Es lag ein ca. 248 bp-großes cDNA-Fragment aus Hypothalamus mRNA vor. Bei Vergleich mit der Datenbank von MEDLINE ergeben sich folgende Homologien (Tabelle 7):
Tierart Rezeptor Expectation-Wert maximale Homologie von
Sequenzausschnitten
Rhesus-Affe OT 5x10-14 91 %
Kaninchen OT 5x10-14 89 %
Mensch OT 5x10-14 92 %
Weißbüscheläffchen OT 5x10-14 92 %
Aga-Kröte MT 3x10-12 84 %
Schwein OT 1x10-11 91 %
Rind OT 1x10-11 91 %
Schaf OT 3x10-9 89 %
Ratte OT 1x10-8 97 %
Maus OT 8x10-4 91 %
Tabelle 7: Homologien mit den 10 ähnlichsten Basenpaarsequenzen des MT-Rezeptor-Fragmentes gemäß BLAST search in MEDLINE.
Aufgrund dieser Homologien wurde angenommen, daß es sich um ein Genfragment des MT-Rezeptors handelt.
Ein Dot Blot soll erste Hinweise auf eventuell exprimierende Gewebe geben. Dabei zeigten Hypothalamus, Ovidukt und (schwach) die Leber ein sichtbares Signal (Abb. 6-21).
Ergebnisse 114
Abb. 6-21: Dot Blot mit dem Fragment des MT-Rezeptors. Eingesetzt wurden 20 µg Gesamt-RNA verschiedener Gewebe.
Im Northern Blot jedoch hybridisiert die Sonde mit einer mRNA von ca. 20000 bp Größe (Abb. 6-22). Vermutlich hybridisiert hier genomische DNA, während die mRNA mit einer erwarteten Größe von ca. 2,5 – 6 kb nicht in ausreichender Menge vorlag, um sie mit dem Northern Blot nachzuweisen.
Aus diesem Grund wurde eine PCR entwickelt, welche einen Teil dieses Fragments amplifizieren sollte. Da das Fragment nicht Intron-übergreifend ist, kann anhand der Fragmentgröße eine Amplifikation genomischer DNA auch nicht ausgeschlossen werden.
Daher wurde die Gesamt-RNA vorher mit DNase I behandelt, um möglichst reine RNA zu erhalten. Durch das Priming mit Oligo(dT) in der reversen Transkription sollte außerdem auch eine zusätzliche Selektion auf mRNA erfolgen. Als Negativkontrolle dient hypothalamisches und uterines Gewebe von Schwein.
Hypothalamus Leber
Niere Muskel Testis Ovar Ovidukt
Abb. 6-22: Northern Blot mit der MT-Rezeptor-Sonde. LS III = Längenstandard III DNA, Hypoth. = Hypothalamus, LS I = Längenstandard I RNA.
Ein amplifiziertes Fragment in der erwarteten Größe von 188 bp konnte im Agarose-Gel dargestellt werden, dabei waren folgende Gewebe positiv: Hypothalamus, Muskel, Niere weiblich, Ovar, Infundibulum, Uterus, Vagina (Abb. 6-23). Proben ohne mRNA und mit Schweine mRNA aus Hypothalamus bzw. Uterus waren negativ.
Abb. 6-23: PCR mit MT-Rezeptor-spezifischen Primern über 35 Zyklen. 1 = Hypothalamus, 2 = Muskel, 3 = Leber, 4 = Niere ♂, 5 = Niere ♀, 6 = Hoden, 7 = Ovar, 8 = Infundibulum, 9 = Magnum, 10 = Isthmus, 11 = Uterus, 12 = Vagina, 13 = Hypothalamus Schwein, 14 = Uterus Schwein, 15 = ohne RNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
LS III Hypoth. Leber Niere Muskel Testis Ovar Ovidukt LSIII LS I
Ergebnisse 116
6.7 Einfluß physiologischer Parameter auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes
Zur Untersuchung, ob unterschiedliche physiologische Parameter, die Länge des Poly(A)-Schwanzes beeinflussen, wurde Gesamt-RNA mit RNase H verdaut. Gleichzeitig wurde unverdaute RNA auf ein Gel aufgetragen, welches durch eine geringe Dichte (0,9 %) und eine große Strecke der Auftrennung (> 20 cm) zur Darstellung geringer Größenunterschiede im Bereich von 600 bis 700 bp geeignet ist.
Einfluß des Geschlechtes
MT
Das Geschlecht der Tiere hat keinen Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT.
Sowohl bei unverdauter wie auch bei verdauter RNA sind die Banden bei männlichen und weiblichen Tieren in der gleichen Höhe auf dem Gel lokalisiert (Abb. 6-24).
Abb. 6-24: Einfluß des Geschlechtes auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes. nativ = ohne RNase H-, RNase H = mit RNase H-Behandlung. LS = Längenstandard.
Die Profilanalyse ergibt für die männlichen Tiere eine Länge von 571 bp, für weibliche Tiere von 589 bp.
LS
S
R
R
S
LS RNase Hnativ
1230 bp 1033 bp
653 bp
AVT
Auch bei der AVT mRNA hat das Geschlecht keinen Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes (Abb. 6-25).
Abb. 6-25: Einfluß des Geschlechtes auf die Länge des poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. nativ = ohne RNase H-, RNase H = mit RNase H-Behandlung. LS = Längenstandard.
Die Profilanalyse ergibt eine Länge von 603 bp bei männlichen und 596 bp bei weiblichen Tieren.
LS
S
R
R
S
LS1230 bp
1033 bp
653 bp
nativ RNase H
Ergebnisse 118
Einfluß des Alters AVT
Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird vom Alter des Tieres beeinflußt. Bei den jüngeren Tieren ist die mRNA ca. um 30 - 40 bp kürzer als die von erwachsenen Tieren (Embryo männlich 588 bp, adulte Hähne 615 bp, Embryo weiblich 598 bp, adulte Hennen 639 bp).
Jedoch ist dieser Unterschied nach Verdau mit RNase H nicht mehr sichtbar (männliche Embryonen 539 bp, Hähne adult 546 bp bzw. weibliche Embryonen 566 bp, Hennen 573 bp).
Daher ist die unterschiedliche Länge im Poly(A)-Schwanz lokalisiert (Abb. 6-26).
Abb. 6-26: Einfluß des Alters auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. nativ = ohne RNase H-Behandlung, RNase H = mit RNase H-Behandlung, LS = Längenstandard.
RNase H native RNA native RNA RNase H 1230 bp
1033 bp
653 bp
LS E14 adult E14 adult LS E14 adult E14 adult
S R
Einfluß des Wasser- und Elektrolythaushaltes MT
Eine moderate Zunahme der Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT mRNA läßt sich unter Dehydrierung verzeichnen (Abb. 6-27).
Abb. 6-27: Einfluß von Dehydrierung auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von MT mRNA beim Hahn. NH
= normohydriert, DH = dehydriert, LS = Längenstandard
Die Zunahme der Länge des Poly(A)-Schwanzes ist aber gering (ca. 30 bp).
RNase H native RNA
LS NH DH NH DH LS
1230 bp 1033 bp
653 bp
Ergebnisse 120
AVT
Der Hydrierungszustand hat keinen sichtbaren Einfluß auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. Unter Normo- und Dehydratation beträgt der gemessene Unterschied in der Länge des Poly(A)-Schwanzes nur ca. 10 bp (Abb. 6-28).
Abb. 6-28: Einfluß einer Dehydrierung auf die Länge des Poly(A)-Schwanzes von AVT mRNA. 1,3=
normohydrierter Hahn, 2,4 = dehydrierter Hahn, 5, 7 = normohydrierte Henne, 6, 8 = dehydrierte Henne. LS = Längenstandard
NH D NH DH LS NH DH NH DH
R S
RNase H nativ nativ RNase H
1230 bp
1033 bp
653 bp
6.8 Einfluß einer Dehydratation auf die hypophysäre MT mRNA-Konzentration Um den Einfluß von osmotischem Stress auf die MT-Genexpression im Hypothalamus zu untersuchen, wurde je 4 erwachsenen Hähnen und Hennen der Rasse LSL (10 Monate) für 48 Stunden das Wasser entzogen. Jede Probe wurde zweimal getestet, im zweiten Filtersatz waren die Proben auf dem Gel zufällig verteilt (Abb. 6-29).
Abb. 6-29: MT-Genexpression im Hypothalamus normo- und dehydrierter Hähne und Hennen. A) Filter hybridisiert mit MT-Sonde. LS = Längenstandard, Bahn 1 + 5 = männlich normohydriert, Bahn 2 + 6 = männlich dehydriert, Bahn 3 + 7 = weiblich normohydriert, Bahn 4 + 8 = weiblich dehydriert. B) Kontrollhybridisierung mit 18S-Sonde.
Zwischen den einzelnen Banden besteht lediglich ein quantitativer Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Tieren. Damit wird das Ergebnis aus der ontogenetischen Untersuchung bestätigt, jetzt mit einer anderen Hühnerlinie (LSL statt LB). Beim Vergleich der Geschlechter ergibt im student’s t-Test ein deutlich signifikanter Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Tieren (p = 0,008).
LS 1 2 3 4 5 6 7 8 LS A
B
Ergebnisse 122
Abb. 6-30: Einfluß von 48 h Dehydrierung auf die hypothalamische MT mRNA-Konzentration; n = 4, Mittelwerte und SEM
Bei Hähnen ist unter 48 h Dehydrierung eine geringe Zunahme der MT mRNA im Hypothalamus festzustellen, jedoch verfehlt er deutlich die Signifikanz (p = 0,38). Bei Hennen ist dagegen ist kein Unterschied in der MT mRNA-Konzentration im Hypothalamus unter Dehydrierung meßbar.(p = 0,91).
0 50 100 150 200 250
normohydriert dehydriert
% MT mRNA (Hahn normohydriert = 100 %)
männlich weiblich
7 Diskussion
Die neurohypophysären Hormone des Huhnes, AVT und MT, sind entwicklungsgeschichtlich sehr alt. Schon bei Cyclostomen wird Isotocin, ein Nonapeptid mit sehr ähnlicher Aminosäure-Sequenz, gebildet. Durch verschiedene Punktmutationen und eine Genduplikation bildeten sich zwei Hormongruppen, die vasopressinerge mit Vasotocin bei Reptilien, Amphibien und Vögeln und Vasopressin bei den Säugetieren, und die oxytocinerge mit Mesotocin und Oxytocin. Während die „klassischen“ physiologischen Funktionen bei den Säugetieren für beide Gruppen schon gut beschrieben sind, liegen bisher bei den anderen Vertebraten fast ausschließlich Daten über AVT vor. Gesicherte Daten und eine Funktion für MT dagegen fehlen. Einerseits liegt das begründet in der großen strukturellen Homologie der beiden Peptide. Beide unterscheiden sich nur in einer einzigen AS: bei AVT steht Arginin an Position 8, bei MT Isoleucin. Das führt dazu, daß Antikörper-basierten Techniken gewisse Grenzen gesetzt sind, da Kreuzreaktionen schwer zu vermeiden sind. Bei Rezeptorstudien kann darüber hinaus auch eine kreuzreaktive Bindung der Hormone nicht ausgeschlossen werden. Andererseits ergaben sich bisher bei ersten Studien der MT-Funktion sehr widersprüchliche Ergebnisse durch unterschiedliche Methoden. Daher ist eine definierte Funktion bis heute unbekannt (s. 2.).
Ein Ziel dieser Arbeit ist es, durch die Charakterisierung einer Gensonde für MT die Möglichkeit für eine spezifische Untersuchung von MT darzustellen. Dazu sollten Eckdaten über die MT-Genexpression erhoben und mit AVT verglichen werden.
Folgende Ergebnisse stehen zusammengefasst zur Diskussion:
- Die beiden cDNA-Sonden für AVT und MT, welche im 3’-Bereich der mRNA binden, sind jeweils spezifisch und zeigen keine Kreuzreaktion.
- MT genexprimierende Neurone sind im Hypothalamus in den Kerngebieten des Nucleus supraopticus, Nucleus paraventricularis, Nucleus dorsolateralis anterior, pars magnocellularis und im Bed nucleus der Stria terminalis, pars magnocellularis lokalisiert.
Diskussion 124
- Die MT-Genexpression ist im Hypothalamus überwiegend im Perikaryon lokalisiert, jedoch gibt es auch in geringem Maße eine axonale und dendritische Expression.
- Im parvocellulären Anteil des BnST gibt es keine Genexpression von MT.
- Es wird mehr AVT mRNA als MT mRNA im Hypothalamus gebildet.
- Die MT-Genexpression nimmt mit dem Alter kontinuierlich zu. Um den Zeitraum der Pubertät herum gibt es einen kurzfristigen leichten Rückgang der mRNA-Bildung, beim adulten Tier werden die höchsten Konzentrationen MT mRNA im Hypothalamus produziert.
- Die einzelnen Kerngebiete sind bereits in der Embryonalphase angelegt und exprimieren mRNA, allerdings in einer geringen Intensität und in wenigen Zellen.
- Es gibt im MT-System keinen Sexdimorphismus im Hypothalamus, der eine Expression in bestimmten Kerngebieten nur bei einem Geschlecht zeigt. Der Geschlechtsunterschied bei adulten Tieren beruht auf einer unterschiedlichen Expressionsleistung der magnozellulären Neurone.
- MT wird auch in peripheren Geweben (außerhalb des ZNS) gebildet.
- MT-Rezeptor mRNA wird in der Niere und in Teilen des weiblichen Reproduktionstraktes gebildet.