haben nicht nur eine klassisch endokrine Wirkung, sondern auch eine parakrine oder autokrine Funktion. Im ZNS haben sie auch typisch neuropeptiderge Wirkungen mit Einfluß z. B. auf Lernfunktionen.

Ziel dieser Arbeit ist es, grundlegende Daten über die Genexpression von MT zu ermitteln.

Dazu muß zunächst abgesichert werden, daß die neu entwickelte Gensonde für MT mRNA spezifisch is, ohne daß Kreuzhybridisierungen mit AVT mRNA auftreten. Über eine ontogenetische Untersuchung und einen Vergleich mit dem AVT-System sowie über Dehydrierunsversuche soll versucht werden, Rückschlüsse auf eine physiologische Funktion zu ziehen. Eine mögliche Genexpression von MT außerhalb des ZNS sowie die Lokalisation von MT-Rezeptor mRNA soll ebenfalls Aufschluß über eine möglich Funktion geben.

2 Literaturübersicht

2.1 Evolution des Arginin-Vasotocin- und Mesotocin-Systems

In der Evolution entwickelten sich AVT und MT aus dem Hormon Vasotocin, welches bei Cyclostomen nachgewiesen wurde (ACHER 1996). Dieses besteht aus der Peptiddomäne des Vasotocin, einem Neurophysin und einem Glykopeptid (Abb. 2-1). Dieses Prohormon wird anschließend während des axonalen Transports in die einzelnen Bestandteile gespalten.

3 ^' 5‘

M e s o to cin A A A A A A

Ex on 1 Exo n 2 Ex o n 3

3 ^' 5‘

Va so to cin A A A A A A

Ex o n 1 Ex o n 2 Ex o n 3

Vasotocin

Mesotocin

Signalpeptid Nonapeptid

Neurophysin Glycopeptid

Gly-Lys-Arg

Abb. 2-1: Übersicht über die Gen- und Peptidstruktur von AVT und MT

Durch Genduplikation mit anschließender Punktmutation ist bei Knochenfischen ein zweites Hormon entstanden: Isotocin (IT). Außerdem unterscheiden sich die Neurophysine beider Hormone. Das an IT gekoppelte Neurophysin wird nach der Abfolge der Aminosäuren 2, 3, 6 und 7 als VLDV bezeichnet, das an AVT gekoppelte als MSEL. Beim Übergang zu Amphibien, Reptilien und Vögeln trat im IT eine Aminosäure-Mutation an Position 8 auf, wo jetzt Isoleucin statt Arginin stand, gleichzeitig ging das Glykopeptid am 3'-Ende des Prohormones verloren. Das neue Peptid wird als Mesotocin (MT) bezeichnet. Beim Übergang zu den Säugetieren schließlich erfolgte sowohl in der AVT- wie auch der MT-Hormonfamilie

Literaturübersicht 14

eine Punktmutation (ACHER 1993). Aus AVT entstand Arginin-Vasopressin (AVP) und aus MT Oxytocin (OT; Leucin an Position 8). Beim Schwein findet sich anstatt AVP Lysin- Vasopressin (LVP) mit Lysin statt Arginin an der Position 8. Abb. 2-2 zeigt die Theorie der Genduplikation in der Evolution.

Die Beuteltiere Australiens und Amerikas nehmen eine Sonderstellung ein. Während in australischen Beuteltieren (Dasyuridae, Macropodidae, Phalangeridae) als oxytocinerges Hormon in der Regel nur MT gefunden wurde, kann man in amerikanischen Beuteltieren (Didelphidae) MT und OT (Nord-Amerikanisches Opossum) oder nur OT finden (Süd- Amerikanisches Opossum) (ROUILLÉ et al. 1985). Bei Peramelidae (Beuteldachse:

Kurznasenbeuteldachs, Northern Brown bandicoot, Isoodon macrourus) ist eine doppelte Genverdopplung beschrieben, d.h. es wurden sowohl die vasoaktiven Peptide AVP und LVP mittels HPLC identifiziert, als auch die uterotonisch wirksamen MT und OT gefunden (ROUILLÉ et al. 1988). In diesen Tieren hat anscheinend jeweils eine erneute Genverdopplung in der vasopressinergen und der oxytocinergen Linie stattgefunden, so daß vier verschiedene Hormone vorhanden sind. Dasselbe Phänomen wurde auch beim nordamerikanischen Opossum (Didelphis virginiana) beobachtet. Eine Sonderstellung hinsichtlich des genauen Ablaufs der Evolution nimmt eine sehr primitive Art der Prototherier (Kloakentiere) ein: bei ihnen konnte bereits OT identifiziert werden. Wie also läßt sich das Auftreten von MT bei entwicklungsgeschichtlich später entstandenen Tieren erklären? Eine Möglichkeit ist eine Mutation von Isoleucin zu Leucin vor der Abspaltung der Theria (Beutel- und Placentatiere; CHAUVET et al. 1984), eine reverse Mutation in den Beutlern oder eine Abspaltung der Beuteltiere vor den Theria in der Evolution (CHAUVET et al. 1981).

Diskutiert wird auch das Vorliegen eines doppelten Gensatzes, wovon dann MT exprimiert wird, während das OT-Gen nicht transkribiert wird. Das Auftreten einer Reihe von Punktmutationen, die noch dazu in verschiedenen Klassen des Tierreichs jeweils stabil sind, dürfte wohl einzigartig sein.

MT könnte eine Funktion bei der Milchejektion von Beuteltieren haben (SEBASTIAN et al.

1998), jedenfalls existieren in der Milchdrüse laktierender Wallabys MT-Rezeptoren, welche gleichermaßen empfindlich sind für MT und OT. Die Mutation von MT zu OT kann also eine neutrale Mutation gewesen sein. Eine Beteiligung an der Reproduktion erscheint nicht ausge-

Agnatha (Kieferlose) Lungenfische, Amphibien, Reptilien, Vögel Säugetiere Osteichthyes (Knochenfische)

Vasotocin VTNeurophysinX C – Y – I – Q – N – C – P – R - G Vasotocin Vasopressin (AVP bzw. LVP)

Vasotocin VTNeurophysinGP VTNeurophysinGP VPNeurophysinGP

C – Y – I – Q – N – C – P – R - G C – Y – I – Q – N – C – P – R - G C – Y – F – Q – N – C – P – R - G

Mesotocin Oxytocin

Isotocin ITNeurophysinGP MTNeurophysin OTNeurophysin

C – Y – I – S – N – C – P – I - G C – Y – I – Q – N – C – P – I - G C – Y – I – Q – N – C – P – L - G Abb. 2-2:Übersicht über die Evolution und den strukturellen Aufbau der neurohypophysären Nonapeptid-Hormone in Vertebraten (modifiziert nach BENTLEY 1998). VT = Vasotocin, IT = Isotocin, MT = Mesotocin, VP = Vasopressin, OT = Oxytocin, GP = Glykopeptid, X = Glykopeptid-Vorläufer

Literaturübersicht 16

schlossen, da MT nicht nur im Gehirn von Beuteltieren nachzuweisen ist, sondern auch in den Reproduktionsorganen wie dem Hoden (BATHGATE et al. 1993) oder in der Prostata (GEMMELL u. SERNIA 1989). Beim Lungenfisch (Neoceratodus forsteri), einer Zwischenstufe zwischen Fischen und Amphibien kann bereits MT in der Neurohypophyse nachgewiesen werden (MICHEL et al. 1993). Bei der primitiven Blindwühle (Typhlonectes compressicauda) ist sogar ein MT-Überschuß im Vergleich zu AVT feststellbar (GONZALEZ u. SMEETS 1997). In Gehirnbereichen, in denen bei anderen Amphibien AVT lokalisiert ist, stellt sich hier immunhistochemisch MT dar. Die Autoren schlagen vor, daß sich die Gene gegenseitig in einem Neuron hemmen, und daß, abhängig von äußeren und inneren Einflüssen, ein Umschalten in der Genexpression zwischen beiden Genen möglich sein könnte.

Die Mutationen in der Gensequenz der Neurophysine, den mit den Nonapeptiden im Prohormon assoziierten Proteinen, zwischen verschiedenen Vögeln und Säugetieren sind identisch (LEVY et al. 1987), d.h. sowohl beim Huhn als auch bei der Gans sind zwischen den beiden Neurophysinen jeweils die Aminosäuren 17, 35 und 41 im Vergleich zum Säugetier-Neurophysin ausgetauscht. An Position 17 steht Asparagin bei beiden Vögeln sowohl beim VLDV- als auch beim MSEL-Neurophysin im Gegensatz zu Glycin beim Säuger. An Position 35 haben die Vögel Tyrosin statt Phenylalanin und an Position 41 Threonin statt Alanin. An Position 18 und 36 stehen bei der Gans Arginin und Leucin statt Lysin und Valin. Beim Huhn hingegen verhält sich das MSEL-Neurophysin wie bei der Gans, das VLDV-Neurophysin wie beim Rind. Es handelt sich bei den Abweichungen also um eine evolutionäre Linie, nicht um eine speziesspezifische oder artspezifische Mutation.

Auch beim Strauß bestehen z. T. große Unterschiede in der Gensequenz im Neurophysin- Bereich im Vergleich zum Säuger (LAZURE et al. 1987). Bei der Gans, wahrscheinlich sogar bei allen Vögeln, scheint das MSEL-Neurophysin nur einmal gespalten zu werden, im Vergleich zum Säuger, wo es zweimal gespalten wird (ROUILLÉ et al. 1989). Das Copeptin bleibt also am Neurophysin gebunden. Die gleiche Form der Prozessierung findet man auch beim Frosch (MICHEL et al. 1990).

2.2 Morphologie des Arginin-Vasotocin- und Mesotocin-Systems

Mehrfach wurde mittels Immunhistochemie (IHC) oder In-Situ-Hybridisierung (ISH) nachgewiesen, daß AVT und MT fast ausschließlich in verschiedenen Neuronen des Hypothalamus exprimiert werden (DIERICKX u. VANDESANDE 1976; VAN VOSSEL et al. 1976; BONS 1980; TAKEDA et al. 1990; ANDRADES et al. 1994). Dieses Prinzip scheint sich auf alle Tiere zu beziehen. Ebenso allen Tieren gemein ist das Vorkommen von MT-Peptid und AVT mRNA und Peptid in Nucleus paraventricularis (PVN) und Nucleus supraopticus (SON), den beiden großen Kerngebieten des Hypothalamus. Über das Vorkommen von MT mRNA kann bisher aufgrund fehlender Sonden keine Angabe gemacht werden. Unterschiede bestehen aber in weiteren Kerngebieten, wobei man die Möglichkeit unterschiedlicher Benennung eventuell physiologisch identischer Areale durch eine fehlende Übereinstimmung in der Nomenklatur zwischen den Gehirnatlanten verschiedener Tiere berücksichtigen muß. Bei Wachtel (Coturnix japonica) und Ente (Anas platyrhinchos) werden immuncytochemisch auch MT-Neuronen in der preoptischen Region nachgewiesen (BONS 1980). MT-Fasern sind auch in der Eminentia mediana (ME) nachweisbar, wo sie von der inneren Zone zur Neurohypophyse verlaufen und von der rostralen äußeren Zone zur Adenohypophyse. MT-Fasern ziehen beim Huhn auch zum Stammhirn (BLÄHSER 1982), so daß eine Rolle als Neuroregulator möglich ist. Bei verschiedenen Amphibien wird MT in der Pars intermedia der Hypophyse gefunden (DIERICKX u. VANDESANDE 1976). MT-Peptid ist auch in einigen extrahypothalamischen Gebieten nachweisbar, so z. B. in der Hypophyse von Fröschen (GONZALEZ u. SMEETS 1992), wo AVT-Fasern völlig fehlen, und bei der Blindwühle im Tegmentum des Zwischenhirns (GONZALEZ u. SMEETS 1997). MT ist mittels Radioimmunoassay (RIA) auch im Kleinhirn von Hähnen detektierbar (ROBINZON et al. 1988b). Daneben zeigen sich auch Archistriatum, Paleostriatum, Mittelhirn, Pons und optische Lappen als MT-haltig. Bei der Echse kann immuncytochemisch keinerlei MT außerhalb des Hypothalamus nachgewiesen werden (THEPEN et al. 1987), wobei diese Unterschiede auch durch die verschiedenen Detektionsmethoden bedingt sein können. Der RIA ist in seiner Empfindlichkeit sehr stark von der Spezifität des eingesetzten Antikörpers abhängig. Er kann sehr geringe Peptidmengen nachweisen (z. B. Picogramm-Bereich für

Literaturübersicht 18

AVT) und ist bei einem guten Antikörper auch sehr spezifisch, jedoch erlaubt er keine Aussage über eine Lokalisation des Peptids im Gewebe und ist anfällig gegenüber Kontaminationen. Daher ist eine genaue Gewebeentnahme sehr wichtig, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Kontaminierendes Blut kann zu einer positiven Peptiddetektion führen. AVT kann bei Amphibien (Molch) und Reptilien (Schildkröte) außer in SON und PVN vor allem in der Amygdala und im lateralen Septum nachgewiesen werden. Diese Expression ist sowohl bei der Schildkröte (Pseudemys scripta elegans: SMEETS et al. 1990) als auch beim Molch (Taricha granulosa: LOWRY et al. 1997) geschlechtsspezifisch.

Bei Hühnern wird AVT extrahypothalamisch im Diencephalon exprimiert. In Übereinstimmung mit dem Expressionsmuster bei Ratten wurde diese Struktur als Bed Nucleus der Stria terminalis (BnST) identifiziert (BARTH 1996; JURKEVICH et al. 1997).

Die Genexpression ist sexdimorph: Während bei Hähnen in dem parvozellulären Teil des Kerngebietes eine deutliche Genexpression zu erkennen ist, fehlt diese bei Hennen völlig.

Auch bei Wachteln ist dieser Sexdimorphismus vorhanden (ASTE et al. 1998).

Im Gegensatz zu AVT konnte bei MT bisher keine geschlechtsspezifische Expression von MT nachgewiesen werden (Amphibien: THEPEN et al. 1987; GONZALEZ u. SMEETS 1997;

Huhn: ROBINZON et al. 1990b; BARTH et al. 1997).

Auch außerhalb des ZNS wird MT exprimiert: im Reproduktionssystem (s.u.) und im Gastrointestinaltrakt. So konnte MT in Follikeln, Nebenniere, Oesophagus, Magen, Darm und Kloake von Hühnern (ROBINZON et al. 1988c) mit RIA identifiziert werden. Der geringe Gehalt in diesen Organen läßt aber eher auf eine parakrine Rolle schließen. Auch mittels RIA gelang der MT-Nachweis im Verdauungstrakt (KOIKE et al. 1987). Nicht zu unterscheiden ist dabei, ob es sich um eine lokale Peptidproduktion handelt, oder ob zirkulierendes Peptid an lokale Rezeptoren gebunden ist und so nachgewiesen wird.

Teilweise konnten Co-Lokalisationen von AVT und MT mit anderen Hormonen nachgewiesen werden, so z.B. bei der Schlange (Natrix maura) AVT mit Corticotropin releasing factor (CRF) (MANCERA et al. 1991) bzw. beim Frosch (Rana catesbeiana;

STOECKEL et al. 1987; SHIODA et al. 1989) mit Thyrotropin releasing hormone (TRH). Es konnte jedoch kein Einfluß festgestellt werden auf die Expression oder Sekretion der co-

lokalisierten Hormone. Auch auf die Hormone, welche von den co-lokalisierten Hormonen reguliert werden, konnte kein Effekt von AVT oder MT gemessen werden.

Ein Überblick über die Verteilung von AVT und MT in verschiedenen Bereichen des ZNS von Amphibien, Reptilien und Vögeln gibt Tabelle 1.

Lokalisation Tierart Peptid Methode Autor

Hypophyse Frosch Frosch

Frosch Kröte Blindwühle

Huhn Huhn

AVT, MT AVT, MT

MT MT AVT, MT AVT, MT AVT, MT

IHC PAP, EM

IHC IHC IHC RIA RIA

TAKEDA et al. 1990 VAN VOSSEL et al. 1976

SHIODA et al. 1989, STOECKEL et al. 1987

DIERICKX u.

VANDESANDE 1976 GONZALEZ u. SMEETS

1997

ROBINZON et al. 1990b ROBINZON et al. 1988b

Cerebellum Huhn MT RIA ROBINZON et al. 1988b

limbisches System (Septum, Amygdala,

Nc. accumbens)

Huhn Wachtel

Frosch Molch Schildkröte,

Schlange

AVT, MT AVT

AVT, MT AVT AVT

RIA IHC

IHC ISH, IHC

IHC

ROBINZON et al. 1988b VIGLIETTI-PANZICA et

al. 1992

GONZALEZ u. SMEETS 1992

LOWRY et al. 1997 SMEETS et al. 1990 Hypothalamus Huhn

Huhn Huhn Wachtel, Stockente Wachtel, Huhn

Stockente

AVT, MT MT AVT AVT, MT

AVT AVT, MT

RIA ISH ISH IF IHC IHC

ROBINZON et al. 1988b BARTH et al. 1997

BARTH 1996 BONS 1980 VIGLIETTI-PANZICA

1986

GOOSSENS et al. 1977

Literaturübersicht 20

Schlange Eidechse Frosch Blindwühle

Molch Schlange Schildkröte,

Schlange

AVT, MT AVT, MT AVT, MT AVT, MT

AVT AVT, MT

AVT

IHC IHC IHC IHC IHC, ISH

IHC IHC

ANDRADES et al. 1994 THEPEN et al. 1987 GONZALEZ u. SMEETS

1992

GONZALEZ u. SMEETS 1997

LOWRY et al. 1997 MANCERA et al. 1991

SMEETS et al. 1990 BnST, Diencephalon Molch

Huhn Huhn Wachtel Wachtel Wachtel, Huhn,

Stockente Eidechse Schildkröte,

Schlange

AVT AVT AVT AVT AVT AVT AVT, MT

AVT

IHC, ISH IHC, ISH

ISH IHC IHC IHC IHC IHC

LOWRY et al. 1997 JURKEVICH et al. 1997

BARTH 1996 ASTE et al. 1998 PANZICA et al. 1996 VIGLIETTI-PANZICA

1986

THEPEN et al. 1987 SMEETS et al. 1990 Tegmentum Frosch

Blindwühle Schildkröte,

Schlange

AVT, MT AVT, MT

AVT

IHC IHC IHC

GONZALEZ u. SMEETS 1992

GONZALEZ u. SMEETS 1997

SMEETS et al. 1990 Eminentia

mediana

Schildkröte, Schlange Wachtel, Stockente diverse Vögel

AVT AVT, MT

AVT

IHC IF IHC

SMEETS et al. 1990 BONS 1980 BLÄHSER 1984 Rhombencephalon Eidechse AVT, MT IHC THEPEN et al. 1987

Epiphyse Huhn AVT, MT RIA ROBINZON et al. 1990b Tabelle 1: Übersicht über die Verteilung von AVT und MT im ZNS bei verschiedenen Reptilien, Amphibien und Vögeln.

2.3 Ontogenese des hypothalamo-neurohypophysären Systems

Die Entwicklung des hypothalamo-neurohypophysären Systems bei Säugern und anderen Vertebraten kann Rückschlüsse darüber geben, welche Funktionen ein Gen in der Entwicklung des Gehirns übernimmt und ab wann der Fetus eigenständig in der Lage ist, physiologische Funktionen zu regulieren. Daher wurde die Entwicklung des HNS bei einigen Tierarten untersucht. Dabei sind die Ergebnisse durchaus sehr unterschiedlich.

Die Expression des AVT- und MT-Gens beginnt beim Huhn bereits sehr früh in der embryonalen Entwicklung. Mittels eines Antikörpers, der AVT und MT gemeinsam detektiert, können erste Signale bereits am Tag 7,25 der Bebrütung bei Embryonen dargestellt werden (ARNOLD - ALDEA u. STERRITT 1996). Zwei Gebiete sind dabei sichtbar. Der Ursprung für die spätere Gruppe im Diencephalon ist die hypothalamische Anlage am III.

Ventrikel. Von dort vollziehen die Neurone eine Migration nach rostral. Dabei scheinen Neuronen, unabhängig von ihrer späteren Größe (magno- oder parvocellulär) und ihrer genauen Lokalisation im Diencephalon, denselben Ursprung zu haben. Es gibt ausgehend von der Anlage zwei Migrationswege. Auf dem dorsalen Weg wandern Neuronen, die später im BnST, DLAmc und SON, pars externus lokalisiert sind. Ventral bewegen sich Neurone zum SON, pars ventralis und PVN. Der Nucleus Edinger-Westphal bildet die zweite Anlage im Mesencephalon am IV. Ventrikel mit Signalen von E7,25 bis E10. Das Kerngebiet war in älteren Entwicklungsstadien nicht mehr nachweisbar. Abb. 2-3 zeigt eine Skizze der Migration der Nonapeptid-Hormone im Diencephalon.

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Abb. 2-3: Theorie der Migration von vasopressinergen und oxytocinergen Neuronen im ZNS (nach ARNOLD - ALDEA u. STERRITT 1996). Dargestellt sind ein dorsaler (1) und ein ventraler (2) Weg. Aus dem dorsalen entstammen die Neurone des BnST (a), des DLAmc (b) und des SON, pars externus (c). Aus dem ventralen wandern die späteren Neurone im SON, pars ventralis (a) und PVN (b).

Ähnlich früh konnte beim Huhn nicht nur immuncytochemisch die Peptidproduktion nachgewiesen werden. Bereits an E6 treten in der ISH erste Signale für Genexpression von AVT am III. Ventrikel auf (MILEWSKI et al. 1989), von wo aus die Neuronen bis E12 in PVN und SON zu migrieren scheinen. Das Phänomen der Neuronenmigration ist bisher eine Theorie, die nicht schlüssig belegt ist. Man müßte einzelne Neuronen in Gehirnschnitten anfärben und diese Schnitte sehr lange in Kultur lebend erhalten und permanent aufzeichnen, um den sicheren Beweis zu haben, daß Neuronen tatsächlich während der Ontogenese wandern. Statt einer Migration kann es sich auch im eine wechselnde Genexpression in verschiedenen Zellen handeln. Im embryonalen Gehirn haben die Neurone aber noch keine

1

2 a

a b b

c

Ventrikel lateraler

Ventrikel

Chiasma opticum

langen Axone und Dendriten ausgebildet, so daß eine Ortsbewegung möglich wäre. Ob dann AVT und MT eine Leitfunktion für die Bewegungsrichtung haben, bleibt noch zu klären. Die Peptidsynthese beginnt noch vor der vermuteten Migration der Zellen (TENNYSON et al.

1985; 1986), da erste Signale für die Translation mittels ICC bereits an E7/8 detektierbar sind.

An E12 entspricht die Verteilung beim Huhn bereits der von erwachsenen Tieren, und auch die physiologische Wirkung als antidiuretisches Hormon entwickelt sich in der letzten Phase der embryonalen Entwicklung, so daß beim Küken am Schlupftag die Osmoregulation funktionsfähig ist (GROSSMANN et al. 1995).

Auch beim Krallenfrosch (Xenopus laevis) ist eine sehr frühe embryonale Peptidsynthese festzustellen (GONZALEZ et al. 1995), woraus eine Bedeutung von MT für die neuronale Entwicklung hervorgehen könnte. Die MT-Peptidsynthese entwickelt sich hier stellenweise schneller als AVT (Stammhirn), was aber bei adulten Tieren wieder umgekehrt ist. In allen anderen Gehirnbereichen, in denen beide Peptide vorkommen, hat die Entwicklung des AVT- Systems immer einen Vorsprung gegenüber der MT-Synthese. Die Neuronenzahl nimmt nur langsam zu. Es sind keine Entwicklungssprünge sichtbar.

Im Gegensatz zu den Vögeln und Amphibien scheint die Genexpression bei den Säugetieren später in der vorgeburtlichen Entwicklung einzusetzen und braucht auch länger, um eine Morphologie ähnlich einem erwachsenen Tier zu erreichen. Trotzdem hat Vasopressin in Ratten auch pränatal wichtige Funktionen zu erfüllen: In Brattleboro-Ratten wird durch eine Punktmutation im Neurophysinbereich des AVP der Leserahmen verschoben, wodurch es zu einem Verlust des Stopcodons kommt. Diese Mutanten haben eine gestörte Entwicklung des Gehirns, besonders im Bereich des Cerebellums. Diese Erscheinung läßt sich durch pränatale Vasopressin-Substitution verhindern (BOER 1985). In der Regel kann bei Säugetieren ein Zeitverzug der OT-Genexpression und –translation gegenüber AVP beobachtet werden (WHITNALL et al. 1985; FEHR et al. 1989; JING et al. 1998). Dieser Zeitversatz spielt sich hauptsächlich im letzten Drittel der Trächtigkeit ab. Ratten haben eine der Bebrütungszeit des Huhns vergleichbare Trächtigkeitsdauer von 21 – 23 Tagen. Trotzdem wird eine OT- Transkription oft erst im letzten Viertel der Trächtigkeit beschrieben (LAURENT et al. 1989;

JING et al. 1998). Allerdings ist auch bei der Ratte die Ausbildung der einzelnen Kerngebiete hinsichtlich der AVP- und OT-positiven Neurone bereits pränatal (E17) soweit

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fortgeschritten, daß die Verteilung adulten Tieren gleicht (WHITNALL et al. 1985). Hingegen ist die Bildung von AVP mRNA und OT mRNA nach quantitative Gesichtspunkten hauptsächlich ein postnatales Ereignis der ersten zwei Lebenswochen (ALMAZAN et al.

1989). Das entspricht auch dem Zeitpunkt der Etablierung synaptischer Verbindungen an den AVP- und OT-Neuronen. In extrahypothalamischen Gebieten (BnST und mediale Amygdala) ist AVP mRNA erst postnatal detektierbar (SZOT u. DORSA 1993). Dabei gibt es einen Sexdimorphismus, da bei männlichen Ratten die ersten Signale an D3-5 sichtbar sind, bei weiblichen Tieren jedoch erst an D14 (BnST) bzw. D35 (mediale Amygdala). Im Alter von 1 (BnST) bzw. 2 Monaten (Amygdala) entspricht die Stärke des Signals dem von erwachsenen Tieren. Auch die OT mRNA-Synthese ist steroidabhängig. In der Pubertät kommt es zu einer Zunahme der mRNA-Bildung, welche während der Laktation weiter gesteigert wird (MILLER et al. 1989c). Ovariektomie dagegen vermindert die OT mRNA-Konzentration in adulten weiblichen Ratten. Beim Schwein kann zwar mit Antikörpern schon eine Neurophysin-Synthese an E25 festgestellt werden (ELLENDORFF et al. 1990), jedoch sind LVP mRNA und OT mRNA erst an E40 sichtbar. Diese Diskrepanz kann einerseits in einer LVP-/OT-unabhängigen Synthese von Neurophysin liegen, oder die Stabilität der LVP und OT mRNA ist vermindert, so daß die in der Zelle vorhandenen mRNA-Konzentrationen nicht detektierbar sind. Im Gegensatz zum Huhn, wo zuerst der PVN und erst später der SON Signale für die Nonapeptide zeigen, entwickelt sich beim Schwein der SON früher als der PVN (MILEWSKI 1989).

2.4 Einflüsse von Steroidhormonen und Sexdimorphismus

Die Genexpression der vasopressinergen Hormonlinie zeigt eine geschlechtliche Differenzierung. Dabei haben die männlichen Tiere in der Regel Signale, welche bei weiblichen Tieren stark reduziert sind oder fehlen. Dieses Phänomen ist auf bestimmte Kerngebiete des Gehirns begrenzt. Daher werden in der Literatur über eine Lokalisation dieser Strukturen oft Homologien in den Gehirnatlanten verschiedener Tierarten und -stämme hergestellt. Zuerst beschrieben wurde dieses Phänomen in verschiedenen Säugetieren,

darunter Ratten (VAN LEEUWEN et al. 1985; MILLER et al. 1989a), Hamster (BUIJS et al.

1986; FERRIS et al. 1990) und Wühlmaus (BAMSHAD et al. 1993; WANG et al. 1994a). Bei männlichen Tieren kann eine Kastration die Genexpression bzw. die Dichte AVP- immunoreaktiver Zellen und Nervenfasern bzw. die Bildung von AVP mRNA verringern oder völlig unterdrücken (DE VRIES et al. 1984; MILLER et al. 1989b). Dabei folgt der Verlust der immunoreaktiven Peptide der Abnahme der Genexpression mit ca. 3 Wochen Verspätung (MILLER et al. 1992). Dieser Effekt konnte durch die Gabe von Testosteron-Implantaten wieder umgekehrt werden (VAN LEEUWEN et al. 1985; BROT et al. 1993). Bei einem Geschlechtsunterschied von Regulationsmechanismen sind daher offensichtlich Steroide direkt oder indirekt an der Ausbildung dieses Dimorphismus beteiligt. Auch natürliche Schwankungen des Testosteronspiegels führen zu Veränderungen in der Genexpression und Translation der Neuropeptide in diesen Gehirnarealen. So ist beim Europäischen Hamster eine Zunahme der AVP-Innervation im Frühjahr zur Brunstzeit sichtbar, welche parallel zur Veränderung des zirkulierenden Testosterons verläuft (BUIJS et al. 1986). Allerdings hängt das Expressionsmuster nicht allein von der Menge an zirkulierendem Steroid ab. So kann Testosteron nicht immer den ursprünglichen Zustand wiederherstellen, noch kann durch alleinige Testosterongabe bei weiblichen Tieren ein männliches Expressionsmuster erreicht werden (DE VRIES et al. 1986; 1994). Vielmehr scheint es bereits in der Entwicklung dieses Sexdimorphismus Phasen zu geben, in denen die spätere Reaktionsfähigkeit auf die zirkulierenden Hormonlevel festgelegt wird (WANG et al. 1993; JURKEVICH et al. 1999b).

Bei dem geschlechtsspezifisch regulierten Kerngebiet handelt es sich um den Bed Nucleus der Stria terminalis (BnST). Die Neuronen dieses Kerngebiets projezieren zum lateralen Septum (DE VRIES u. BUIJS 1983), was auch durch eine verminderte Faserdichte in diesem Bereich bei einer verringerten AVP-Produktion im BnST deutlich wird. Bei der Ratte ist im BnST eine Co-Lokalisation von AVP und Androgen-Rezeptor nachgewiesen (ZHOU et al. 1994), so daß ein direkter Einfluß von Testosteron auf die AVP-Synthese möglich ist.

Bei weiblichen Ratten hat die Ovariektomie einen negativen Einfluß auf die Gesamt-mRNA- Menge an OT im Hypothalamus im Northern Blot, jedoch läßt sich morphologisch kein Unterschied zwischen intakten und operierten Tieren feststellen, was Lokalisation und Anzahl der exprimierenden Neurone betrifft (MILLER et al. 1989c). Die Unterschiede in der

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Genexpression beruhen auf einer unterschiedlichen Stärke der Transkription im einzelnen Neuron. Dieser Befund ist vielleicht überraschend, da bisher im Säuger für OT eigentlich nur eine Rolle in der Reproduktion (Uteruskontraktion, Milchejektion) bei weiblichen Tieren bekannt ist. Eine Rolle von OT aus magnozellulären Neuronen bei männlichen Tieren ist bisher unbekannt. Daher wären morphologische Unterschiede in den ovariektomierten Tieren in der Lokalisation ähnlich dem BnST denkbar gewesen.

Später folgten dann Beobachtungen über einen Sexdimorphismus bei verschiedenen Vogelspezies wie beim Kanarienvogel (VOORHUIS et al. 1988), Wachtel (ASTE et al. 1998) und Huhn (JURKEVICH et al. 1997). Ein Sexdimorphismus ist auch bei der Schildkröte (Pseudomys scripta elegans) in den Bereichen des lateralen Septum, Amygdala, Habenula, Tegmentum und Substantia nigra (SMEETS et al. 1990) beschrieben. Auch bei der Wachtel ist der Sexdimorphismus abhängig vom zirkulierenden Testosteron-Siegel im Plasma (VIGLIETTI-PANZICA et al. 1992, 1994). Dieser Effekt wird ausgelöst durch Veränderungen der Tageslichtlänge und kann auch künstlich ausgelöst werden. Der Bezug zum BnST der Ratte kann auch bei der Eidechse (Lizzard gekko gecko) in den Arealen des lateralen Septum und im ventrocaudalen Telencephalon hergestellt werden, da entsprechend bei männlichen Tieren deutlich mehr AVT-Peptid detektierbar ist . Dagegen sind beim Vogel die AVT-produzierenden Neurone in den sexdimorphen Strukturen negativ für den Androgen- Rezeptor (JURKEVICH et al. 1999b). Daher muß beim Vogel die Steroidabhängigkeit anders reguliert sein als beim Säugetier: Eine mögliche Regulation erfolgt entweder über Interneuronen, welche, aktiviert über einen Androgen-Rezeptor mit Ligand, die AVT- Neuronen steuern, oder über eine Aromatisierung des Testosterons in Östrogen. Tatsächlich konnte bei der Wachtel Aromatase-Protein mit AVT-Peptid co-lokalisiert werden (ASTE et al. 1998) und die Applikation von Östrogen in einer bestimmten Phase der embryonalen Entwicklung (E8) konnte bei männlichen Tieren ein weibliches Expressionsmuster im erwachsenen Tier hervorrufen (GROSSMANN et al. 1999). Umgekehrt kann eine Applikation des Aromatase-Hemmers Fadrazol beim weiblichen Tier den Verlust der AVT-Synthese in der Pubertät verhindern (JURKEVICH et al. 2000b). Dabei ist die Zahl der AVT- produzierenden Zellen bei der Henne gegenüber dem Hahn vermindert. Diesen Umweg des Testosteron-Effekts über Aromatisierung liegt wahrscheinlich die anders regulierte

Geschlechtsdifferenzierung des Vogels gegenüber dem Säuger zugrunde. Während beim Säugetier der männliche Organismus geschlechtsbestimmend ist (fehlender Testosteron- Einfluß in der Embryonalentwicklung führt zur Feminisierung des Embryos; SCHNORR 1989), ist beim Vogel der weibliche Embryo aktiv: ein fehlender Östrogen-Einfluß führt zur Maskulinisierung des Tieres (MARAUD et al. 1972).

Beim Ochsenfrosch (Rana catesbeiana) bewirkt eine Gonadektomie eine Verminderung der AVT-Konzentration im Gehirn in den Bereichen der lateralen Amygdala, dem Nc. septalis und der Habenula, bei männlichen Tieren auch im Tectum opticum. Eine Hormonsubstitution mit Östrogen kann den AVT-Gehalt bei männlichen und weiblichen Tieren im Nc. septalis und der Habenula wieder herstellen. In der Amygdala bei weiblichen Tieren wird die Ausgangskonzentration wieder erreicht. Bei männlichen Tieren ist hier die Wiederherstellung nur teilweise (BOYD 1994). Das zeigt, daß die vollständige Regulation nicht nur vom Geschlecht, sondern auch von der Region der Genexpression abhängig ist.

Beobachtungen über einen morphologischen Sexdimorphismus im BnST fehlen bei MT gänzlich (THEPEN et al. 1987; ROBINZON et al. 1990b; BARTH et al. 1997; GONZALEZ u. SMEETS 1997). Jedoch kann ein Einfluß von Steroiden auf die Peptidmenge von MT in einzelnen Kerngebieten des Huhnes nachgewiesen werden (ROBINZON et al. 1992). So läßt sich bei Hähnen, die an E10 mit Antiöstrogenen (Tamoxifen) behandelt werden, mittels RIA ein Anstieg der MT-Menge im vorderen Hypothalamus im Alter von 26 Wochen feststellen, während die gleiche Behandlung bei weiblichen Tieren ohne Einfluß ist. Auch ohne die Behandlung haben männliche Tiere mehr hypothalamisches MT als Weibchen. In der Neurohypophyse hat die Behandlung mit Antiöstrogenen und Antiandrogenen (Flutamid), bei Männchen auch mit Aromatase-Hemmern (ATD) einen stimulierenden Effekt auf die MT- Menge. Ob der Anstieg des MT-Gehaltes jedoch auf einer vermehrten Produktion oder einem verminderten axonalen Transport beruht, bleibt offen. In der Zirbeldrüse sinkt der MT-Gehalt bei Weibchen nach der Behandlung mit Antiandrogenen (ROBINZON et al. 1992). Der MT- Gehalt kastrierter Männchen im Hypothalamus liegt zwischen dem von intakten Männchen und Weibchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

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Behandlung Hypothalamus Neurohypophyse Epiphyse

ohne Behandlung MT: ƒ ! ‚ MT: ƒ ! ‚ AVT: ‚ ! ƒ

Antiöstrogen ƒ $97 9

ƒ 07 9

MT 9 (ƒ 99 AVT 9

‚ $97 ;

Antiandrogen MT 9 ƒ 99

AVT 9

‚ 07 ;

‚ $97 ;

Aromatase-Hemmer ƒ 07 99

ƒ $97 9

Tabelle 2: Einfluß Steroid-modulierender Substanzen in der Embryonalphase auf den AVT- und MT-Gehalt in verschiedenen Gehirnarealen des Huhnes. Die Tiere wurden an E10 mit der jeweiligen Substanz durch in ovo-Injektion behandelt. Die Auswertung erfolgte im Alter von 26 Wochen nach dem Schlupf. Antiöstrogen = Tamoxifen, Antiandrogen = Flutamid, Aromatase-Hemmer = ATD (nach ROBINZON et al. 1992)

2.5 Neurohypophysäre Hormone und Verhalten

Der Sexdimorphismus auf morphologischer Ebene wirkt sich auf viele physiologische Regulationsmechanismen aus, so auch auf die Regulation des Verhaltens. Schon lange ist bekannt, daß OT beim Säugetier nicht nur für den Geburtsvorgang verantwortlich ist und die Milchejektion durch Kontraktion der Myoepithelien in der Mamma fördert, sondern auch das Pflegeverhalten beim Muttertier für das Neugeborene fördert (KENDRICK et al. 1987). Aber nicht nur OT, sondern auch AVP ist an der Regulation des Verhaltens bei weiblichen und männlichen Tieren beteiligt. Diese Wirkungen werden aber nicht, wie die peripheren Aufgaben, durch eine Abgabe in das Blut und eine endokrine Funktion ausgelöst, sondern beruhen auf einer lokalen, neuropeptidergen Wirkung. AVP und OT wirken somit nicht nur extraneuronal in peripheren Organen, sondern können auch als Neuromodulatoren direkt im ZNS das arttypische Verhalten steuern.

Bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Verhaltensmuster stehen zunächst die Steroidhormone im Vordergrund. Östrogen und Androgen in der Blutzirkulation können die Blut-Hirn-Schranke durch ihre ausgesprochenen Lipophilität leicht überwinden und im Gehirn ihre Wirkung entfalten. Dazu müssen Rezeptoren vorhanden sein. Steroidhormonrezeptoren sind intrazellulär lokalisiert und wirken direkt durch Bindung an sog. „Response-Elemente“

als Transkriptionsfaktoren auf der DNA stimulierend oder inhibierend auf die Genexpression.

So steuern sie die Transkription verschiedener Gene positiv oder negativ. Bei OT wurde bereits ein Östrogen- response element (ERE) nachgewiesen (RICHARD u. ZINGG 1990).

Diese beeinflußten Gene wiederum führen zur Bildung anderer Proteine (z. B. Ovalbumin, Vitellogenin, Prolaktin, OT). So können Schaltkreise des Verhaltens beeinflußt werden. Wie bereits dargestellt, wird die Testosteron-Wirkung auf vasopressinerge Zellen über Aromatase vermittelt. Abb. 2-4 zeigt einen schematischen Überblick über einige der möglichen Schaltkreise, mit denen Steroide auf das AVT-System einwirken können.

Testosteron löst bei männlichen Wachteln Kopulationsverhalten aus (VIGLIETTI-PANZICA et al. 1992). Bei kastrierten Hähnen sind weder AVT-positive Zellen oder Fasern im lateralen Septum und im BnST nachzuweisen, noch zeigen die Tiere Kopulationsverhalten. Bei Hennen läßt sich durch Testosterongabe mittels Implantat kein maskulines Verhalten auslösen, was darauf hindeutet, daß die Regulation dieses Verhaltens nicht auf einem reinen Einfluß zirkulierenden Testosterons im erwachsenen Tier basiert, sondern daß funktionelle oder morphologische Unterschiede im Gehirn vorhanden sein müssen.. Zwischen der Dichte der AVT-positiven Fasern im lateralen Septum und dem Auslösen des Kopulationsverhaltens besteht eine positive Korrelation. Testosteron kann aber beide Effekte (größere Faserdichte im ZNS und Kopulationsverhalten) auch unabhängig von einander auslösen. Schon 1972 wurde aber gezeigt, daß die ip Injektion von AVT und OT in Hähnen und männlichen Tauben eine kurzzeitige Steigerung des Paarungsverhaltens auslösen kann (KIHLSTRÖM u. DANNIGE 1972). Im Gegensatz dazu steht bei der Wachtel ein hemmender Effekt von AVT bei einer icv Injektion auf das Balz- und Kopulationsverhalten (CASTAGNA et al. 1998). Daneben wurde ein V1-Antagonist verabreicht, was zu einer Stimulation des Paarungsverhaltens führte, so daß ausgeschlossen werden kann, daß AVT eine stimulierende Wirkung über einen anderen Rezeptor ausübt. Testosteron hat aber bei der Wachtel ebenfalls morphologisch einen stimulierenden Effekt auf die AVT-Peptidsynthese im BnST und im medialen Nc. preopticus, und dieser Sexdimorphismus wird embryonal durch zirkulierendes Östrogen manifestiert

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NeurohypophyseBHS / Blut periphere Organe

AV T

Gehirn

Verhalten Abb. 2-4: Modell der Wirkung von Sexualsteroiden auf das AVT-System und die weitere Verarbeitung in der Peripherie und zentral. T = Testosteron, E = Östrogen, A = Aromatase, BHS = Blut-Hirn-Schranke.

(PANZICA et al. 1998, 1999). Die Autoren spekulieren, daß die verabreichten Dosen außerhalb des physiologischen Bereichs liegen. Einen solchen Interpretationsansatz verfolgt auch LANDGRAF (1995). Die beobachteten Effekte könnten aber auch nicht im BnST reguliert werden, sondern die Injektion beeinflußt andere Gehirnbereiche, welche einen inhibierenden Effekt auf den BnST haben, und eine direkte Injektion in den BnST könnte durchaus aktivierend wirken. Beim Bootsmannsfisch (Porichthys notatus) wird in ähnlicher Weise beobachtet, daß bei Typ I-Männchen, welche die Brut betreuen, AVT einen hemmenden Effekt auf die Dauer der Zellaktivierung im vorderen Hypothalamus hat. AVT- Neurone feuern phasisch, und diese Phasendauer wird durch die Injektion von AVT in Area preoptica und den Hypothalamus vermindert. Die aufgezeichneten Zellen sind für die Steuerung der Vokalisation zuständig. Bei weiblichen Tieren hingegen und bei Typ II- Männchen, welche sich nicht an der Brut beteiligen, bleibt eine AVT-Gabe in diese Gehirnregion ohne Veränderung auf die Aktionspotentiale (GOODSON u. BASS 2000). Ein weiteres männliches Verhalten, welches am Reproduktionsgeschehen beteiligt ist, ist der Gesang des Kanarienvogels. Bei dieser Vogelspezies wurde auch zuerst ein Sexdimorphismus bei Vögeln nachgewiesen. Dieser Unterschied tritt saisonal auf. Werden juvenile oder adulte Männchen täglich über 3 Tage mit einem AVT-Analog sc behandelt, kann 1 - 4 Wochen später eine Veränderung der Gesangsdauer innerhalb 30 min Meßzeit festgestellt werden: im Herbst ist die Dauer verlängert, im Winter hingegen verkürzt (VOORHUIS et al. 1991). Alle Tiere hatten Testosteron-Implantate, um auszuschließen, daß Unterschiede auf saisonal verschiedenen Steroid-Konzentrationen im Plasma beruhen. Daher bleibt zumindest bei Nichtsäugern die eigentliche Wirkung von AVT auf das männliche Reproduktionsverhalten noch zu klären.

Bei Säugetieren sind bereits mehrere Untersuchungen zur Verknüpfung der Neuropeptide mit dem Verhalten vorhanden. Ein Vorteil dabei ist, daß KO-Tiere gute Möglichkeiten für die Darstellungphysiologischer Verhaltensweisen darstellen.SohatdasFehlenvonOTinOT ^- / ^- - Mäusen einen hemmenden Effekt auf die soziale Erkennung (FERGUSON et al. 2000). Ein Nachteil von KO-Tieren ist, daß das zu untersuchende Gen und sein Produkt in dem Tier vollständig fehlen. Dadurch kann die normale Entwicklung des Tieres gestört sein, so daß der physiologische Zusammenhang zerstört ist. Oder das Tier ist nicht lebensfähig ab einem vom

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Gen abhängigen Entwicklungszeitpunkt. Deshalb wird versucht, die Entfernung des Genes auf einen bestimmten Ort und einen bestimmten Entwicklungszeitpunkt zu begrenzen. Dazu muß ein Genkonstrukt erzeugt werden, in welchem das zu untersuchende Gen von sog. „loxP“- Sequenzen flankiert ist. Dieses Konstrukt muß über embryonale Stammzellen in das Tier einkloniert werden. Dazu benötigt man einen zweiten transgenen Tierstamm, welcher Cre- Rekombinase unter der Steuerung eines Gewebe- und/oder altersspezifischen Promotors exprimieren kann. Bei der Kreuzung beider Stämme erhält man Tiere, welche sowohl loxP als auch Cre-Rekombinase besitzen. Bei Aktivierung des Cre-Rekombinase-Gens durch den Promotor wird die DNA anschließend an den beiden loxP-Stellen geschnitten und so das Gen aus dem Genom entfernt (CHAMBERS 1994). Diese Mutantenerzeugung ist jedoch sehr aufwendig und wenig effizient. Ein einfacherer Ansatz zum Ausschalten einzelner Gene ist die Verabreichung von antisense-Oligonukleotiden. Dies hat den Vorteil, daß während kritischer Phasen der Entwicklung das Peptid zur Verfügung steht, so daß die zelluläre Umgebung eher dem physiologischen Zustand entspricht. Außerdem kann der Ort der Wirkung durch Injektion genau bestimmt werden, ohne daß vorher Genkonstrukte erstellt werden müssen, die eine zeitliche und örtliche down Regulation des Gens auslösen. Die Antisense-Oligonukleotide binden die komplementäre mRNA und verhindern so die Translation (NEUMANN et al. 1995).

Bei einer direkten Gabe hypertoner Salzlösung in den SON kommt es zu einer Zunahme lokal sezernierten AVPs im SON und lateralen Septum und einer Korrelation mit sozialem Wiedererkennen (LANDGRAF 1995), welche durch einen Rezeptorantagonist blockiert werden konnte. Bei diesem Verhaltenstest werden Jungtiere wiederholt zu einem adulten Tier in den Käfig gesetzt und die Zeit, die das ältere Tier für die Untersuchung des jüngeren aufwendet, gemessen. Ist die Zeit bei den Wiederholungen verringert, deutet das auf einen Wiedererkennungseffekt hin. Verhaltensregulation scheint also nicht nur in den parvozellulären Neuronen des limbischen Systems gesteuert zu werden, sondern auch in den klassischen Syntheseorten, den magnozellulären Neuronen im SON. Blockiert man die Bildung des V1-Rezeptors im Septum durch Antisense-Oligonukleotide, so kann das geförderte Sozialverhalten und die verminderte Angstreaktion durch Gabe von AVT icv gehemmt werden. Damit wird klar, daß die AVP-Reaktion nicht über eine Kreuzreaktion mit

dem OT-Rezeptor oder über den V2-Rezeptor vermittelt wird, sondern auf einer Stimulation des V1-Rezeptors beruht.

Bei Wühlmäusen ist das reproduktionsbezogene Verhalten zwischen den einzelnen Arten unterschiedlich. Während bei den Präriewühlmäusen beide Eltern Aufgaben in der Betreuung der Neugeborenen übernehmen, nehmen männliche Wiesenwühlmäuse an dieser Aufgabe nicht teil. Bei einer Untersuchung des AVP-Systems mittels IHC fiel ein Sexdimorphismus bei beiden Arten auf im lateralen Septum und lateralen Nc. habenularis, welche beide eine Projektion vom BnST erhalten. Bei Präriewühlmäusen kommt es bei männlichen Tieren bei Einsatz der Pflegetätigkeiten an den Neugeborenen zu einer Reduktion der AVP- immunoreaktiven Fasern, so daß sie mehr den weiblichen Tieren ähneln (BAMSHAD et al.

1993). Bei diesen traten keine Veränderungen auf. Die mRNA-Gehalt im BnST jedoch war nach dem Zusammenführen von Männchen und Weibchen erhöht, so daß das Peptid scheinbar sehr schnell freigesetzt wird (WANG et al. 1994a). Bei den Wiesenwühlmäusen dagegen war die Faserdichte bei den Männchen im lateralen Septum nicht verändert, im Nc. habenularis sogar noch erhöht (BAMSHAD et al. 1993). Bei den Präriewühlmäusen erhöhte auch eine icv Injektion von AVP ins laterale Septum die Zeit, die männliche Tiere mit der Kontaktaufnahme zu Neugeborenen verbringen. Dieser Effekt konnte über die Injektion eines V1a-Rezeptorblockers verhindert werden, was nahe legt, daß dieser Rezeptor an der Regulation der Verhaltensweisen beteiligt ist (WANG et al. 1994b).

Neben der Wühlmaus dient auch der stark territoriale Goldhamster als ideales Versuchtier zur Untersuchung reproduktionsbezogener Verhaltensweisen. Zwar ist bei diesem Tier kein BnST mit parvozellulären Neuronen identifiziert, aber ein AVP-Sexdimorphismus besteht im Bereich des vorderen Hypothalamus, welcher in die Regulation des Markierungsverhaltens involviert ist, und im Nc. preopticus medialis (MPO), wo auch bei der Wachtel geschlechtsspezifische AVT-Genexpression vorhanden ist. Injiziert man AVP in den MPO, steigert das die Frequenz des Absetzens von Markierungen in männlichen und weiblichen Goldhamstern (FERRIS et al. 1984). Dieser Mechanismus ist über V1-Rezeptoren vermittelt (FERRIS et al. 1988).

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2.6 Einflüsse auf die Nonapeptid-Konzentration in Plasma und ZNS

Beim Säugetier gibt es eine Funktionsteilung zwischen den beiden Hormonen AVP und OT.

AVP ist ein antidiuretisches Hormon und ist beteiligt an der Regulation des Wasser- und Elektrolythaushaltes. Oxytocin löst Kontraktionen der Uterusmuskulatur aus und bedingt die Milchejektion und ist somit an der Geburt und Aufzucht beteiligt (ACHER et al. 1970). Beim Vogel hingegen hat AVT sowohl eine vasopressinerge wie oxytocinerge Wirkungskomponente, d. h. es ist an der Regulation der Nierentätigkeit beteiligt und hat zusätzlich Einfluß auf die Oviposition. Dagegen ist eine physiologische Funktion von Mesotocin beim Vogel bisher nicht beschrieben (Abb. 2-5).

Abb. 2-5: Klassische physiologische Funktionen der neurohypophysären Hormone.

Die meisten bisherigen Untersuchungen beziehen sich auf den Einfluß von Blutdruck, Blutvolumen oder Streß auf den AVT- und MT-Gehalt im Plasma. So löst eine Immobilisation und Katheterisierung von Beuteltieren einen Anstieg der MT-

?

Mesotocin Vasotocin

Oxytocin Vasopressin

Reproduktion Osmoregulation

Plasmakonzentration für 3 Tage aus (BATHGATE et al. 1990, 1995). Auch eine Anästhesie kann bei Hühnern den MT-Wert erhöhen (BOTTJE et al. 1990), der dann innerhalb von 6 Stunden post OP wieder den Normalwert erreicht. Bei Fröschen scheint Immobilisation keinen Einfluß auf MT im Plasma zu haben (NOUWEN u. KÜHN 1985).

Kälteeinfluß auf nicht adaptierte Echsen führte zu einer Anreicherung von MT und AVT in der inneren Zone der Eminentia mediana (BONS 1983). Im ventralen PVN sind zunehmend kleine Neurone zu finden. Wie bereits berichtet, konnte AVP bzw. AVT mit CRF in Neuronen des hypothalamo-hypophysären Systems co-lokalisiert werden (MANCERA et al. 1991;

BARTANUSZ et al. 1993). Daher wird jetzt gezielt nach einem Zusammenspiel der Streß- induzierten Hormone mit den Nonapeptiden geforscht. CRF war dabei überwiegend in parvozellulären Neuronen des PVN lokalisiert. Aber auch in magnozellulären Neuronen war AVT bzw. MT und CRF co-lokalisiert (MANCERA et al. 1991). Plasma-OT steigt nach einer Immobilisierung von Ratten oder nach Zwangsschwimmen stark an, während der AVP-Gehalt unverändert bleibt (LANG et al. 1983). Da CRF an der Vermittlung einer generellen „Streß- Antwort“ beteiligt ist, scheint hier ein Zusammenhang zu bestehen. Injiziert man CRF in den III. Ventrikel, kann ein Anstieg von Plasma-OT in dosisabhängiger Weise beobachtet werden (HIGUCHI et al. 1990). Da diese Reaktion jedoch nicht mit Dexamethason geblockt werden konnte, kann nicht freigesetztes Adrenocorticotrophin (ACTH) für diese Reaktion verantwortlich sein, sondern die Regulation muß auf hypophysärem Niveau ablaufen, also steuern CRF-Neurone im Hypothalamus die OT-Freisetzung. Umgekehrt übt OT ein negatives Feedback aus auf die Hypothalamo-Adenohypophysen-Nebennieren-Achse (NEUMANN et al. 2000).

Einfacher Immobilisationsstreß oder Zwangsschwimmen konnte keinen Plasmaanstieg von AVP auslösen. Trotzdem ist auch parvozelluläres AVP in den Kreislauf der Streß-Antwort eingebunden. Eine Kombination aus physischem und emotionalem Streß gleichzeitig erhöht selektiv die Menge an intracerebral freigesetztem AVP (ENGELMANN et al. 2000). Auch in diesem Regelkreis zeigt sich, daß ein fehlender Anstieg des Plasmaspiegels nicht gleichzusetzen ist mit Wirkungslosigkeit. Vielmehr ist beim AVP-System zu beobachten, daß die Neuropeptid-Freisetzung von Dendriten bzw. Soma und Synapsen getrennt reguliert wird (WOTJAK et al. 1998). Auch Immobilisation als Streßauslöser kann im Gehirn eine lokale

Literaturübersicht 36

AVP-Freisetzung aus parvozellulären Neuronen bewirken (BARTANUSZ et al. 1993). Diese wird über ein negatives Feedback durch Glukokortikoide reguliert (HERMAN 1995).

Katecholamine hingegen scheinen keinen Einfluß auf die streßbedingte Freisetzung von AVT und MT zu haben (ROBINZON et al. 1991). Abb. 2-6 gibt einen Überblick über die Hypothalamus-Adenohypophysen-Nebennieren-Achse und die Beteiligung von AVP und OT.

Abb. 2-6: Einbindung von AVP und OT in die Streßregulation.

Die Untersuchungen zum Einfluß von Blutdruck und Blutvolumen auf die AVT- und MT- Konzentrationen im Plasma zeigen z. T. sehr unterschiedliche Ergebnisse. In der Tendenz deutet sich ein Abfall der MT-Plasmakonzentration bei Hyperosmolalität und ein Anstieg bei Hypoosmolalität des Plasmas an, jedoch schwanken die Ergebnisse je nach Tierart oder verwendeter Nachweismethode. Bei hyperosmolalem Plasma ist bei Beuteltieren mittels RIA ein Anstieg des Plasma-MT zu verzeichnen (BATHGATE u. SERNIA 1995). Den gleichen

Effekt kann man auch immunhistologisch bei Vögeln beobachten (BLÄHSER 1982).

Dagegen fällt MT im Plasma bei steigender Osmolalität beim Huhn im RIA (BOTTJE et al.

1990), bei sinkendem Ionendruck dagegen nimmt es zu. Die Reaktion von MT auf die Osmolalität kann dosis-abhängig sein (KOIKE et al. 1985). Bei Infusion von 0,1 M NaCl (schwach hyperton) über 30 min stieg der MT-Gehalt, bei Infusion von 1M NaCl fiel er.

SHIMADA et al. (1991) dagegen fanden bei Infusion von 0,1 M NaCl bei Legehühnern keinen Einfluß, aber einen Abfall bei 1 M NaCl. NOUWEN u. KÜHN (1982) schließlich zeigten einen MT-Abfall bei Infusion von 0,1 M (6 %) NaCl-Lösung beim Frosch. Tabelle 3 faßt diese Ergebnisse zusammen.

Tierart Behandlung Applika- tionsart

Nachweis- methode

AVP/AVT MT/OT Literatur Opossum 2,5M NaCl,

2h

iv RIA

9 ( 9

SERNIA 1995 Huhn Blutentzug

ca. 10%

intra- arteriell

RIA

( 9 ;

1990 Huhn 0,1M & 1 M

NaCl, 30 min

iv RIA

9 9

;

30 min

iv RIA = = SHIMADA et al.

1991

Frosch 0,1M NaCl ? HPLC

; ;

KÜHN 1982 Frosch 50%

Blutentzug

? HPLC

9; -

KÜHN 1982 Frosch 50-60%

Blutentzug

? RIA

9 9

KÜHN 1985 Huhn 1M NaCl,

30 min

iv RIA

9 ;

SHIMADA et al.

1991 Tabelle 3: Wirkungen verschiedener Infusion auf den Plasma-Gehalt von neurohypophysären Hormonen.