Zwar läßt sich bei den Hähnen eine Zunahme der MT-Genexpression während Dehydrierung feststellen, dieser Effekt ist jedoch nicht signifikant. Damit ist die Regulation der hypothalamischen MT mRNA-Menge scheinbar nicht oder nur gering beteiligt an der physiologischen Reaktion auf eine osmotische Stimulation durch Dehydrierung. Vom Säugetier ist bekannt, daß OT auf osmotische Stimulation reagieren kann, und damit auch die oxytocinerge Hormonfamilie an der Osmoregulation beteiligt ist (VAN TOL et al. 1987). Im Vergleich zu AVP ist die Zunahme an OT mRNA aber geringer (LEMOULLEC et al. 1997).
OT, aber auch MT wurden auch nach Streß (Immobilisation) vermehrt exprimiert (HIGUCHI
et al. 1990; BATHGATE u. SERNIA 1995). Der Anstieg an OT mRNA im Hypothalamus kann also auch durch den Streß der Dehydrierung entstehen und muß nicht durch die physiologischen Veränderungen der Dehydratation ausgelöst werden. Darauf deuten auch Versuche hin, die nur einen ca. zweifachen Anstieg an OT mRNA im Hypothalamus nach zweiwöchiger Verabreichung hyperosmolaren Trinkwassers feststellen können (VAN TOL et al. 1987). Unter chronischem Streß wie diesem kann es zu einer falsch interpretierten Korrelation von Stimulus und Reaktion kommen. Die physiologische Relevanz solcher Versuche muß daher genauer untersucht werden. Dazu muß z. B. ein Verlauf der Genexpression über eine bestimmte Dauer der Dehydrierung bestimmt werden, um den Beginn und die Steilheit der Zunahme der Genexpression bestimmen zu können.
Abschließend läßt sich feststellen, daß der Verlauf der Genexpression während der Ontogenese von AVT und MT auf eine physiologische Funktion beider Hormone in der pränatalen oder perinatalen Phase hindeutet. Beide Hormone werden im letzten Drittel der embryonalen Phase gebildet, zumindest AVT auch schon an Tag 6 der Inkubation. Genauere Aussagen über eine physiologische Funktion sind nur möglich durch Untersuchung von Tieren, bei denen diese Gene defekt sind oder ausgeschaltet werden. Aus dem Verlauf der embryonalen Entwicklung kann dann eine Funktion der Gene während der Ontogenese bestimmt werden. Postnatal ist deutlich mehr AVT als MT mRNA im Hypothalamus lokalisiert. Pränatal dagegen ist der Gehalt noch deutlich ähnlicher. Für AVP ist eine Steuerung der neuronalen Entwicklung bereits nachgewiesen. Daher ist zu vermuten, daß auch AVT einen ähnlichen Effekt haben könnte, bei der relativ ähnlichen mRNA-Konzentration von MT kann ein entwicklungsfördernder Einfluß von MT durchaus möglich sein. Beide Gene werden unterschiedlich reguliert, vergleicht man die Stärke der Genexpression während der Entwicklung und die Antwort auf physiologische Stimuli. MT wird nicht durch eine Aktivierung des AVT-Systems mit aufreguliert. Trotz der nur mäßigen bis fehlenden Reaktion von MT im Hypothalamus als Antwort auf Dehydrierung scheint MT in die Osmoregulation involviert zu sein. Allerdings erfolgt die Wirkung eher lokal auf parakriner Ebene in der Niere. Der genaue Aktivierungsmechanismus bleibt allerdings noch offen. Auch an der
Diskussion 144
Eiablage kann MT beteiligt sein, wie die PCR andeutet mit MT-Rezeptor Genexpression in einzelnen Abschnitten des Eileiters.
In Zukunft muß daher Wert gelegt werden auf eine weitergehende Klonierung des MT-Rezeptors (wichtig sind intron-übergreifende Sequenzen) mit der Möglichkeit der Lokalisierung der Rezeptoren in den Zielgeweben. Es gibt in der Niere und im Ovidukt bereits Untersuchungen über eine dort lokalisierte MT-Rezeptor-Synthese.
Außerdem soll eine Untersuchung der diurnalen Rhythmik der AVT und MT Genexpression erfolgen, zusammen mit dem Einfluß von typischen Genen für die tageszeitliche Steuerung physiologischer Reaktionen.
8 Zusammenfassung
Die Nonapeptide Arginin-Vasotocin (AVT) und Mesotocin (MT) sind die neurohypophysären Hormone des Vogels. Während bei den analogen Hormonen des Säugetiers, Arginin-Vasopressin (AVP) und Oxytocin (OT), jedes einer physiologischen Funktion zugeordnet werden kann, ist beim Vogel bisher nur die antidiuretische Funktion des AVT und die Stimulation der Uteruskontraktion bei der Oviposition gesichert. Hingegen fehlen für MT bisher gesicherte Ergebnisse über eine physiologische Bedeutung.
Die neurohypophysären Hormone werden in Neuronen des Hypothalamus gebildet und gelangen über axonalen Transport in die Neurohypophyse. Dort erfolgt die Freisetzung in das Blut. Neben dieser klassischen endokrinen Funktionsweise sind für die Nonapeptide auch neuromodulatorische Wirkungen innerhalb des ZNS beschrieben.
In dieser Arbeit sollten mit Hilfe einer neu entwickelten Gensonde für Mesotocin verschiedene physiologische Parameter auf ihre Beeinflussung der MT-Genexpression untersucht und das hypophysäre MT mRNA-System mit dem von AVT verglichen werden.
Periphere Gewebe wurden auf das Vorkommen von MT mRNA und MT-Rezeptor mRNA untersucht. Für letztere lag ein kloniertes Teilstück des MT-Rezeptorgens vor.
Die verwendeten Sonden für AVT und MT mRNA binden beide im 3’-Bereich der mRNA.
Die MT-Sonde ist in Northern Blot und ISH spezifisch für MT mRNA und zeigt keine Kreuzreaktion mit der AVT mRNA. Im Northern Blot ist ein ca. 600 bp großes Fragment darstellbar. Bei der ISH liegen die Signale eindeutig im Cytoplasma der Neurone und sind durch RNase A-Behandlung zu eliminieren. Die morphologische Untersuchung der MT mRNA-Expression zeigt genexprimierende Neurone in den hypothalamischen Kerngebieten des SON und PVN sowie den extrahypothalamischen Kerngebieten BnST, pars magnocellularis, und DLA, pars magnocellularis. Nur magnozelluläre Neuronen bilden MT mRNA. Bei adulten Tieren ist morphologisch, im Gegensatz zum AVT-System, kein Sexdimorphismus nachweisbar. Bereits an E14 sind alle MT exprimierenden Kerngebiete des Hypothalamus positiv für MT mRNA. Es ändern sich im Laufe der Ontogenese Zahl und Größe der exprimierenden Neuronen. Im Vergleich zum AVT-System ist die rostro-caudale und laterale Ausbreitung des MT-Systems kleiner. Im Northern Blot ist im Verlauf der
Zusammenfassung 146
Ontogenese eine kontinuierliche Zunahme der Genexpression festzustellen, ohne daß das Alter einen besonderen Einfluß auf die Transkriptionsrate zu haben scheint. Bei adulten Tieren zeigt sich quantitativ ein Sexdimorphismus bei der MT-Genexpression. Dieser beruht nach Analyse einer quantitativen ISH auf einer verstärkten Expressionsleistung der Zellen und nicht auf einer unterschiedlichen Zellzahl. Ein Vergleich der AVT- mit der MT- Genexpression zeigt im Verlauf der Ontogenese einen sehr ähnlichen Verlauf, allerdings ist in allen postnatalen Lebensstadien signifikant mehr AVT mRNA im Hypothalamus lokalisiert als MT mRNA. Ebenso wie bei AVT kann auch bei MT eine axonale und dendritische Lokalisation von mRNA gezeigt werden. Das ermöglicht die sehr schnelle Bereitstellung von mRNA für eine Translation am Ort der Sekretion.
Eine zweitägige Dehydratation hat keinen Einfluß auf die hypothalamische MT mRNA-Konzentration von weiblichen Tieren. Bei Hähnen ist ein Anstieg unter Wasserentzug sichtbar, dieser ist jedoch nicht signifikant. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes ist bei AVT und MT mRNA nur geringfügig vergrößert. Dagegen tritt mit zunehmendem Alter eine Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes der AVT mRNA auf. Außerhalb des ZNS kann MT mRNA mit der RT-PCR in der Niere identifiziert werden. Die Zahl der exprimierenden Zellen ist durch Dehydratation aber scheinbar unverändert. Außer MT mRNA kann auch MT-Rezeptor mRNA in der Niere und in verschiedenen Bereichen des Reproduktionstraktes (Ovar, Infundibulum, Uterus, Vagina) nachgewiesen werden. Eine Beteiligung von MT an der Osmoregulation, sowohl über einen systemischen als auch einen lokalen Wirkmechanismus ist anzunehmen. Die Identifizierung von MT-Rezeptor im Reproduktionstrakt weist auf eine Beteiligung an der Oviposition hin. Ähnlich wie AVT kann also auch MT beim Vogel in zwei verschiedenen physiologischen Regelkreisen (Osmoregulation und Reproduktion) involviert sein.
Mesotocin erfüllt somit beim Huhn die klassischen neurohypophysären Hormonwirkungen, unterstützt durch eine lokale Synthese in der Niere, ohne wie AVT über parvozelluläre Hormonsynthese an Verhaltensregulationen im BnST beteiligt zu sein.
9 Summary
The avian nonapeptide hormones arginine-vasotocin (AVT) and mesotocin (MT) are the homologues of the mammalian vasopressin (AVP) and oxytocin (OT). While there is a clearly defined function for the mammalian hormones in osmoregulation (AVP) and reproduction (OT) in avian species AVT is involved in both regulation of water balance and oviposition.
No information is available about a clear physiological function for MT.
The neurohypophysial peptides are synthesized in hypothalamic neurons and they are transported axonally to the neurohypophysis where they are released into the blood. Beside this classical endocrine also neuromodulatory functions of the nonapeptides within the CNS are described.
In this thesis several physiological parameters were investigated by using a newly developed MT cDNA probe in order to test their effect on MT gene expression. The hypothalamic MT system was compared with the well described AVT system. Additionally peripheral tissues were investigated for their expression of MT and MT receptor gene. For the latter a gene probe containing a part of the receptor gene was available.
Both cDNA probes for AVT and MT detect the 3’ end of the peptide mRNA. In the Northern blot and ISH the MT probe is specific without any cross reactivity to the AVT mRNA. In the Northern blot the probe binds to a mRNA fragment of about 600 bp. The signals are localized in the cytoplasm of the neurons as shown by ISH and could be abolished by RNase A treatment of the tissue sections before hybridization. The morphological investigations of MT gene expression reveals MT mRNA expressing neurons in the hypothalamic SON and PVN and in the extrahypothalamic magnocellular parts of DLAmc and BnST. Only magnocellular neurons were found to produce MT mRNA. In adult animals no sex dimorphism was detectable at the level of the number of gene expressing neurons, in contrast to previous findings in the AVT system. Around day 14 of embryonic development all MT gene expressing nuclei are positive for MT mRNA. Compared with the AVT system the rostro-caudal and lateral extensions of the neurons are smaller in the MT system. In the Northern blot a continuously increasing amount of brain MT mRNA is detectable. No age dependent gene expression was obtained. Moreover, in adult animals a sex dimorphism exists in the MT
Summary 148
system. A quantitative ISH reveals higher transcriptional activity within magnocellular neurons of PVN and SON in males compared with females. A comparison of AVT and MT gene expression shows a similar pattern throughout development, but in all postnatal stages AVT mRNA is significantly higher expressed than MT mRNA. Like in the AVT system MT mRNA is also detectable in axon and dendrites. Hence a rapid local translation and secretion is possible.
The hypothalamic mRNA content in female chickens was not influenced by water deprivation. In males there was a slight increase in gene transcription, but a significant level was not reached. The length of the poly(A) tails of AVT and MT mRNA were only little changed by dehydration. However, in adult animals the AVT poly(A) tail was increased compared with embryonic stages.
Outside of the CNS MT mRNA could be identified in the kidney by RT-PCR. Dehydration doesn’t seem to influence the number of expressing cells. Also MT receptor mRNA could be detected in the kidney, and it was also apparent in parts of the reproductive system, namely the ovary, infundibulum, uterus and vagina. A function of MT in osmoregulation could be transmitted via systemic and/or local influences. The identification of MT receptor mRNA in reproductive tissues also indicates a physiological role of this peptide in oviposition.
Like AVT in birds MT seems to be involved in both physiological circuits of osmoregulation and reproduction.
Thus, Mesotocin might be involved in the classical functions of neurohypophysial hormones also in birds, supported by a local synthesis in the kidney. There might be no function of MT on behaviour regulation in the BnST like it has been shown for the AVT system.
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